Summary

레이저를 이용한 가축 접합체의 세포질 미세 주입을

Published: October 05, 2016
doi:

Summary

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

Abstract

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

Introduction

1 셀 배아의 세포질 미세 주입은 매우 강력한 기술이다. 또, 예를 들면, 유전자 기능을 연구 나 유전자 편집 동물을 생성하는 유전자가 녹아웃을 제조 배아에 어떤 솔루션을 제공에 사용될 수있다. 대부분의 농업 관련 농장 동물 접합자는 세포질이 불투명 어두운 만드는 매우 높은 지방산 조성. 또한 상당히 탄성 원형질막 (PM)을 갖는다. 이러한 특성은 설치류 종의 도전과 종종 부정확에 사용되는 기존의 전핵 / 세포질 주입을 사용하여 미세 주입을합니다.

이를 수행하기가 쉽습니다 또한 더 높은 생존 능력이 결과, 주입 된 배아에 덜 손상이 발생하기 때문에 세포질 마이크로 인젝션은 전핵 미세 주입을 통해 이점이있다. 이 프로토콜의 전반적인 목표는 농장 동물 접합체의 세포질에 솔루션을 제공하기위한 성공적인 방법을 설명하는 것입니다. 수행 할 수 있어야합니다가축 배아 고효율 세포질 마이크로 인젝션은 레이저는 평활 말단 유리 바늘이 미세 주입에 사용되는 투명대 (ZP) 다음에 구멍을 생성하는데 사용된다. 이 전략은 주입하는 동안 배아에 각인 기계적인 손상을 감소하는 것을 목표로하고있다. 그리고, 주사 바늘 내부 세포질 콘텐츠 흡인 용액 배아의 세포질 내로 전달되는 것을 보장 PM 효율적 자신감 파괴 할 수있다.

이 기술은 이미 성공적 접합체 세포질 3,4-으로 siRNA를 전달하고 클러스터 정기적 interspaced 짧은 상동 반복 (CRISPR) / CRISPR 연관된 시스템 (9) (Cas9) 시스템 (5)을 사용하여 돌연변이를 생성 소 태아에서 사용되어왔다. 또한 소 운 동봉 된 난 모세포 (6)를 주입하기 (약간의 수정과)에 적합하다. 여기서, 우리는 우리의 염료를 제공 주입 프로토콜을 설명하는 데 어떤 주입에 적용 할 수있다수정란 내로 IRED 용액 및이 기술을 사용하여 최소한의 용해가 발생 초기 배아 발달에 영향을주지 않는 것으로 나타났다.

Protocol

1. 마이크로 피펫 생산 사출 마이크로 피펫 보로 실리케이트 유리 모세관 (1.0 mm, 내경 (ID) : 외경 (OD) 0.75 mm) 배치 마이크로 피펫 풀러에서 (오른쪽과 왼쪽 모세관 홀더의 중심을)하고 잠급니다. 그것은 긴 캐처 얇은 팁을 초래하므로 유리 모세관을 당겨 적절한 프로그램을 사용하십시오. (예 : 열 : 825; 당겨 : 30; 속도 : 120; 시간 : 200; 압력 : 500). 조심스럽게 장치에서 뽑아 피펫을 제거하고 수평 위치에 microforge에 놓습니다. 인출 된 피펫과 초점에 그 유리 구슬과 microforge 히터 필라멘트를 가져옵니다. 원하는 두께를 측정하고 히터 필라멘트 대상 내경 (5 μm의)에 도달 할 때까지 수평으로 피펫을 이동 접안 레티클을 사용합니다. 약 45 %의 열을 조절하고 필라멘트에 닿을 수 있도록 부드럽게 아래로 피펫을 가지고. 잠시 히터를 활성화합니다. 이 w병 약간 필라멘트에 접착되도록 피펫을 용융 및 냉각시에, 피펫 직선 절단을 생성하는 접촉 지점에서 중단된다. 참고 : 너무 높은 온도가 피펫 벤드를 만들 것입니다 따라서 직선 절단 할 수 없습니다 너무 낮은 온도가 피펫 (그림 1A)를 용융하기에 충분하지 않을 것이기 때문에 적절한 온도를 설정하면이 단계의 핵심이다. 히터 필라멘트에서 약 10 μm의 멀리 위치하여 피펫 팁 근처 대략 30 ° 각도를 확인합니다. 60 %의 온도를 상기 히터를 작동. 참고 :이 필라멘트를 통해 피펫을 구부 것입니다. 이 각도는 인젝터 (도 1b)에 장착 될 때 바늘의 선단이 주입 판 표면에 평행하도록 요구된다. 그들은 매우 선명하고 깨지기 쉬운만큼주의를 미세 주입 피펫을 처리합니다. 개최 마이크로 피펫 borosilic 배치(: 1.0 mm, ID : OD 0.75 mm) 유리 모세관 먹었다 (오른쪽과 왼쪽 모세관 홀더의 중앙에) 마이크로 피펫 풀러의를하고 잠급니다. 이 긴 경우에도 테이퍼 및 병렬 벽 얇은 팁을 초래하므로 유리 모세관을 당겨 적절한 프로그램을 사용하여 (: 열 : 예 815; 당겨 : 20; 속도를 : 140; 시간 : 175; 압력 : 200). 조심스럽게 끌어 당기는 장치에서 뽑아 피펫을 제거하고 수평 위치에 microforge 홀더에 놓습니다. 히터 필라멘트 및 피펫에 초점을 조정합니다. 피펫 직경을 측정하고 필라멘트를 통해 직경 180 μm의에 도달 할 때까지 피펫을 이동 접안 레티클을 사용합니다. 지정된 크기에서, 다이아몬드 팁 펜으로 유리 모세관을 표시 한 다음 부드럽게 유리를 깰 수있는 뽑아 끝에 누릅니다. 이 직선 절단 (그림 1C)가 발생한다. 필라멘트에 가까운 그것의 끝이 수직 위치로 피펫을 이동합니다. 온도를 설정 60 %에 microforge의. 화재 폴란드어는 40 μm의의 ID에 도달 할 때까지 표준 기술 7을 사용 피펫의 팁. 아이디 (그림 1D)를 확인하기 위해 접안 레티클을 사용합니다. 피펫에 각도를 확인합니다. 약 10 μm의 거리에 필라멘트와 거리의 끝에서 5mm에서 다시 수평 위치로 피펫을 가져옵니다. 약 60 %로 온도를 설정하고 필라멘트를 통해 피펫이 구부러 히터를 활성화합니다. (30 O의) 소정의 각도에 도달 할 때까지 가열을 계속한다. 각도 시각 (그림 1E)에서 확인하십시오. 주 : 피펫은 일반적으로 사출 접시의 바닥에 대해 60 (O)의 대략적인 각도에서 마이크로 인젝터에 장착된다. 그것의 중간 평면에서 배아의 정확한 주입에 필요한 접시의 바닥에 평행하도록 피펫의 선단은 절곡되어있다. 제작 "> 2. 미세 조작기 설치 microinjectors가 완전히 기름을 적재되는 시스템에 기포가 없는지합니다 (마이크로 인젝터에 기포가 주입의 미세 제어를 방지) 확인합니다. 미세 조작기는 중앙 위치에 있는지 확인하십시오. 이는 피펫의 이동의 넓은 범위를 허용한다. 왼쪽 micromanipulator에 홀더에 들고 피펫 오른쪽 미세 조작 홀더에 주입 피펫을 삽입합니다. 오일이 모세관 현상에 의해 피펫에 입력하고 시스템이 마이크로 인젝터 컨트롤을 사용하여 피펫 내부 위아래로 오일을 이동하여 제대로 작동하는지 확인할 수 있습니다. 주 : 바늘의 내부에는 오일의 움직임이없는 경우, 막힘이있을 수도있다. 이 경우, 새로운 니들을 사용한다. 보기의 현미경의 필드의 중심에 피펫을 가지고하는 미세 조작기 컨트롤을 사용합니다. 4 배의 배율을 사용하여 마이크로 피펫 팁 (올바른 각도로 페이지 있는지 확인접시의 바닥)에 arallel. 참고 : 바늘의 올바른 설치가 성공적으로 주입 및 결과의 일관성을 위해 중요하다. 제조자의 설명서 교정 다음 레이저 시스템 교정. 사출 접시 3. 준비 (그림 2) 100mm의 페트리 접시 뚜껑의 중앙에 20 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 가온 (37 ° C) SOF-HEPES (재료 부분에 자세히 조성물)의 50 μL를 떨어 놓는다. 용액 2 μL 드롭 주입 드롭에 가까운 주입 할 – 1이 놓습니다. 배아는 RT 이하로 냉각하지 않았는지 확인합니다. 참고 :이 프로토콜에서 우리는 주사 부위를 시각화하고 나중에 추적 할 수 있도록 주입 용액에 덱스 트란 – 붉은 염료를 추가합니다. 미네랄 오일을 약 10 ㎖을 사용하여 사출 접시 방울 커버. 거꾸로 현미경의 무대에 주입 접시를 놓고 주사위를 가지고분사 방울로 ettes. 바늘 드롭 내부에 초점이 있는지 확인합니다. micromanipulator에 컨트롤을 사용하여 필요에 따라 자신의 높이를 조정합니다. 사출 강하의 상측 – (20 시간 후 수정 (HPF) (17)) 30 접합자 – 마이크로 디스펜서를 사용하여 약 20로드. 사출 강하 배아의 개수가 사람을 주입 할 수있는 속도에 의해 결정되도록 상온에서 주입을 수행한다. 30 분에 주입 할 수있는 것보다 더 많은 배아를 넣지 마십시오. 마이크로 디스펜서에 배아를로드하려면 완전히 플런저를 우울하게하고 배아를 포함하는 용액에 끝을 담가. 터치 배아 유리 모세관의 선단 (시 하나)로 촬상 천천히 플런저 각각의 배아 모세관 체결 해제된다. 모든 배아가 선택됩니다 또는 마이크로 디스펜서의 용량이 가득 찰 때까지이 과정을 반복합니다. ,로드 된 배아를 해제 전체 볼륨의 공동 때까지 부드럽게 플런저를 우울하게하려면배아를 ntaining하는 모세관에서 해제된다. 4. 미세 주입 4 배의 대물 렌즈를 사용하여 부압 (흡인)을인가하여 주입 피펫으로 주입 할 수있는 용액을로드. 3 접합자 – 2를 주입 할 수있는 충분한 솔루션을로드합니다. 그런 다음 주입 드롭으로 이동합니다. 끝이 접합체에 가까운 얻을 수 있도록 주입 드롭 내에서 유지 피펫을 이동합니다. 수정란은 20 배 목표로 유지 피펫과 변화에 고정되는 있도록 유지 마이크로 인젝터와 부압 (흡인)을 적용합니다. 수정란이 유지 피펫에 부착되면, 조심스럽게 분리하지 않고 주위의 배아를 이동 주입 피펫을 사용하여 품질을 확인합니다. 좋은 품질의 접합자는 두 극성 몸이 (하나만 볼 가끔 있지만)과 균일 한 세포질한다. 이상 접합자 (그림 3A)를 주입하지 마십시오. 필요한 경우, 적절한 주입 배아 재배치위치. 좋은 위치 결정되는 ZP와 PM 사이에 약간의 공간이 때문에 PM이 레이저에 의해 손상되지 않는다는 것이다. 주입 피펫은 부드럽게 주사 부위의 접합자를 터치하여 배아의 중간면에 위치되어 있는지 확인합니다. 그것의 중간면에없는 경우, 바늘 배아 대신 천자 회전하게하는 경향이있다. 필요에 따라 주입 피펫의 높이를 조정한다. 레이저 (그림 3B)를 사용하여 ZP에 구멍을 만듭니다. 레이저의 소프트웨어 놓고 구멍 (배아가 유지 피펫에 부착되는 곳의 반대측에) 될 것이다 ZP되는 레이저 레티클 사용. 화재 버튼 레이저 제어 창 클릭을 사용. 구멍의 크기가 PM에 손상을주지 않고 통과 바늘 용 ZP에 개구를 생성하기에 충분히 큰지 확인 (예 : 0.662 msec의 펄스 폭 / 6.9 ㎛의 구멍 크기). 주사 바늘을 통과상기 ZP 구멍을 통해 PM과의 접촉을 만든다. 바늘이 배아 (그림 3C)에 방법의 ¾ 때까지 앞으로 피펫을 눌러 계속합니다. 이것이 일관 주입량을 제어 할 수있는 바와 같이, 솔루션 오일 계면에서의 메 니스 커스의 위치를 ​​관찰한다. PM과 세포질이 주사 바늘로 흡입 할 것을 발생합니다 주입 피펫에 부압 (흡인)을 적용합니다. 바늘로 세포질의 움직임이 가속 될 때까지 또는 주사 용액과 함께 혼합 세포질 함량을 알 수있는 경우에 계속. 다음은 PM (그림 3D)의 파손을 나타냅니다. 용액 유 계면에서의 메 니스 커스가 시작점 과거 1 접합체의 직경에 상당하는 고급까지 양압 (주입)을인가하여 접합체의 세포질 내로 용액 다음 세포질 콘텐츠를 주입한다. 참고 : 우리의 조건이 파트 :변위량 주입 솔루션 (그림 3E)의 약 7 와줘. 4 배 목표로 변경하고 주입 드롭의 하부에 주입 된 배아 / s로 이동합니다. 유지 마이크로 인젝터에 양압을 적용하여 배아를 놓습니다. 분사 / 비 – 주입 된 배아를 추적하고 효율적으로 작업 할 수 있도록 상측의 비 주입 배아 드롭의 하측에 삽입 된 것들을 유지한다. 5. 배아 복구 및 사출 결과 미리 예열 SOF-HEPES로 새로운 접시에 약 200 ㎕를 3 방울을 확인합니다. 마이크로 디스펜서 (위의 설명 참조)를 사용하여 주입 된 배아를 수집합니다. 3 SOF-HEPES를 통해 방울을 이동하여 주입 된 배아를 씻으십시오. 미세 주입 중에 용해 배아를 계산하고이를 폐기합니다. 첫 번째 전체 ZP을 작성, 반투명 나타납니다 보낸 용해 접합자는 그대로 하나 쉽게 구별 할 수 있으며, 일반적으로 세포질을 가지고 참고 :배아의 외부로 누출되는 콘텐츠. 선택적으로, 형광 현미경을 이용하여 미세 주입 효율을 확인합니다. 자외선 노출이 후속 개발에 영향을 미칠 수있는 배아의 손상을 유도 할 수 있음을 유의하십시오. 38.5 ℃에서의 미네랄 오일 아래 4 ㎎ / ㎖ 소 혈청 알부민 (BSA)으로 보충 칼륨 단면 최적화 배지 50㎕의 방울 (KSOM) 25 주입 배아 배양 기, 포화 5 % 공기 중의 CO 2, 습도. 이일 주사 후 5 % FBS와 문화 매체를 보충합니다. 주사 후 배반포 (BL) 요금 7 일을 확인합니다. 배반포 배아 / 그 드롭 배양 된 배아의 총 수의 총 수와 BL 속도를 계산합니다.

Representative Results

레이저를 이용한 세포질 미세 주입은 가축 접합체의 세포질에 솔루션을 제공하는 강력하고 신뢰할 수있는 프로토콜입니다. 3 전 및 사출뿐만 아니라 기술의 전반적인 개요 후 접합자의 일반적인 개요를 보여줍니다. 덱스 트란 레드 주입 및 주입 효율 및 정확도를 추적 사이트 있도록 주입 용액으로서 사용된다. 용액의 성공적인 전송은 염료가 균…

Discussion

접합체의 미세 주입은 포유 동물의 배아에 솔루션을 도입하기위한 잘 정립 된 방법이다. 종 및 실험 목적에 따라 일부 변형이 기술은 광범위하게 사용될 수있다. 우리는 평활 말단 마이크로 피펫의 입구를 돕기 위해 레이저를 사용하여 세포질 마이크로 인젝션을 수행하는 방법을 보여준다. (예 : 소, 양, 돼지 등) 일부 가축 종의 접합자는 배아의 내부에 한 번 주입 피펫의 시각화를 방해, 어두운 ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Work related to this technique is supported by NIH/NICHD RO1 HD070044 and USDA/NIFA Hatch projects W-3171 and W-2112.

Materials

Micropipette puller Sutter Instrument P-97
Glass capillary Sutter instruments B100-75-10 These capillaries are used for making the holding and injecting pipettes. Any thick/standard wall borosilicate tubing without filament can be used.
Microforge Narishige MF-9 Equipped with 10X magnification lense.
Micromanipulator Nikon/ Narishige NT88-V3
Inverted microscope Nikon TE2000-U Equipped with 4x, 20x lenses and with a laser system.
Laser Research Instruments 7-47-500 Saturn 5 Active laser.
Microdispenser Drummond 3-000-105 The microdispenser is used to move the embryos. A p10 pipette can also be used but loading as minimal volume as possible.
60mm culture dish Corning 430166 Use the lid of the dish to make the injection plate since they have lower walls and will make positioning and moving of the micropipettes with the micromanipulator easier. 
35mm culture dish Corning 430165 These dishes are used for culturing the embryos in 50μl drops covered with mineral oil. Alternatively, a 4 well dish can also be used. Regardless of the dish chosen to culture the embryos, they always have to be equilibrated in the incubator for at least 4 hours prior to transfering the embryos to them.
Incubator Sanyo MCO-19AIC Any incubator that can be set to 38.5°C 5% CO2 conditions can be used.
Stereomicroscope Nikon SMZ800 Used for visualizing the embryos in the culture drops and during washes. Any stereomicroscope with a 10x magnification can be used.
Control Unit HT Minitube 12055/0400 Heating system attached to the stereomicroscope.
Heated Microscope Stage Minitube 12055/0003 Heating system attached to the stereomicroscope.
Dextran-Red Thermo Scientific D1828 A sterile 10mg/ml solution is used to inject.
Mineral Oil sigma M8410 Keep the mineral oil at room temperature and  protected from light using foil paper.
KSOMaa Evolve Bovine Zenit ZEBV-100 Supplemented with 4mg/ml BSA. KSOM plates for embryo culture should be equilibrated in an incubator for at least 4 hours before use.
FBS Gemini-Bio 100-525 Use a stem-cell qualified FBS.
Zygotes Zygotes are injected 17-20 hpf and can be in-vitro- or in-vivo-derived.
NaCl Sigma S5886 Final concentration: 107.7mM. Component of SOF-HEPES medium.
KCl Sigma P5405 Final concentration: 7.16mM. Component of SOF-HEPES medium.
KH2PO4 Sigma P5655 Final concentration: 1.19mM. Component of SOF-HEPES medium.
MgCL2 6H2O Sigma M2393 Final concentration: 0.49mM. Component of SOF-HEPES medium.
Sodium DL-lactate Sigma L4263 Final concentration: 5.3mM. Component of SOF-HEPES medium.
CaCl2-2H2O  Sigma C7902 Final concentration: 1.71mM. Component of SOF-HEPES medium.
D-(−)-Fructose  Sigma F3510 Final concentration: 0.5mM. Component of SOF-HEPES medium.
HEPES  Sigma H4034 Final concentration: 21mM. Component of SOF-HEPES medium.
MEM-NEAA Sigma M7145 Final concentration: 1X. Component of SOF-HEPES medium.
BME-EAA Sigma B6766 Final concentration: 1X. Component of SOF-HEPES medium.
NaHCO3 Sigma S5761 Final concentration: 4mM. Component of SOF-HEPES medium.
Sodium pyruvate Sigma P4562 Final concentration: 0.33mM. Component of SOF-HEPES medium.
Glutamax Gibco 35050 Final concentration: 1mM. Component of SOF-HEPES medium.
BSA Sigma A-3311 Final concentration: 1mg/ml. Component of SOF-HEPES medium.
Gentamicin Sigma G-1397 Final concentration: 5μg/ml. Component of SOF-HEPES medium.
Water for embryo transfer Sigma W1503 Component of SOF-HEPES medium.
SOF-HEPES medium Made in the lab pH 7.3-7.4, 280±10 mOs. Filter sterilized through a 22μm filter can be stored in the fridge at 4° C for 1 month. Warm in 37 °C water bath before use.

References

  1. McEvoy, T., Coull, G., Broadbent, P., Hutchinson, J., Speake, B. Fatty acid composition of lipids in immature cattle, pig and sheep oocytes with intact zona pellucida. J Reprod Fertil. 118 (1), 163-170 (2000).
  2. Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (13), 4438-4442 (1985).
  3. Ross, P. J., et al. Parthenogenetic activation of bovine oocytes using bovine and murine phospholipase C zeta. BMC Dev Biol. 8 (1), (2008).
  4. Canovas, J., Cibelli, J. B., Ross, P. J. Jumonji domain-containing protein 3 regulates histone 3 lysine 27 methylation during bovine preimplantation development. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (7), 2400-2405 (2012).
  5. Bogliotti, Y. S., et al. 4 Developmental outcomes and effiency of two CRISPR/Cas9 microinjection methods in bovine zygotes. Reprod Fertil Dev. 27 (1), 94-94 (2015).
  6. Bakhtari, A., Ross, P. J. DPPA3 prevents cytosine hydroxymethylation of the maternal pronucleus and is required for normal development in bovine embryos. Epigenetics. 9 (9), 1271-1279 (2014).
  7. Yaul, M., Bhatti, R., Lawrence, S. Evaluating the process of polishing borosilicate glass capillaries used for fabrication of in-vitro fertilization (iVF) micro-pipettes. Biomed Microdevices. 10 (1), 123-128 (2008).
  8. Sutter Instrument. . Pipette Cookbook 2015 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers. , (2015).
  9. Sutter Instrument. . P-97 Flaming/BrownTM Micropipette Puller Operation Manual Rev. 2.30 – DOM (20140825). , (2014).
  10. Cibelli, J. B., Lanza, R. P., Campbell, K. H. S., West, M. D. . Principles of cloning. , (2002).
  11. Wang, B., et al. Expression of a reporter gene after microinjection of mammalian artificial chromosomes into pronuclei of bovine zygotes. Mol Reprod Dev. 60 (4), 433-438 (2001).

Play Video

Cite This Article
Bogliotti, Y. S., Vilarino, M., Ross, P. J. Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes. J. Vis. Exp. (116), e54465, doi:10.3791/54465 (2016).

View Video