레이저를 이용한 가축 접합체의 세포질 미세 주입을

요약

이 프로토콜은 농장 동물 접합자에서 세포질 미세주입을 수행하는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 녹아웃 동물을 생성하기 위한 게놈 편집 도구와 같은 단일 세포 배아에 모든 솔루션을 전달하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

단세포 배아로의 세포질 미세주입은 매우 강력한 기술입니다. 예를 들어, 성체 유기체의 모든 세포에 존재할 유전자 변형을 생성할 수 있는 게놈 편집 도구를 제공할 수 있습니다. 또한 siRNA, mRNA 또는 차단 항체를 전달하여 착상 전 배아의 유전자 기능을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 설치류에 사용되는 배아를 미세주입하는 기존의 기술은 배아로 진행될 때 원형질막을 직접 관통하는 매우 얇은 마이크로피펫으로 구성됩니다. 이 기술을 가축 동물에 적용하면 일반적으로 효율성이 떨어집니다. 이는 주로 생쥐 및 쥐와 달리 소, 양 및 돼지 접합자는 매우 어두운 세포질과 매우 탄력적인 원형질막을 가지고 있어 원형질막의 주입 및 침투 시 시각화를 달성하기 어렵기 때문입니다. 이 프로토콜에서는 양과 돼지 배아에도 성공적인 것으로 입증된 소 접합자의 세포질로 용액을 전달하기 위한 적절한 미세주입 방법을 설명합니다. 먼저 레이저를 사용하여 투명대에 구멍을 만듭니다. 그런 다음 뭉툭한 끝의 유리 마이크로피펫을 구멍을 통해 삽입하고 바늘 끝이 배아 안으로 약 3/4에 도달할 때까지 전진시킵니다. 그런 다음, 원형질막은 바늘 내부의 세포질 함량 흡인에 의해 파괴됩니다. 마지막으로, 흡인된 세포질 함량과 관심 용액을 배아 세포질에 다시 주입합니다. 이 프로토콜은 100% 효율, 최소 용해 및 정상적인 배반포 발달 속도로 소 및 양 접합자에 다양한 용액을 전달하는 데 성공적으로 사용되었습니다.

서론

1 셀 배아의 세포질 미세 주입은 매우 강력한 기술이다. 또, 예를 들면, 유전자 기능을 연구 나 유전자 편집 동물을 생성하는 유전자가 녹아웃을 제조 배아에 어떤 솔루션을 제공에 사용될 수있다. 대부분의 농업 관련 농장 동물 접합자는 세포질이 불투명 ^한 어두운 만드는 매우 높은 지방산 조성. 또한 상당히 탄성 원형질막 (PM)을 갖는다. 이러한 특성은 설치류 종의 도전과 종종 부정확에 사용되는 기존의 전핵 / 세포질 주입을 사용하여 미세 주입을합니다.

이를 수행하기가 쉽습니다 또한 더 높은 생존 ^능력이 결과, 주입 된 배아에 덜 손상이 발생하기 때문에 세포질 마이크로 인젝션은 전핵 미세 주입을 통해 이점이있다. 이 프로토콜의 전반적인 목표는 농장 동물 접합체의 세포질에 솔루션을 제공하기위한 성공적인 방법을 설명하는 것입니다. 수행 할 수 있어야합니다가축 배아 고효율 세포질 마이크로 인젝션은 레이저는 평활 말단 유리 바늘이 미세 주입에 사용되는 투명대 (ZP) 다음에 구멍을 생성하는데 사용된다. 이 전략은 주입하는 동안 배아에 각인 기계적인 손상을 감소하는 것을 목표로하고있다. 그리고, 주사 바늘 내부 세포질 콘텐츠 흡인 용액 배아의 세포질 내로 전달되는 것을 보장 PM 효율적 자신감 파괴 할 수있다.....

프로토콜

1. 마이크로 피펫 생산

1. 사출 마이크로 피펫
   1. 보로 실리케이트 유리 모세관 (1.0 mm, 내경 (ID) : 외경 (OD) 0.75 mm) 배치 마이크로 피펫 풀러에서 (오른쪽과 왼쪽 모세관 홀더의 중심을)하고 잠급니다.
   2. 그것은 긴 캐처 얇은 팁을 초래하므로 유리 모세관을 당겨 적절한 프로그램을 사용하십시오. (예 : 열 : 825; 당겨 : 30; 속도 : 120; 시간 : 200; 압력 : 500).
   3. 조심스럽게 장치에서 뽑아 피펫을 제거하고 수평 위치에 microforge에 놓습니다.
   4. 인출 된 피펫과 초점에 그 유리 구슬과 microforge 히터 필라멘트를 가져옵니다. 원하는 두께를 측정하고 히터 필라멘트 대상 내경 (5 μm의)에 도달 할 때까지 수평으로 피펫을 이동 접안 레티클을 사용합니다.
   5. 약 45 %의 열을 조절하고 필라멘트에 닿을 수 있도록 부드럽게 아래로 피펫을 가지고. 잠시 히터를 활성화합니다. 이 w병 약간 필라멘트에 접착되도록 피펫을 용융 및 냉각시에, 피펫 직선 절단을 생성하는 접촉 지점에서 중단된다.
      참고 : 너무 높은 온도가 피펫 벤드를 만들 것입니다 따라서 직선 절단 할 수 없습니다 너무 낮은 온도가 피펫 (그림 1A)를

결과

레이저를 이용한 세포질 미세 주입은 가축 접합체의 세포질에 솔루션을 제공하는 강력하고 신뢰할 수있는 프로토콜입니다. 3 전 및 사출뿐만 아니라 기술의 전반적인 개요 후 접합자의 일반적인 개요를 보여줍니다. 덱스 트란 레드 주입 및 주입 효율 및 정확도를 추적 사이트 있도록 주입 용액으로서 사용된다. 용액의 성공적인 전송은 염료가 균일 세포질에 분포되어있는 최근 주입 배아를 나타내는도 4에 도시되어있다. 배아의 100 %가 세포질 주입이 기술을 사용.

이 프로토콜은 소 및 양의 접합자 최소한의 용해 속도를 가지고 설명했다. 전용 15.6 ± 5 주입 배아 5.8 ± 3.9 %로 마이크로 인젝션 한 결과, 각각 소와 양에 용해시켰다 (그림 5).

토론

접합체의 미세 주입은 포유 동물의 배아에 솔루션을 도입하기위한 잘 정립 된 방법이다. 종 및 실험 목적에 따라 일부 변형이 기술은 광범위하게 사용될 수있다. 우리는 평활 말단 마이크로 피펫의 입구를 돕기 위해 레이저를 사용하여 세포질 마이크로 인젝션을 수행하는 방법을 보여준다. (예 : 소, 양, 돼지 등) 일부 가축 종의 접합자는 배아의 내부에 한 번 주입 피펫의 시각화를 방해, 어두운 세포질을 가지고있다. 또한, 자신의 세포막이 매우 신축성있는 달성하기 어렵다 (주로 설치류의 접합체를 주입하는 데 사용)를 경사 아군 바늘 그들의 침투하기. 이러한 한계를 극복하기 위해, 세포막 및 배아의 세포질 내부 용액의 방출이 파손되도록하여 투명대 세포질 콘텐츠의 후속 흡입 통해 평활 말단 바늘의 통과를 가능하게하는 레이저를 사용했다. 또한, injecti에 의해바늘 입구의 반대 사이트에서 NG (약 3/4 배아 내부) 우리는 PN을 대체함으로써 자신의 흡입 / 주입을 방지하는 것을 목표로하고 있습니다. 또한,이 이렇게 낮은 용해 속도의.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
마이크로피펫 풀러	Sutter Instrument	P-97
유리 모세관	Sutter 기기	B100-75-10	이 모세관은 피펫을 만들고 고정하고 주입하는 데 사용됩니다. 필라멘트가 없는 두꺼운/표준 벽 붕규산 튜빙을 사용할 수 있습니다.
Microforge	Narishige	MF-9	10X 배율 렌즈 탑재.
Micromanipulator	Nikon/ Narishige	NT88-V3
도립 현미경	Nikon	TE2000-U	4X, 20X 렌즈 및 레이저 시스템 장착.
레이저	연구 기기	7-47-500	토성 5 활성 레이저.
마이크로 디스펜서	Drummond	3-000-105	마이크로 디스펜서는 배아를 이동하는 데 사용됩니다. p10 피펫도 사용할 수 있지만 가능한 한 최소한의 부피로 적재할 수 있습니다.
100 x 15mm 배양 접시	Falcon	351029	접시의 뚜껑을 사용하여 주입판을 만들 수 있습니다. 60mm 배양 접시의 뚜껑도 사용할 수 있습니다.
35mm 배양 접시	Corning	430165	이 접시는 50 &mu의 배아를 배양하는 데 사용됩니다. l 미네랄 오일로 덮인 방울. 또는 4웰 접시를 사용할 수도 있습니다. 배아를 배양하기 위해 선택한 요리에 관계없이, 배아를 배아로 이식하기 전에 항상 최소 4시간 동안 인큐베이터에서 평형을 이루어야 합니다.
인큐베이터	Sanyo	MCO-19AIC	38.5 °로 설정할 수 있는 모든 인큐베이터; C, 5% CO2 조건을 사용할 수 있습니다.
실체 현미경	Nikon	SMZ800	배양 방울 및 세척 중에 배아를 시각화하는 데 사용됩니다. 10X 배율의 모든 실체 현미경을 사용할 수 있습니다.
제어 장치 HT	Minitube	12055/0400	실체현미경에 부착된 가열 시스템.
가열식 현미경 스테이지	Minitube	12055/0003	실체현미경에 부착된 가열 시스템.
Dextran-Red	Thermo Scientific	D1828	멸균 10mg/ml 용액을 사용하여 주입합니다.
미네랄 오일	시그마	M8410	미네랄 오일을 실온에 보관하고  호일 종이를 사용하여 빛으로부터 보호하십시오.
KSOMaa Evolve Bovine	Zenit	ZEBV-100	BSA 4mg/ml 함유. 배아 배양을 위한 KSOM 플레이트는 사용하기 최소 4시간 전에 인큐베이터에서 평형을 이루어야 합니다.
FBS	Gemini-Bio	100-525	줄기세포 자격을 갖춘 FBS를 사용하십시오.
접합			접합자는 17 - 20 hpf 주사되며 in-vitro 또는 in-vivo 유래할 수 있습니다.
NaCl	시그마	S5886	최종 농도 : 107.7 mM. SOF-HEPES 매체의 구성 요소.
KCl	시그마	P5405	최종 농도: 7.16 mM. SOF-HEPES 매체의 구성 요소.
KH2PO4	Sigma	P5655	최종 농도: 1.19 mM. SOF-HEPES 매체의 구성 요소.
MgCl2 6H2O	시그마	M2393	최종 농도: 0.49 mM. SOF-HEPES 매체의 구성 요소.
나트륨 DL- 젖산	나트륨 시그마	L4263	최종 농도 : 5.3 mM. SOF-HEPES 매체의 구성 요소.
CaCl2-2H2O	시그마	C7902	최종 농도: 1.71 mM. SOF-HEPES 매체의 구성 요소.
D-(&빼기;)-과당	Sigma	F3510	최종 농도: 0.5 mM. SOF-HEPES 매체의 구성 요소.
헤페스	시그마	H4034	최종 농도: 21 mM. SOF-HEPES 매체의 구성 요소.
MEM-NEAA	시그마	M7145	최종 농도 : 1x. SOF-HEPES 매체의 구성 요소.
BME-EAA	시그마	B6766	최종 농도 : 1x. SOF-HEPES 배지의 구성 요소.
NaHCO3	Sigma	S5761	최종 농도: 4mM. SOF-HEPES 매체의 구성 요소.
나트륨 피루브산	시그마	P4562	최종 농도 : 0.33 mM. SOF-HEPES 매체의 구성 요소.
Glutamax	Gibco	35050	최종 농도 : 1 mM. SOF-HEPES 매체의 구성 요소.
BSA	시그마	A-3311	최종 농도 : 1 mg / ml. SOF-HEPES 배지의 구성 요소.
Gentamicin	Sigma	G-1397	최종 농도 : 5 μ g/ml입니다. SOF-HEPES 매체의 구성 요소.
배아 이식을 위한 물	시그마	W1503	SOF-HEPES 배지의 구성 요소.
SOF-HEPES 매체	실험실		pH 7.3 - 7.4, 280 ± 10 mOs. 22 &mu를 통해 살균 된 필터; M 필터는 4 °에서 냉장고에 보관할 수 있습니다. C를 1개월 동안 복용합니다. 37 °에서 따뜻하게; C 사용 전 수조.

자: 에서 제작