이 원고에서는 광물화된 조직의 동결된 절편에 대한 여러 차례의 형광 이미징에서 여러 차례의 반응 측정의 정렬된 복합 이미지를 생성하기 위해 고처리량 반자동 극저온 조직학 플랫폼을 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
다양한 조직의 효율적인 표현형 분석 및 조직 병리학에 대한 요구가 증가하고 있습니다. 이러한 표현형 분석의 필요성은 마우스 게놈의 모든 유전자를 파괴하려는 야심 찬 프로젝트에서 분명합니다. 연구 커뮤니티는 조직학을 통해 조직을 표현형화할 수 있는 빠르고 저렴한 수단이 필요합니다. 골격 조직의 조직학적 분석은 시간이 많이 걸리고 기껏해야 반(半)정량적일 수 있으며, 훈련된 개인의 슬라이드에 대한 주관적인 해석이 정기적으로 필요합니다. 여기에서는 광물화된 조직의 효율적이고 저렴한 표현형을 위한 극저온 조직학적 패러다임을 제시합니다. 먼저, 광물화된 조직의 형태를 보존하는 테이프 안정화 동결 절편의 새로운 방법을 제시합니다. 그런 다음 이러한 섹션을 유리 슬라이드에 단단히 부착하고 여러 차례의 염색을 통해 반복적으로 이미지화합니다. 그런 다음 결과 이미지는 수동으로 또는 컴퓨터 소프트웨어를 통해 정렬되어 여러 계층의 이미지 합성 스택을 생성합니다. 이 프로토콜은 주어진 섹션 내의 특정 세포에 대한 수많은 분자 신호의 공동 국소화를 가능하게 합니다. 또한 이러한 형광 신호는 컴퓨터 소프트웨어를 통해 객관적으로 정량화할 수 있습니다. 이 프로토콜은 광물화된 조직의 조직학과 관련된 많은 단점을 극복하고 앞으로 나아가는 근골격계 조직의 고처리량, 고함량 표현형 분석을 위한 플랫폼 역할을 할 수 있습니다.
서론
생물학적 연구는 종종 자주 조직 학적 분석 1-3 일종의와 관련된 효율적인 표현형가 필요합니다. 이 필요 마우스 게놈 4 각 유전자를 방해 더욱 분명 야심 찬 프로젝트가있다. 이러한 조직 학적 분석은 개별 세포에 특정 유전자 또는 단백질의 매핑 표현 세포 형태 및 / 또는 해부학 적 특징을 평가에 이르기까지 다양 할 수 있습니다. 사실, 유전체 분야에 조직학의 기본적인 기여 중 하나가 특정 영역 또는 세포 유형으로 특정 분자 신호를 연결하는 기능이다.
특히 근골격계 조직에 대한 조직 검사의 전통적인 방법은 종종 시간이 많이 걸리고 힘들고, 때로는 해결하기 위해 주를 필요로하고, 석회, 섹션, 얼룩 및 이미지 시편은 인간의 해석을 통해 이미지를 분석 할 수 있습니다. 시츄 hybridizat의 여부 면역 통해 여러 분자 신호를 분석이온, 또는 특수 얼룩, 적절하게 수행하기 위해 여러 섹션, 심지어 여러 표본을 필요로한다. 또한, 이러한 복수 응답은 주어진 시료 내 특정 지역에 공동 지역화 할 수 없습니다 때로는 동일한 셀에 공동 지역화 할 수 없습니다. 게놈과 후성 유전체 매핑 센터, 후성 유전체학 분야는 디지털 시대로 이동함에 따라, 조직 학적 필드는 효율적이고 높은 처리량, 단일 조직 학적 섹션 내 분자 신호의 다양한 자동화 된 분석을 제공하기 위해 소송을 수행해야합니다.
실제로, 소정의 시험편의 특정 셀에 다수의 분자 신호들을 연결할 수 향상 조직학 기술에 대한 필요성이 대두되고있다. 최근에, 우리는 광물 조직 5-14에서 주어진 섹션 내에서 여러 가지 대응 방안을 평가하기위한 새로운 높은 처리량 cryohistological 방법을 발표했다. 방법은 현미경 슬라이드에 견고하게 접착 테이프 부 냉동 cryotape로 동결 절단 (Cryosections) 안정화 포함하며각 섹션에 염색 및 이미징의 여러 라운드를 실시. 이미지의 이러한 라운드는 수동 또는 이미지 분석하기 전에 컴퓨터 자동화 (그림 1)을 통해 정렬됩니다. 여기, 우리는이 과정에 대한 자세한 프로토콜을 제시하고 이러한 기술은 서로 다른 생물학적 과정에 대한 우리의 이해를 향상 예를 제공합니다.
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프로토콜
코네티컷 보건 센터 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학은 모든 동물 절차를 승인했다.
1. 고정 및 포함
- CO 2 질식 또는 기타 승인 된 방법을 통해 동물을 안락사.
- 제대로 고정 될 때까지 4 ° C에서 10 % 중성 완충 포르말린에 대한 관심의 조직 (예를 들어, 사지, 척추 등)과 장소를 수확. 이전의 고정 일관성 해부학 적 위치를 유지하기 위해 특별한주의하십시오. 예를 들어, 일관성 굴곡, 내부 회전에서 관절과 사지를 해결하고 외부 회전은 11 각도. 삼일 - 일반적으로 1 전체 마우스 사지를 고정합니다.
주의 : 포르말린은 독성 및 적절한 개인 보호 장비를 착용하는 동안 흄 후드에서 처리되어야한다.
참고 : 고정의 기간은 표본의 크기에 따라 달라집니다. 실험이 허용하는 경우, 뼈를 오픈 절단하면 골수 실의 고정이 향상됩니다.일부 표본 (골수 내에서 예를 들어, 희미한 형광 신호) 형광 배경을 최소화하기 위해 관류 고정 (15)가 필요할 수 있습니다. - 4 ° C에서 24 시간 - 전송 1X PBS에서 만든 12 부화 30 % 자당에 포르말린에서 표본.
참고 : 12 회 동안 항온 - 24 시간, 시험편 후 장기간 보관을 위해 -80 ° C에 배치 될 수있다. 저장이 방법은 연구자들은 동일한 블록에서 여러 샘플을 포함하고자하지만, 동시에 이러한 모든 샘플을 채취하지 않을 수있는 실험 추천 (예를 들어, 여러 시점 실험). - 자당에서 표본을 제거하고 초과 조직을 멀리 해부하다.
- cryomold 채우기 냉동 매체를 포함와 방법의 일부 (금형의 크기는 표본의 크기에 따라 달라집니다). 관심있는 지역의 비행기를 절단하는 금형의 바닥과 평행이되도록 금형 샘플을 놓습니다.
주 : 특정 조직 위치 및 방향의 예도 2a에서 찾을 수있다 - B있다. - 냉동 내장 매체 정지의 얇은 층까지 드라이 아이스의 조각 상 cryomold를 놓고 이후 장소에서 시료를 해결합니다. 드라이 아이스 펠릿의 cryomold을 유지하면서 냉동 매체를 포함와 cryomold의 남은 용량을 입력합니다.
- 2- 메틸 부탄은 드라이 아이스로 미리 냉각이 들어있는 용기에 cryomold를 놓습니다. 시료가 완전히 고정되면, cryomolds를 제거하고 여분의 2- 메틸 부탄을 흔들. -20 °의 C에 셀로판과 장소에 cryomolds을 감싸 또는 -80 저장을위한 C 냉동고 °.
주 : 특히 -20 ℃에서 냉동 매립 매체에 저장 될 때 샘플 시간 동안 건조 할 수있다. (단계 1.3 참조) -80 ° C 또는 -80 ° C에서 30 % 자당 매체를 포함 크라이 2 개월 - 우리는 이상 1 샘플의 저장을 권장합니다.
2. 테이프 안정화 조직 단면
- 냉장고에서 표본 블록을 제거하고 cryosta에 배치-20 ° C ~ -25 사이에 설정 한 온도 t.
- cryomold에서 블록을 제거하고 면도날 매체를 포함 초과 냉동 멀리 트림.
- 시험편 디스크에 일부 크라이 매립 매체를 배치하고 시편 디스크 표면함으로써 관심 영역에 대한 적절한 절단면 확립 블럭의 바닥면과 평행이되도록, 블록을 정렬.
- 그라 이오 스탯의 표본 디스크를 놓고 동결 매체를 포함 크라이 허용합니다.
- 시험편 헤드 상 시험편 디스크를 삽입하고, 블레이드 절단 시험편 블록의 표면에 평행하도록 상기 헤드를 조정한다.
- 관심 영역 내에서 수준으로 블록을 아래로 트림과 블록의 표면에서 모든 부스러기를 브러시.
- 그라 이오 스탯에 대한 관심 및 사전 냉기의 영역을 커버 할 수있을만큼 cryotape의 조각을 잘라.
참고 : 여러 조각이 cryost 내에서 일관된 크기로 잘라 저장할 수 있습니다절편시에. - 다음 아래 블록 끈적 측 상에 테이프를 배치 집게를 사용하여 비 접착 실버 / 골드 탭으로 테이프를 잡고 cryotape에서 비 부착지지를 제거합니다.
- 롤러 (그림 2C)를 사용하여 cryotape에 압력을 적용합니다.
- 자동 모터 또는 저온 유지 장치를 수동으로 커팅 휠을 사용하여 - (8 μm의 5) 섹션을 확인합니다.
참고 :이 부분 (그림 2D)를 절편 동안 무대 떨어지지하지 않도록 무대에 오는대로 cryotape의 가장자리를 유지하는 것이 좋습니다. - 그라 이오 스탯 내에서 플라스틱 현미경 슬라이드에 섹션 조직 측면을 놓습니다.
- 그라 이오 스탯에서 플라스틱 슬라이드를 제거하고 냉동 포함 매체는 부분은 슬라이드의 표면에 부착되도록 용융 할 수 있습니다.
- 시리얼 섹션 또는 관심의 다른 지역에 대한 절편 반복합니다.
- 완성되면, 슬라이드 박스 A의 부분을 저장할t (4) -20 또는 -80 ° C는 필요한 스토리지의 길이와 하류 대응책에 따라. 4 ° C에서 보관하면 한 달 내에 - 예를 들어, 효소 활성을 물들 일 예정 슬라이드를 사용 (5.3 5.2 참조).
현미경 슬라이드에 섹션 3. 접착
- UV 경화형 접착제 제조 방법.
- 현미경 슬라이드 레이블.
참고 :이 증가 자동화, 샘플 및 슬라이드가 바코드로 표시 할 수하십시오. - 두 개의 유리 슬라이드에 UV 활성화 광학 접착제 방울을 적용하여 유리 슬라이드의 표면에 걸쳐 접착제의 얇은 층을 전파 플라스틱 슬라이드의 에지를 사용한다.
- 실버 / 골드 탭을 차단하고 첫 번째 슬라이드의 접착에 녹화 섹션 조직 측면을 배치합니다. 테이프 아래에 포획 된 기포의 형성을 최소화하기 위해 다른 하나의 에지에서 롤링 모션 구간을 적용한다.
참고 : 첫 번째 슬라이드는 t의 사전 젖은 밑면에 사용된다이전에 두 번째 (영구) 슬라이드 (단계 3.1.4)에 배치에 그는 테이프. - 첫 번째 슬라이드에서 테이프 부분을 제거하고 제 2 슬라이드 (그림 3A)의 접착제 층에 놓습니다. 다시 말하지만, 거품의 함정을 피하기 위해주의하십시오.
참고 :이 단계는 마스터에 연습이 필요합니다. - 주어진 실험 섹션의 해당 번호가 각 슬라이드에 배치되면, 주변 지역에서 초과 접착제를 닦아.
- 테이프 아래에 거품 또는 섬유에 대한 밀접하게 각 부분을 검사합니다. 현미경이나 돋보기에서이 검사를 수행합니다. 장애물이 존재하는 경우, 각각의 부분을 제거하는 장애물을 제거하고 유리 슬라이드에 다시 적용.
- 접착제를 가교하는 10 분 - 녹화 섹션 아래에 장애물이 없는지 결정되면, (5)의 UV 검은 빛 아래 현미경 슬라이드를 놓습니다.
- 현미경 슬라이드 레이블.
- 키토산 접착 방법.
- 일을 준비전자 1 % 키토산 접착제. 100㎖의 탈 이온수에서 농축 아세트산 0.25 ㎖에 용해시켜 초산 용액을 제조 하였다 (0.25 % v / v)로. 아세트산 용액 100ml에 키토산 분말 1g을 용해시키고, 용액을 교반 O / N 또는 모든 키토산 분말이 용해 될 때까지.
참고 :이 솔루션은 실온에서 안정하다. - 슬라이드에 배치 될 각 섹션에 대한 키토산 용액 한 방울을 입금.
- 테이프의 실버 / 골드 탭을 잘라 접착제 (그림 3A)에까지 각 테이프 섹션 조직면을 배치합니다. 거품의 함정을 피하기 위해 신중을 사용합니다.
- 일단 모든 섹션이 슬라이드에 배치, 긴 모서리 중 하나에 슬라이드를 위로 기울 집게를 사용하여 하단 가장자리에 과도한 키토산을 끕니다.
- 슬라이드 상자에 종이 타월 위에이 방향으로 슬라이드를 놓습니다. 중력은 키토산의 평평하고 균일 한 층을 산출 초과 키토산은 수건에 아래로 떨어질 것입니다.
- 놀이터냉장고 O 오픈 내놓고의 뚜껑 슬라이드 상자를 CE / N은 키토산 건조 할 수 있도록합니다.
주 :이 접착 방법의 비교 표 1을 참조하십시오.
- 일을 준비전자 1 % 키토산 접착제. 100㎖의 탈 이온수에서 농축 아세트산 0.25 ㎖에 용해시켜 초산 용액을 제조 하였다 (0.25 % v / v)로. 아세트산 용액 100ml에 키토산 분말 1g을 용해시키고, 용액을 교반 O / N 또는 모든 키토산 분말이 용해 될 때까지.
슬라이드에 참조 마커 4. 응용 프로그램
- 녹색의 50 μL 및 물 100 ㎕에 빨간 미소의 50 μl를 용해하여 기준 마커 솔루션을 준비합니다. 4 ° C에서 어둠 속에서 솔루션을 저장합니다.
- 마이크로 스피어 용액에 10 μL, 20 μL 피펫 팁을 놓습니다. 관심 영역 (그림 3C)에 인접한 각 섹션에 마이크로 스피어 솔루션의 작은 방울을 추가합니다. 관심 영역 내에서 미소를하지 않도록주의해야합니다.
- 그 날에 슬라이드를 처리하는 경우 30 분 (빛으로부터 보호) RT에서 슬라이드를 건조시킵니다. 그렇지 않은 경우, 4 ° C에서 슬라이드 상자에 슬라이드를 배치합니다.
주 : 미세 용액 슬라이드 수화 전에 건조만큼 상기 MI중 공구는 염색 / 영상의 여러 라운드 동안 슬라이드에 부착 된 상태로 유지됩니다.
염색 5. 여러 라운드
주 : 촬상 염색 및 재 이미징 단계 호환 시퀀스를 선택하여, 그것을 검출하여 동일한 조직 절편 많은 생체 신호를 공동 지역화 할 수있다. 영상 / 염색 / 재 이미징의 각 라운드는 특정 조직 학적 질문을 위해 개발되어야한다. 촬상 / 염색 / 재 이미징 시퀀스는 일반적으로 형광 다중화 면역 염색 및 효소 활성 얼룩 여러 발사 다음 영상의 첫 번째 라운드에서 내인성 형광 신호 (예를 들어, 셀룰러 GFP, 광물 염료, 생체 내 이미징 프로브)를 획득하는 것을 포함한다. 마지막 섹션은 조직 구조를 강조 발색 염료 (O safranin 예 H & E, 톨루이딘 블루, 등)를 사용하여 염색 될 수있다. 에서 적응이 절에 제시 지정 방법상업적으로 사용 가능한 프로토콜.
- 축적 된 광물에 대한 칼 세인 블루 염색
참고 : 칼 세인 블루 염색이 암시 야 또는 미분 간섭 대비 (DIC) 이미지와 달리 자동 이미지 분석에 대한 의무가 일관성있는 광물 표면을 얻을 수 있습니다. 칼 세인 블루 염색의 문제점은 샘플이 미네랄 라벨 이미지 칼 세인 블루로 염색하기 전에 화상의 첫 번째 라운드에서 라벨을 포함하는 경우 형광 스펙트럼 그러므로. 테트라 사이클린 및 demeclocycline 라벨과 겹치는 점이다.- 조직 내에서 내생 신호가이 염색 단계 이전에 몇 군데 경우 커버 슬립 멀리 슬라이드에서 떨어질 때까지, 1 x PBS를 가득 코 플린 항아리에 이전 이미징 라운드에서 슬라이드를 잠수함. 제거하고 커버 슬립을 건조.
- NaHCO3을 2 %에 칼 세인 블루 용액 30 ㎎ / ㎖를 준비 (100 ㎖의 H 2 g을 NaHCO3을 용해시켜 만든 2 O 및 조정) 염산 7.4의 pH로 보내고. 나누어지는 및 -20 ° C에서 솔루션을 저장합니다.
- 이미 이전 라운드에서 수화하지 않을 경우, 섹션을 수화 15 분 동안 1X PBS를 포함하는 코 플린 항아리에 슬라이드를 담가.
- 슬라이드를 제거하고 종이 타월로 뒷면과 가장자리를 건조.
- 슬라이드 당 칼 세인 블루 용액 500 ㎕를하고 실온에서 습도 챔버에서 10 분 동안 품어 - (100)를 적용합니다.
- 3 변경 10 분 동안 1X PBS에서 슬라이드를 씻어.
- 각 슬라이드에 1X PBS에 50 % 글리세롤 ~ 200 μl를 적용하고 커버 슬립을 탑재합니다.
- 초과 글리세롤을 제거하고 슬라이드의 바닥을 건조.
- 타르트 레이트 저항성 산 포스파타제 (TRAP) 효소 활성 염색
주 : TRAP는 파골 세포를 포함하는 조혈 리니지 여러 세포 유형에서 발현된다. 여기에 제시된 TRAP 염색 노란색 형광 산 포스 파타 아제 기판을 사용합니다. 특정 형광 신호가 OV합니다테트라 사이클린 / demeclocycline 광물 라벨, 블루 얼룩 칼 세인 및 DAPI의 Counterstain과를 포함하여 사용자 지정 노란색 필터 세트 erlap.- 커버 슬립 멀리 슬라이드에서 떨어질 때까지 1X PBS로 가득 찬 코 플린 항아리에 이전 이미징 라운드에서 슬라이드를 잠수함. 제거하고 커버 슬립을 건조.
- 아세트산 나트륨 무수물 9.2 g 및 물 중의 나트륨 타르트 레이트 이염 기성 이수화 물 11.4 g을 용해시키고, 1000 ml의 최종 부피를 가져 와서 버퍼 (1)를 준비한다. 농축 빙초산 (- 2 ml의 ~ 1.5)와 4.2 pH를 조정합니다. 4에서 솔루션을 저장 최대 12 개월 동안 C를 °.
- 아질산 나트륨 40 mg을 용해하고 1 ml의 최종 부피를 가져 와서 버퍼 (2)를 준비한다. 최대 일주 4 ° C에서 솔루션을 저장합니다.
- 염색 날, 버퍼 (1)의 7.5 ml의 버퍼 (2) 150 μL를 혼합하여 반응 완충액을 제조.
- 슬라이드에 기재하지 않고 반응 버퍼를 적용10의 - 15 분은 낮은 pH에서 조직을 평형 수 있습니다.
참고 : 일반적으로 볼륨 ~ 200 μL하지만 모든 부분을 커버 할만큼 충분히 커야합니다. - 100 반응 버퍼 : 1:50 1 사이의 노란색 형광 산 포스 파타 아제 기판을 희석.
참고 : 희석 시료 내 TRAP의 활동에 의해 결정됩니다. - 슬라이드 떨어져 반응 버퍼를 붓고 슬라이드에 노란색 형광 기판과 반응 버퍼를 적용합니다.
- 기판을 활성화하기 위해 UV 검은 빛 아래 5 ~에 대한 분 슬라이드를 놓습니다.
참고 : 배양 시간은 샘플 내에서 TRAP의 활동에 따라 달라질 수 있습니다. - 3 변경 10 분 동안 1X PBS에서 슬라이드를 씻어.
- 각 슬라이드에 1X PBS에 50 % 글리세롤 ~ 200 μl를 적용하고 커버 슬립을 탑재합니다.
- 초과 글리세롤을 제거하고 슬라이드의 바닥을 건조.
주 : 산성 TRAP 버퍼 섹션을 석회됩니다. decalcifica의 추가 혜택기 특정 색상이 다운 스트림 염색 (예를 들어, 광물 라벨) 다시 사용할 수 있다는 것입니다. 예를 들어, 칼 세인 블루 염색은 TRAP 염색시 제거됩니다. 따라서, DAPI의 Counterstain과 후속 라운드 동안이 채널에서 이미지화 할 수있다.
- 알카라인 포스파타제 (AP) 효소 활성 염색
참고 : 광물이 조골 세포를 포함하고 광 화제 연골 세포가 AP를 표현과 관련된 여러 세포 유형. 이 프로토콜에 사용되는 고속 레드 기판은 모두 형광 빨간색과 발색 빨간 신호를 유도한다. 이 때문에, 발색 기질 기판 침전물 영역의 형광 신호를 해소한다. 따라서, AP 기판 급냉 될 수있는 형광 신호를 촬상 한 후이 얼룩을 수행하는 것이 최상이다.- 커버 슬립 멀리 슬라이드에서 떨어질 때까지 1X PBS로 가득 찬 코 플린 항아리에 이전 이미징 라운드에서 슬라이드를 잠수함. 레모적이 커버 전표를 건조.
- 물 100ml에 트리스 12.1 g에 용해시켜 1 M 트리스 준비. 1 M NaOH로 9.5 산도를 조정합니다.
- 탈 이온수 100 ㎖에서의 MgCl 2 20.33 g을 용해시켜 1 M의 MgCl 2 수화물을 준비한다.
- 탈 이온수 100 ㎖에 11.68 g의 NaCl을 용해시켜 2 M 염화나트륨을 준비한다.
- 증류수 50ml에 1g 분체를 용해 패스트 레드 TR 소금 100X 준비 (20 ㎎ / ㎖) 원액. -20 ° C에서 100 ㎕를 분취하고 저장합니다.
- N, N 디메틸 포름 아미드 50 mL에 500 mg의 분말을 용해하여 100 배 (10 ㎎ / ㎖) 나프톨 AS-MX 인산 스톡 용액을 제조 하였다. -20 ° C에서 100 ㎕를 분취하고 저장합니다.
- 밀리미터 100 : 염색 일째에 2 M 염화나트륨의 MgCl 2, 0.5 mL의 1 M 트리스 1 ㎖, 1 M, 0.5 mL를 첨가하여 AP 버퍼를 준비하고 (증류수를 사용하여 10 ml의 최종 농도를 최종 부피를 가지고 트리스, 50 밀리미터의 MgCl 2, 100 mM의 염화나트륨).
- AP B를 배치각 슬라이드 uffer 및 RT에서 10 분 동안, 습도 챔버 내에서 배양한다.
- AP에 버퍼에 1 배 빠른 레드 TR 소금과 나프톨 AS-MX의 100 배 주식을 희석하여 AP 기판 버퍼를 준비합니다.
- 슬라이드 오프 AP 버퍼를 붓고 AP 기판 버퍼로 교체합니다. 실온에서 습도 챔버에서 10 분 - 5 슬라이드를 품어.
주 : 배양 시간은 샘플의 AP 활성에 의해 결정한다. - 워시는 5 분마다 1X PBS에서 배를 슬라이드.
- (: 1X PBS 중의 50 % 글리세롤 DAPI 1000 희석 1) 마운트 커버 DAPI의 대조 염색 용액으로 미끄러.
- 톨루이딘 블루 O (TB) 발색 염색
주 : 이전 단계 50 % 글리세롤 / PBS 용액에 임시 장착 수성 하에서 묘화되기 때문에, 발색 단계는 수성 조건 하에서 묘화된다. 그러나, 염색 액은 시간이 지남에 따라 침출하는 경향이있다. 따라서, 가능한 한 빨리 염색 후의 이미지에 톨루이딘 블루를 제안한다.- 커버 슬립 멀리 슬라이드에서 떨어질 때까지 탈 이온수로 가득 코 플린 항아리에 이전 영상 라운드에서 슬라이드를 잠수함. 제거하고 커버 슬립을 건조.
- 커버 전표를 제거한 후, 깨끗한 물로 교체하고 PBS에서 염은 충분히 조직에서 제거되도록 적어도 10 분 동안 슬라이드를 품어.
- 탈 이온수에 0.025 %의 TB 솔루션을 준비합니다.
- 5 분 - 1의 TB 용액에 슬라이드를 놓습니다.
참고 : 배양 시간은 사용자 기본 설정에 의존하지만, 모든 샘플에 걸쳐 일관성을 유지해야합니다. - 탈 이온수 세척 슬라이드와 코 플린 항아리에 장소 슬라이드는 5 분마다 배.
- 탈 이온수에 용해 된 30 % 글리세롤 마운트 커버 슬립 (이 얼룩이 조직으로부터 침출 발생할으로 PBS를 1 배 NOT). 주 : 글리세롤 장착 매체 조직으로부터 오염의 확산을 방지 과당 시럽, 치환 될 수있다. 에상기 과당 시럽을 제조 용해 될 때까지 60 ° C로 가열 탈 이온수 10ml에 과당 30g을 용해.
이미징 6. 여러 라운드
- 현미경 트레이 (그림 3D)에 슬라이드를 넣습니다.
참고 : 트레이 봄로드됩니다. - 슬라이드 스캐닝 현미경 (그림 3E)의 트레이 스택에 트레이를 넣습니다.
- 각 형광에 적합한 노출 시간 각 슬라이드에 대한 프로파일을로드 할 프로필 목록을 클릭합니다. 수동으로 각 슬라이드의 이름 또는 소프트웨어가 슬라이드 라벨에 제공되는 바코드를 읽게하는 슬라이드 이름을 클릭합니다. 슬라이드의 미리보기 이미지를 촬영하기 시작 미리보기 스캔 버튼을 클릭합니다.
- 조직 검출 마법사에 대한 관심의 영역을 설정하고 영상의 다음 라운드에 저장합니다. 각 슬라이드가 설치가되면, 시작 스캔 버튼을 클릭하여 스캔 프로세스를 시작합니다.
참고 :이 시스템은 100 SLI까지 보유 할 수 있습니다한 번에 데. - 이미징이 완료되면, 이미지 어셈블리 및 분석을위한 각이 .tif 개별 채널 및 이미징 라운드 또는 .jpg 파일에서 이미지를 내보낼 수 있습니다.
7. 이미지 어셈블리
- 포토샵을 사용하여 수동 방식 (또는 계층화 된 이미지를 생성 할 수있는 유사한 이미지 편집 소프트웨어).
- 각 영상 라운드에서 각각의 채널 이미지를 엽니 다.
- 하나의 합성 이미지 내에서 레이어로 개별 이미지를 조립합니다. 이렇게하려면, 하나의 이미지에서 레이어 팔레트에서 레이어를 클릭합니다. 그런 다음 다른 이미지에 레이어를 드래그합니다. 이 드래그 앤 드롭 작업은 이미지에 새 레이어를 생성합니다. 다른 모든 이미지에 대해이 작업을 수행합니다. 또한, 이미지 스택의 레이어로 여러 이미지 파일을로드하여이 프로세스를 자동화하기 위해 (스택 ...에 파일> 스크립트>로드 파일) 스크립트를 사용합니다.
- 각각의 이미지는 합성 이미지에서 각각의 층으로 나열되면, 레이어 이름을 더블 클릭은 라 이름을 바꾸려면yers로 다른 채널을 식별 할 필요가 있었다.
- 각 층을 통해보고 진정으로 합성 이미지를 생성, 레이어 팔레트에서 "화면"에서 "일반"에서 각 레이어의 혼합 모드를 변경하려면.
참고 :이 단계 속도를 높이기 위해 화면에 하나의 층을 변경 한 다음 레이어를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭 한 다음 다른 모든 레이어를 강조, "복사 레이어 스타일"을 선택하고 다른 화면 스타일을 적용하려면 "붙여 넣기 레이어 스타일"을 선택 층. - 더 발색 층을 형광 신호를 시각화하는 발색 층 (즉, 톨루이딘 블루)의 - 경우에 따라, 불투명도 (40 % 내지 10 변화 값)을 감소시킨다.
주 :이 프로토콜에서 사용되는 기와 주사 현미경으로 촬상하여 각 라운드 동안 슬라이드에 발생할 수있는 회전의 양을 최소화 3 에지에 슬라이드를 보유하고있다. 따라서, 유도 된 이미지를 회전 할 필요없이 사용자가 직접 이미지를 정렬하기가 훨씬 쉽다이미지의 다른 라운드에서.
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결과
높은 처리량, 멀티 이미지 Cryohistology을위한 일반 워크 플로
그림 1은이 기술에 사용되는 일반적인 작업을 나타냅니다. 이 영상 마지막 이미지 정렬 / 분석의 여러 라운드를 통해 고정에서 여러 단계를 포함한다. 일주일이 샘플의이 유형을 석회하는 데 걸리는 시간보다 적은 시간 영상 4 라운드를 통해 샘플 고정에서 이동으로이 과정은 조금 걸릴 수 있습니다. 촬상의 순서는 통상적으로 시편 이미 (등 예 GFPs, 광물 라벨) 후 형광 효소 활성 분석 하였다 다중화 형광 면역 (예., TRAP, AP 등) 인 내인성 신호로 시작 최종적으로 세포주기 분석 시험 법 (예를 들면, EDU) 및 발색 얼룩 완료 (예를...
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토론
여기에서 우리는 공동 현지화 및 단일 섹션에 염색 / 영상의 여러 라운드에서 이미지를 정렬하여 여러 가지 생물학적 조치를 정량화하기위한 세부 cryohistology 프로토콜을 제시 하였다. 이 섹션 조직에 어려운 형태 (예를 들어, 광물 뼈와 연골을) 유지로 cryotape을 사용하여 설명하는 방법은 특히 유용합니다. 또한, 단면 조직은 동일한 부의 염색 / 영상 여러 발사를 허용 유리 슬라이드에 단단히 부착되고; 시리얼 섹션은 각각의 다른 프로토콜로 염색하는 전통적인 방법과는 달리. , 섹션 사이의 공동 현지화 신호에 스테인드 여러 라운드로 이미지화 된 하나의 섹션이 문제가되지 않습니다 뭔가를 시도 할 때 문제를 제기 할 수 있습니다 시리얼 섹션을 사용.
시장 최초의 테이프 - 안정화 된 조직 절편 생성물 테이프 이송 시스템 (16), (17)이다.이 코팅 된 플라스틱 테이프를 사용티슈 cryoblock의 표면 상에 배치 된 저온 접착제...
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
저자는 NIH R01-AR063702, R21-AR064941, K99-AR067283 및 T90-DE021989의 자금 출처를 인정합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 10% 중성 완충 포르말린 | Sigma Aldrich | HT501128-4L | 여러 공급업체를 사용할 수 있습니다. 유독. 4% 파라포름알데히드로 대체할 수 있습니다. |
| 설탕 | 시그마 Aldrich | S9378 | 여러 공급 업체를 사용할 수 있습니다. |
| PBS | 시그마 알드리치 | P5368 | 여러 공급업체 사용 가능. |
| Cryomolds | Fisher Scientific | Fisherbrand #22-363-554 | 조직에 따라 다양한 크기를 사용할 수 있습니다 |
| Cryomatrix | Thermo Scientific | 6769006 | 다른 cryomatrices로 대체할 수 있습니다. 그러나 PVA/PEG 기반 수지는 우리 손에 가장 잘 맞았습니다. |
| 2-메틸-부탄 | 시그마 알드리치 | M32631 | 여러 공급업체를 사용할 수 있습니다. |
| Cryostat | Leica Biosystems | 3050s | 는 다른 브랜드/모델로 대체할 수 있습니다. |
| 시편 디스크 | Leica Biosystems | 14037008587 | 다른 브랜드/모델로 대체할 수 있습니다. |
| 저온 유지 장치 블레이드 | Thermo Scientific | 3051835 | 다른 브랜드/모델로 대체할 수 있습니다. |
| 크라이오테이프 | 섹션 연구실 | 크라이오필름 2C | |
| 롤러 | 전자 현미경 과학 | 62800-46 | 다른 브랜드/모델로 대체할 수 있습니다. |
| 플라스틱 현미경 슬라이드 | 전자 현미경 과학 | 71890-01 | 다른 브랜드/모델로 대체할 수 있습니다. |
| 유리 현미경 슬라이드 | Thermo Scientific | 3051 | 다른 브랜드/모델로 대체할 수 있습니다. |
| Norland Optical Adhesive, 61 | Norland Optical | Norland Optical Adhesive, 61 | |
| UV Black Light | General Electric | F15T8-BLB | |
| 빙하 아세트산 | Sigma Aldrich | ARK2183 | 여러 공급업체를 사용할 수 있습니다. |
| 키토산 | 시그마 알드리치 | C3646 | 여러 공급업체를 사용할 수 있습니다. |
| InSpeck 적색 마이크로스코퍼, | ThermoFisher Scientific | I-14787 | |
| InSpeck 녹색 마이크로스피어, | ThermoFisher Scientific | I-14785 | |
| Calcein Blue | , Sigma Aldrich | M1255 | 여러 공급업체 이용 가능. |
| 칼세인 | 시그마 알드리치 | C0875 | 여러 공급업체를 사용할 수 있습니다. |
| 알리자린 컴플렉스톤 | 시그마 알드리치 | A3882 | 여러 공급업체를 사용할 수 있습니다. |
| 데메클로사이클린 | 시그마 알드리치 | D6140 | 여러 공급업체를 사용할 수 있습니다. |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | 여러 공급업체를 사용할 수 있습니다. |
| 글리세롤 | 시그마 알드리치 | G5516 | 여러 공급 업체를 사용할 수 있습니다. |
| ELF 97 황색 형광 산 인산가수분해효소 기질 | ThermoFisher Scientific | E-6588 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62247 | 여러 공급업체 사용 가능. Hoechst 33342 또는 다른 핵 염료로 대체 할 수 있습니다. |
| TO-PRO-3 (Cy5 핵 대조염색) | ThermoFisher Scientific | T3605 | |
| 프로피듐 요오드화물 | ThermoFisher Scientific | R37108 | 여러 공급업체 이용 가능. |
| 아세트산 나트륨 무수 | Sigma Aldrich | S2889 | 여러 공급 업체를 사용할 수 있습니다. |
| 나트륨 주석산염 이염기성 이수화물 | 시그마 Aldrich | T6521 | 여러 공급업체를 사용할 수 있습니다. |
| 아질산나트륨 | 시그마 Aldrich | S2252 | 여러 공급업체를 사용할 수 있습니다. |
| Tris | Sigma Aldrich | 15504 | 여러 공급업체를 사용할 수 있습니다. |
| MgCl2 육수화물 | 시그마 Aldrich | M9272 | 여러 공급업체를 사용할 수 있습니다. |
| NaCl | 시그마 Aldrich | S7653 | 여러 공급업체를 사용할 수 있습니다. |
| 빠른 빨강 TR 소금 | 시그마 Aldrich | F8764 | 여러 공급업체를 사용할 수 있습니다. Vector Blue (Vector Laboratories, Cat# SK-5300) |
| Naphthol AS-MX | 시그마 알드리치 | N4875 | 여러 공급업체 사용 가능. |
| N, N 디메틸 포름 아미드 | 시그마 알드리치 | D158550 | 여러 공급 업체를 사용할 수 있습니다. |
| Toluidine 블루 O | 시그마 Aldrich | T3260 | 여러 공급업체를 사용할 수 있습니다. |
| Axio Scan.Z1 | Carl Zeiss AG | Axio Scan.Z1 | 다른 선형 또는 타일 스캐너도 사용할 수 있습니다. |
| DAPI 필터 세트 | Chroma Technology Corp. | 49000 | |
| CFP 필터 세트 | Chroma Technology Corp. | 49001 | |
| GFP 필터 세트 | Chroma Technology Corp. | 49020 | |
| YFP 필터 세트 | Chroma Technology Corp. | 49003 | |
| 커스텀 옐로우(ELF 97) 필터 세트 | Chroma Technology Corp. | 관습; HQ409sp, HQ555/30m, 425dxcr | |
| TRITC 필터 세트 | Chroma Technology Corp. | 49004 | |
| Cy5 필터 세트 | Chroma Technology Corp. | 49009 | |
| CryoJane 테이프 전사 시스템 | 전자 현미경 과학 | 62800-10 | 여러 공급업체 사용 가능. |
| CryoJane 테이프 Windows | 전자 현미경 과학 | 62800-72 | 여러 공급업체를 사용할 수 있습니다. |
| CryoJane 접착제 슬라이드 | 전자 현미경 과학 | 62800-4X | 여러 공급업체를 사용할 수 있습니다. |
참고문헌
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- Grcevic, D., et al. In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 30 (2), 187-196 (2012).
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- Matthews, B. G., Torreggiani, E., Roeder, E., Matic, I., Grcevic, D., Kalajzic, I. Osteogenic potential of alpha smooth muscle actin expressing muscle resident progenitor cells. Bone. 84, 69-77 (2016).
- Hagiwara, Y., et al. Fixation stability dictates the differentiation pathway of periosteal progenitor cells in fracture repair. J.Orthop.Res. 33 (7), 948-956 (2015).
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재인쇄 및 허가
