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방법 논문

플랜트 병원체의 유전자 조작

14.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/54522

⸱

2016년 9월 30일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Microbiology, Heinrich-Heine University Düsseldorf, 2Bioeconomy Science Center (BioSC), 3Department of Genetics, Institute of Applied Biosciences, Karlsruhe Institute of Technology, 4Cluster of Excellence in Plant Sciences (CEPLAS), Heinrich-Heine University Düsseldorf

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

유전자 Ustilago이 maydis 검댕 곰팡이 조작에 우리는 강력한 유전자 교체 전략을 설명합니다. 이 프로토콜은 감염 표현형을 조사하기 위해 삭제 돌연변이를 생성하는 방법에 대해 설명합니다. 형광 표지 단백질을 코딩하는 서열을 추가하여, 예를 들어, 임의의 방법으로 유전자를 수정하도록 확장 될 수있다.

초록

유전자 결실은 유전자 기능 분석에 중요한 역할을한다. 타겟 방식으로 유전자를 방해하는 가장 효율적인 방법 중 하나는 상동 재조합을 통해 선택 마커 전체 유전자의 교체이다. 상동 재조합 동안 DNA의 교환은 유사도가 높은 순서 사이에 발생한다. 따라서, 표적 유전자를 플 랭킹 선형 게놈 서열은 특히 원하는 통합 사이트에 선별 마커를 지시하는데 사용될 수있다. 삭제 구조의 무딘 끝은 세포의 DNA 복구 시스템을 활성화하여 상동 재조합을 통해 또는 비 - 상동 - 최종 가입하여 어느 구조의 통합을 촉진한다. 효율적인 상동 재조합 유기체에서, 성공적인 유전자 결실의 비율은 50 % 이상이 전략에 유용한 유전자 파쇄 시스템하게 도달 할 수있다. Ustilago가 maydis 검댕 곰팡이는 효율적인 상동 recombinat을 나타내는 진핵 모델 미생물이다이온. 그 약 6,900 유전자 가운데 많은 기능 삭제 돌연변이의 도움으로 특징되었고, 유전자의 필수 기능에 유전자 교체 시도 포인트의 실패를 반복했다. 형광 마커 또는 예측 도메인의 돌연변이 태그에 의해 유전자 기능의 후속 특성은 상동 재조합을 통해 DNA 교환에 의존합니다. 여기, 우리는 미국이 제시 가장 간단한 예를 들어, 유전자 결실을 이용하여 상세히 maydis 변형 생성 전략.

서론

Ustilago maydis는 수십 년 1, 2에 대해 광범위하게 연구 된 식물 병원성 모델 균류이다. 그것은 두 모폴로지, 효모와 같은 비 병원성 단계와 사상, 전염성 형태 3에 존재합니다. 이러한 상동 재조합 DNA 복구 메커니즘으로서 보편적 인 획기적인 발견이 균 4 효모 유사 성장 단계에서 이루어졌다. 또한, 감염에 대한 중요한 감염 필라멘트 및 독성 요인에 대한 형태 학적 스위치 5,6를 잘 특징이다. 이 검댕 곰팡이의 생물학 및 독성에 대한 증가하는 분자 지식은 훌륭한 게놈 주석 (10)와 사용 역 유전학의 용이성, 예를 들면, 우리 연구소에서 잘 조직 된 플라스미드 컬렉션 (HTTP가 지원하는 간단한 유전자 교체 전략 7-9에 의존 : //www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html). 옥수수의 표준화, 신속한 감염 분석eedlings는 병원성의 상세한 연구 (11) 요인을 감안.

미국의 게놈 maydis는 약 6,900 유전자 (10)를 포함한다. 그 기능을 연구하기 위해, 그들은 인해 효율적인 상동 재조합 시스템에 개별적으로 또는 조합으로 삭제 될 수있다. 완벽 상동 끝을 포함 약 1킬로바이트의 측면 영역은 50 % 이상 상동 재조합의 속도에 적합하지만, 비 동종 끝 이미 250 bp의이 구조물 (9)의 올바른 통합을 어느 정도 할 수 있습니다. 현재, 다섯 가지 저항 카세트, 하이 그로 마이신, carboxin, nourseothricin, G418 및 phleomycin에 대한 저항을 매개 hygR, cbxR, natR, G418R, 및 phleoR는 형질 전환 7,9에 대한 선택 사용된다. 또한, 하이 그로 마이신 내성 이종 FLP 재조합 효소 (12)의 일시적인 발현에 의해 제거 될 수있는 재활용 카세트 (FRT-hygR)로 개발되어왔다. 이 저항 카세트하여 이론 무제한 유전자 변형에 제거 할 수 있습니다. Phleomycin 새로운 카세트와 재활용 hygR 카세트 특히 phleoR의 사용이 감소되도록 13 돌연변이이다. 콰 드러 돌연변이 따라서 다른 네 카세트를 사용하여 생성 될 수 있으나, 배의 변이체를 들어, FRT-hygR 시스템 (14)을 추천한다.

이 일반적인 유전자 결실 전략은 성공적 Sporisorium의 reilianum 15, 미국 등의 다른 검댕 곰팡이로 전송 된 hordei (16), 또는 U. 라 esculenta 17 때문에 효율적인 상동 재조합 시스템 아직 유전자 어려운 유기체에서 상기 애플리케이션에 대한 가능성을 제공한다. 관련된 유전자의 결실에 의해 예시 된 바와 같이 또한, 상동 재조합이 결여 생물 유전 공학을 개선하기 위해 수정 될 수 비 동성 엉D-가입 뉴로 crassa의 18, 19에.

여기에서 우리는 미국에 대한 게시 된 유전자 삭제 전략을 설명 후보자의 신속하고 정확한 검증에 초점을 맞춘 실험 자세히 7,9를 maydis. 예를 들어, 우리는 진균 chitinases를 사용하여 단일 돌연변이의 발생뿐 아니라 다수의 삭제 20,21 종자 도시한다. 그들은 강성 세포벽 키틴에 작용하기 때문에 Chitinases은 흥미로운 예이다. 세포벽 리모델링이 세포 분열시 형태 변화 필요, 사상 성장과 포자 형성에 전환합니다. 따라서, 결실 돌연변이 체의 수명주기 동안 표현형을 기대할 수있다.

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프로토콜

삭제를 구축 1. 생성

  1. 각각 1킬로바이트 상류 측면 (UF)과 하류 측면 (DF) 각각 평활 절삭 제한 부위에 의해 측면 적절한 저항성 카세트를 포함하는 결실 구조체 (도 1)를 포함하는 플라스미드를 생성한다.
    참고 : 모든 복제 전략을 우리는 플라스미드 9 골든 게이트 복제를 권장합니다 (복제에 대한 참조 22 참조)를 사용할 수 있습니다.
  2. 삭제 (9)를 구성하여 삭제 1 μg의 DNA를 얻었다 무딘 커터를 이용하여 플라스미드 구축 절제. 효소를 제거하고 상용 시약을 사용하여 22 예를 들어, 버퍼 및 제조업체의 지침을 따르지 삭제 구조를 정화.
    주 : 벡터 백본 변환 혼합물에 남아있을 수 있습니다.

원형질체 2. 준비

참고 : 전자의 모든 시간 동안 멸균 상태 유지xperiment. 세포벽은 세포막에 분자의 접근을 제한하는 강한 보호 층이다. 삭제 구조체를 포함하는 DNA의 흡수를 허용하기 위해, 상기 칸막이 벽은 protoplasting 반응에서 효소 분해 셀 벽에 의해 제거 될 필요가있다. 원형질체 제조에서 중요한 단계는 매질 1) 삼투압 안정화하고 2) 원형질체에 기계적 응력을 회피.

  1. 마크 2 원형질체를 동결하고 -20 ° C에서 그들을 냉각하는 둥근 바닥 ml의 튜브. 원하는 유전 적 배경을 가진 균주의 신선한 판에서 3 ㎖ YEPS 빛의 사전 문화를 시작합니다. 28 ° C에서 24 시간 동안 회전 바퀴에 품어.
    참고 : 변형은 solopathogenic 변형 SG200 (10), 야생형 균주 등 AB33 (23), 또는 이중 돌연변이의 생성에 대한 돌연변이 배경으로 테스터 균주가 될 수 있습니다. 변형 원하는 저항의 무료 있는지 확인합니다.
  2. 당황 FLA는 50 ml의 YEPS 빛의 문화를 희석K와 200 rpm으로하여 28 ° C에서 궤도 통에 품어.
    참고 : 배가 시간은 야생형 균주 약 2 시간이다. 세 개의 중복 최소 허용합니다.
  3. 지수 상까지 성장한다. (1.0 허용 0.6) 600 nm의 (OD 600)의 파장에서 측정 된 광학 밀도가 약 0.8 있는지 확인하십시오. OD 1.0 (600)는 약 1 U. 7 10 × 2에 해당 ml의 당 세포를 maydis.
  4. 현미경으로 오염 세포를 확인합니다. 40 배 배율을 사용합니다. 5 분 1,500 XG의 전체 50 ㎖ 문화의 세포 펠렛과 상층 액을 버린다. 25 ml의 구연산 나트륨, 소르비톨 용액 (SCS), 원심 분리기 5 분, 1,500 XG에 펠렛을 재현 탁하고, 상층 액을 버린다.
    주 : 세균 오염이 작고 종종 이동하는 세포로서 식별 될 수있다. 진균 오염물은 U.의 시가 형 세포에 비하여 다른 셀의 형상이나 크기에 기초하여 식별 될 수있다 maydis.
  5. CEN 중trifugation가 protoplasting 용액을 제조 (12.5 ㎎ / ㎖ 트리코더마는 SCS에서 효소를, 용균, 세포 펠렛 당 3 ㎖를 제조, 필터는 22 μm의 필터를 통해 살균, 솔루션은 최적의 효소 활동에 대한 신선한이어야한다). SCS는 칸막이 벽의 제거시 원형질체의 파열을 방지하기 위해 삼투 성 정제이다.
  6. 용액 protoplasting 2 ㎖에 펠렛을 재현 탁. RT에서 5 분 20 품어과 세포의 30 ~ 40 %가 원형 또는 pinheads처럼 (그림 2)가 될 때까지 현미경으로 확인합니다.
    주 : 지금부터 얼음의 모든 단계를 수행하고주의 원형질체를 처리!
  7. 10 ml의 감기 (4 ° C) SCS에서 워시 3 배, 5 분 1,000 XG에 원심 분리기.
  8. 상층 액을 버리고, 5 분 동안 1,000 XG에서 차가운 소르비톨, TrisHCl, 염화칼슘 2 용액 (STC), 스핀 (10) 용액에 펠렛을 재현 탁. 1 ml의 차가운 STC의 펠렛을 재현 탁 냉각 튜브에 100 ㎕의 분취 량을 확인합니다. 더 사용할 때까지 -80 ° C에서 분취 량을 동결.

미국의 3 변환 maydis

참고 : 미국의 변환 maydis 원형질체는 기술적으로 간단하고 특수 장비를 필요로하지 않는 일렉트로과 유전자 변형 또는 대향 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) - 매개 형질 전환 방법에 의존한다.

  1. 2 층 선정 플레이트 (전환 반응 당 2 판)을 준비한다. 바닥 층은 배 농도의 항생제가 포함되어 있습니다. 400 μg의 / ㎖ 하이 그로 마이신을 포함 RegLight 정확하게 취하여 12 ㎖ (300 μg의 / ㎖ nourseothricin 또는 4 μg의 / ㎖ carboxin 또는 1 ㎎ / ㎖의 G418) 페트리 접시에. 거품을 피하십시오.
    참고 : 아래 층 플레이트 (아래 참조) 4 ° C에서 며칠을 저장하지만, 변환 동안 갓 최상층을 준비 할 수있다.
  2. 얼음 해동 원형질체 (1 관 / 변환). 1 μL 헤파린 (15 ㎎ / ㎖)를 추가합니다. 1 μg의 DNA (선형화 구조) 또는 10 μL의 H 2 추가 O (물 관리). 얼음에 10 분 동안 품어.
  3. 이 시간 동안, 상위 계층에 대한 RegLight 바닥 판에 (60 ° C에 종기 멋진) RegLight를 액화 12 ml의 확산.
    참고 :이 계층은 항생제가 포함되어 있지 않습니다.
  4. 변환 튜브 (3 2)에 500 μL STC / PEG (폴리에틸렌 글리콜)를 첨가하고, 튜브를 뒤집어 신중 섞는다. 얼음에 15 분을 품어.
  5. 2 층 RegLight 판의 두 각 변환 반응을 배포한다. . 유리 피펫으로 조심스럽게 천천히 확산 형질 전환 식민지로 성장할 때까지 5 ~ 7 일 동안 28 ° C에서 수직으로 번호판을 품어. 접시 당 약 100 ~ 200 식민지를 얻습니다.
    참고 : 낮은 번호가 하나가 너무 많은 세포벽을 포함하기 때문에 DNA를 취할 수 없거나 다시 생성 할 수 없습니다 "나쁜"원형질체에 의해 발생 될 수 있습니다. 전자는 자기 복제 플라스미드, 항생제없이 플레이트상에서 재생을 테스트하여 후자 변환에 의해 시험 될 수있다.
    6. <리> / ㎖ 하이 그로 마이신 200 μg의에서 적절한 항생제를 포함 YEPS 빛 접시를 준비한다 (150 μg의 / ㎖ nourseothricin 또는 2 μg의 / ㎖ carboxin 또는 500 μg의 / ㎖ G418, 이러한 농도 바닥 판에 사용되는 하나의 동일한 반). 이 판에 최소 24 추정 형질 전환 식민지를 다시 정화. 단일 콜로니를 얻을 ​​수 있습니다. 비 선택적 미디어의 원래 긴장 밖으로 동시에 행진에서.
    참고 : 후판 1 ~ 2 주 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.

수정 삭제 이벤트 4. 확인

참고 : 돌연변이는 3 단계 절차에서 확인된다 (그림 1). 먼저, 유전자의 야생형 카피를 포함하는 후보 PCR에 의해 제외된다. 둘째, 상기 궤적에 저항성 카세트의 통합은 PCR에 의해 확인된다. 셋째, 오직 원하는 궤적에 저항성 카세트의 통합을 서던 블롯 분석에 의해 확인된다. 주의 변형 검증 야망이다ntial는 돌연변이 표현형 정말 삭제와 상관 관계가 있도록.

  1. 먼저 진단 PCR (20)
    1. 유전자의 디자인 프라이머 쌍은 250-600 BP (그림 1)의 제품에서 그 결과를 삭제합니다. 이러한 작은 제품은 식민지 PCR로 증폭하기 쉬운 표준 겔 전기 영동의 검출을위한 충분한 시간이다.
    2. 각 후보 및 양성 대조군으로 원래의 균주를 들어, 20 ㎕의 0.02 M 수산화 나트륨에 이쑤시개로 하나의 식민지의 전지 재료의 약간의 (a 핀 머리의 양)을 재현 탁. 실온에서 30 분 동안 인큐베이션.
      참고 : 신선한 식민지를 사용합니다. 판 1 주 재 행진보다 오래된 경우 새로운 식민지를 얻을 수있다.
    3. 바로 PCR에 대한 세포 현탁액 1 μl를 사용한다. 표준 PCR 반응을 실행하고 결과 조각을 분석 할 수 있습니다.
      주의 : 이러한 샘플이 저장 될 수 없다.
      참고 : 따라서이 PCR은 야생형 유전자의 존재에 대한 테스트 및 부정적인 CAND를 신속하게 식별 할 수 있습니다관심있는 유전자를 대체되어 있지 않은 idates. 이 PCR 반응에 밴드를 산출 클론이 삭제됩니다. 그러한 부정적인 클론은 어쨌든 추가 음성 대조군으로 함께 수행되어야한다. PCR 산물없이 후보 더 분석한다. 나머지 절반은 밴드가 발생하지 않아야하는 동안 해로운 영향없이 유전자에 대한 후보자의 약 절반은 야생형 유전자를 포함해야합니다. 이것은 50 %의 상 동성 재조합 속도에 대응한다.
  2. 둘째 진단 PCR
    1. 게놈 DNA의 준비.
      주 : 게놈 DNA (gDNA를)는 두 개의 서로 다른 프로토콜을 사용하여 제조 할 수있다. 첫 번째는 페놀과 클로로포름 따라서 만 두 번째도 4.2 4.2.1.6에 설명 된 경험이 적은 학생들 (처리 할 수있는 반면 (4.2.1.5에 4.2.1.1에서 설명) 경험이 풍부한 연구자들에 의해 처리되어야 같은 독성 시약을 포함한다. 1.11). 두 프로토콜은 안정적으로 노력하고 있습니다. 단계 4.2.1.1은 모두 protoc 동일합니다OLS.
      1. 각 후보와 5 ml의 YEPS 빛을 접종하고 28 ℃에서 24 시간 동안 회전 바퀴에 품어. 형상 관리 접시에 배양 2 μl를 삭제합니다. 멸균 문화를 유지합니다.
        참고 : 다음 표준 프로토콜 (: 독성 단계주의)이다.
      2. 2 ml의 튜브에 1 국자 염산 세척 유리 구슬 (~ 200 μl를) 넣습니다. 미국의 2 ML을 추가 maydis 문화. 5 분 동안 12,000 XG에 스핀. (펠릿이 단계에서 얼 수) 상층 액을 버린다. (24 : 1 ~ 25) 펠릿에 500 ㎕의 페놀 / 클로로포름 / 이소 아밀 알코올을 추가합니다. 주의! 페놀 독성!
      3. 1,000 rpm에서 vibrax에 500 ㎕를 모보 우스 - 용해 버퍼 6 분 10 1. 동요를 추가합니다. 세포 펠렛을 완전히 재현 탁되어 있는지 확인하지만, gDNA를의 전단을 방지하기 위해 진동 확장하지 마십시오. 15 분 동안 12,000 XG에 스핀. 새로운 반응 관에 수성 단계의 400 μl를 전송 (상간을 만지지 마십시오).
      4. 1 ml의 100 % (v / v)의 에탄올을 추가합니다. ㄴ 관찰, 혼합 튜브 배를 반전곧 나타납니다 DNA의 소리. 5 분 동안 12,000 XG에 스핀. 상층 액을 제거하고 200 μL 70 % EtOH로 씻는다. 이 단계에서 펠렛을 재현 탁하지 마십시오.
      5. (펠릿이 완전히 건조시키지 않음) 완전히 뜨는을 제거합니다. 50 ㎕의 TE /의 RNase를 추가합니다. 10 분 동안 50 ℃에서 400 rpm으로 진탕하여 gDNA를 녹인다. 0.8 % 아가로 오스 겔 (20)의 gDNA를 2 μL를 분석한다.
        참고 : 아래의 단계는 다른 비 독성 프로토콜을 포함한다.
    2. 게놈 DNA의 다른 제조
      1. 염산 2 ㎖의 튜브에 유리 구슬을 세척의 1 국자 (~ 200 μl를) 넣습니다. 미국의 2 ML을 추가 5 분 동안 12,000 XG에 maydis 문화와 스핀. (펠렛이 단계에서 얼 수) 상층 액을 버린다.
      2. 펠릿에 500 ㎕를 모보 우스 용해 버퍼 (2)를 추가합니다. 1,000 rpm에서 vibrax에 5 ~ 15 분 동안 흔들어. 세포 펠렛을 완전히 재현 탁되어 있는지 확인합니다.
      3. 15 ~ 20 분 동안 65 ° C에서 튜브를 품어. 아프로 사용2 ml의 튜브를 호스팅하기 위해 설계 절한 인큐베이터 중요합니다. 그런 다음, 5 분 동안 얼음에 놓습니다.
      4. 100 ㎕를 8 M 칼륨 아세테이트, 소용돌이를 추가 또는 8 ~ 10 번 반전. 실온에서 15 분 동안 12,000 XG에 스핀.
      5. 전송 (500) 신선한 1.5 ML 튜브에 뜨는의 μL, 400 μL 이소프로판올을 추가합니다. 소용돌이 또는 반전 8 ~ 10 시간. 15 분 동안 12,000 XG에 스핀. 상층 액을 제거하고 500 μL 70 % EtOH로 씻는다. 5 분 동안 12,000 XG에 스핀.
      6. 완전히 뜨는을 만끽! 결국, 잔류 액체를 제거하기 위해 짧은 스핀 (10 초)를 추가합니다. 3 ~ 5 분 동안 DNA 펠릿 건조를 할 수 있습니다. 50 ㎕의 TE / RNAase을 추가하고 400 rpm에서 10 분 ~ 15 50 ° C에서 품어.
    3. PCR
      1. 설계 중 하나가 (UF-F, RC-R, RC-F, DF-R,도 1) 측면 외부에 결합되고 저항 카세트 내 결합 중 대응하는 두 쌍의 프라이머 9.
      2. 모든 C의 gDNA를의 1:10 희석의 1 μl를 사용하여andidate 2 PCR 반응에서 템플릿으로 업스트림 및 다운 스트림 9 올바른 삽입을 확인.
      3. 각 후보에 대한 표준 PCR 반응을 사용하여 조각 (22) 결과 분석한다.
        주의 : 이러한 PCR들 정확한 게놈 로커스에서 저항 카세트의 삽입 테스트. 제품은 양쪽 모두 얻은 경우, 후보 가능성이 올바른 삽입합니다. 그러나, (다운 스트림 상류 나) 한쪽 만이 확인 될 수도 후보는 PCR 반응은 단순히 하나의 측면에 실패했습니다 경우 추가 분석을 위해 함께 수행되어야한다.
  3. 남부 오 점 분석 (22)에 의해 수정 게놈 삽입의 검증
    1. 유전자 또는 명확하게 DIST에 선도적 인 저항 카세트에 하나 절단, 구성하고 추가 / 궤적 외부 인하 적절한 효소 (15) 돌연변이 후보의 gDNA를 ㎕의 (4.2.1)와 대응하는 야생형 / 전구 변형 다이제스트inguishable 패턴 (그림 1) 8.
      참고 : 그들이 소화되지 않은 DNA에서 명확하게 구별되도록 예상 밴드 없음,보다 큰 10킬로바이트 없어야합니다.
    2. 상류 및 프로브와 같은 다운 스트림 측면을 사용합니다. 예는 PCR DIG 라벨 키트 또는 유사한 표준 방법을 사용할 수 있도록 라벨을합니다. 1에 표시된 프로브를 혼합 : 1 분 비율과 남부 오점을 실시하고 있습니다. 적어도 두 개의 독립적 인 올바른 형질 전환 체를 유지합니다.
      주 : 야생형 패턴 원래 균주 명확히 검출되어야하며, 올바른 클론 만 예상 밴드를 포함한다. 후보 만 존재하는 추가 밴드는 잘못된 현장에서 구조의 다른 삽입을 나타냅니다. 이러한 클론 폐기해야합니다. 첫 번째 진단 PCR에서 확인 된 부정적인 후보는 잘못 통합 삭제 구조의 야생형 밴드와 (크기 예측할 수없는)의 주파수 대역을 포함해야합니다.
  4. 글리세롤 주식
    참고 : 글리세롤 주식 변형 컬렉션 년 동안 클론을 유지하는 역할을한다. 적어도 두 개의 독립적 인 형질 전환 체는 각각의 돌연변이에 대한 보관해야합니다. 이 동일해야합니다 비교 표현형을 할 수 있습니다.
    1. 500 ㎕를 NSY 글리세롤 매체와 각 문화의 28 ° C 믹스 500 μl를 24 시간 동안 회전 바퀴에 YEPS 빛에서 확인 된 돌연변이 균주 5 ml의 문화를 성장. 문화와 매체가 잘 혼합 될 때까지 튜브를 반전. 매체 글리세롤 얼음 결정의 형성을 방지한다.
    2. -80 ° C에서 고정. 재고가 작동하면 다시 연속 동결 문화의 일부를 테스트합니다.

5. 현미경 표현형

  1. 28 ° C에서 12 시간 동안 회전 바퀴에 YEPS 빛의 야생형과 돌연변이 균주 5 ml의 문화를 성장.
  2. 다음 날, 약 0.1의 OD 600 문화를 희석 0.5과 0.7 사이의 OD 600까지를 성장. 1.0 corresp의 OD (600)onds 약 1 7 10 × 2의 미국에 ml의 당 세포를 maydis.
  3. 현미경으로 세포 형태를 검사합니다.
    참고 : 건강한 세포는 시가 모양 (그림 4, WT)에 나타납니다. 발음 액포 또는 필라멘트의 형성은 세포가 스트레스를 나타냅니다.
    주 : 리포터 균주 적절한 분석은이 단계에서 수행 될 수 사용할 경우 예상되는 돌연변이 표현형에 따라 분석은, 예를 들면, 적용 할 수있다. 세포 형태가 변경 통계적 분석이 수행되어야하는 경우 예를 들어, 평균 셀 길이를 결정한다.

6. 감염 분석

참고 : 종묘 감염 분석이 저널 11에 이미 가시화되고있다. 이 중 수 등 SG200 10 또는 모두 돌연변이를 수행 호환 결합 파트너를 혼합하여 반수체, solopathogenic 변형 배경을 이용하여 수행 될 수있다.

  1. 당 최소 40 옥수수 모종을 성장16 시간, 200 μE / 22 ° C (주 / 야간) 28 ° C의 빛을주기에 7 일간 변형. 그들은 3 잎 단계 및 10~15cm 감염의 날에 높이에 있어야합니다.
  2. 이틀 감염 전에, 28 ° C에서 24 시간 동안 회전 바퀴에 5 ml의 YEPS 빛의 균주의 사전 문화를 시작합니다. YEPS 빛이 600 = 1.0 OD 50 ml의 주 문화를 성장 (세포 분열 속도 = 2 시간을 3 분할의 최소 허용, O / N을 수행 할 수 있습니다).
  3. 5 분 1,500 XG에 50 ㎖ 문화의 세포를 스핀 다운 및 상층 액을 버린다. 멸균 H 2 O 씻을 배 OD 3.0 600 무균 H 2 O의 세포를 재현 탁. 필요한 경우, 결합 파트너를 섞는다.
  4. 작은 주사기를 사용 칠일 된 옥수수 모종의 줄기에 세포 현탁액 500 μL - 250을 주입. 대조군으로 멸균 H 2 O를 사용합니다. 같은 빛과 온도 조건에 추가 7-14일에 대한 감염된 모종을 유지합니다. 각 공장 (a)의 표현형 점수건강, 백화, 안토시아닌 형성, 작은 종양, 큰 종양, 죽은 식물 10 ccording.
    참고 : 점수가 이르면 칠일 등의 수행 시간이 지남에 감염 따라 14 일에서 반복 될 수있다.

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결과

미국으로 인코딩 네 chitinolytic 유전자의 삭제 구조 maydis 게놈 cts1의 삭제에 대한 hygR 카세트를 사용하여 골든 게이트 복제에 의해 생성 된의 natR cts2의 삭제, cts3의 삭제 및 cts4 (20)의 삭제를위한 cbxR에 대한 G418R 카세트. 유전자 치환 전략의 일반적인 개요는 cts3의 삭제 (도 1)에 의해 예시된다. 두 번째 chitinolytic 유전자 cts1의 단일 및 이중 돌연변이 독성에 chitinases의 역할 분석을위한 두 개의 서로 다른 유전 적 배경에서 동일한 구조와 순차적으로 생성되었다. 두 개의 서로 다른 변형 배경이 사용되었다 : AB33은 사상 성장을 유도 할 수 있...

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토론

이 프로토콜은 미국에서 역 유전 연구에 대한 결실 돌연변이 체를 생성하는 방법에 대해 설명 maydis. 시작점은 나란히 7,9 최적화되었을 유전자의 관심에 대한 1 시작 상류 및 정지 코돈의 하류 KB뿐만 아니라 적절한 저항성 카세트의 서열을 함유 플 랭킹 서열을 포함하는 결실 구조체이며 . 구조는 개별적으로 각각의 유전자에 대해 생성 조심스럽게 유전자를 삭제하기 전에 시퀀스 오류를 확인해야합니다. 측면은 이웃 유전자에 도달하거나 돌연변이 규제 요소를 수정하는 경우 측면에 점 돌연변이는 특히 게놈 시퀀스에서 원치 않는 변화를 일으킬 수 있습니다. 이것은 모든 형질 전환에 영향을 미칠 것이며, 목적 유전자 결실 무관 표현형 및 부작용을 일으킬 수있다.

삭제 전략을 계획 할 때, 예상되는 표현형은 유전 적 배경을 선택하기 위해 고려되어야. 본 경우 AB33 23 SG200 (10)은 형태...

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공개 사항

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감사의 글

원고의 중요한 읽기 박사 베네딕트 Steuten 특별 감사. chitinases의 원작이 ​​박사 토르스텐 LANGNER에 의해 수행되었다. VG의 기관은 식물 과학 우수 (CEPLAS, DFG EXC 1028)과 BioSC의 클러스터에서 지원, KS의 기관은 BioSC에 의해 지원됩니다. KB는 BioSC에 의해 지원됩니다. 바이오 경제 과학 센터 (BioSC)의 과학 활동은 재정적으로 NRW Strategieprojekt BioSC (313 / 323-400-00213)의 틀 내에서 혁신, 과학 연구의 교육부에 의해 지원되었다. LF는 DFG 국제 연구 교육 그룹 1525 iGRADplant의 박사 친교에 의해 지원됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아미노벤조익산 (Free Acid)Sigma AldrichA-9878
Bacto 한천 BD214010현지 공급업체
Bacto peptoneBD하거나,현지 공급업체
Bacto 효모 추출물BD212750현지 공급 업체
CaCl2*2H2OGrü을 사용합니다. ssing GmbH10234또는 현지 공급
업체 Ca-Pantothenat (Hemi-Ca. salt)Sigma AldrichP-2250
Carboxin을 사용하십시오.Sigma Aldrich45371
카사미노산 BD223050
콜린클로리드시그마 알드리치C-1879
시트르산ChemSolute24,321,000현지 공급업체
CuSO4*5H2OFluka61240대안적으로 사용하고 현지 공급업체
D(+)Sucrose를 사용합니다.Roth4621.1현지 공급
업체 DNA degr. free acid를시그마-알드리치D-3159
EDTA시그마 알드리치E4378
FeCl3*6H2OGrü ssing GmbH10288현지 공급업체
Geneticin (G418) disulfate saltSigma AldrichA1720
Trichoderma lysing enzymesSigma AldrichL1412
D(+) GlucoseCaelo2580대안적으로 사용하고 현지 공급업체
인 Glycerin을 사용합니다.Fisher Chemical은현지 공급업체
H3BO3AppliChemA2940. 제조업체의 안전 지침을 확인하십시오.
헤파린 나트륨 염시그마 AldrichH3393-50KU
하이그로마이신 B-용액Roth1287.2위험한 물질. 
KCl VWR26764298은현지 공급 업체
KH2PO4AppliChemA3620대안적으로 사용하고 현지 공급 업체
MgSO4 물을 사용하지 않는Merck7487-88-9물이 없는 것이 중요합니다. 또는 현지 공급업체
MnCl2*4H2OAppliChemA2087사용하거나 현지 공급업체
myo-InositolSigma AldrichI-5125
Na2-EDTA*2H2OAppliChemA2937현지 공급업체
를 사용합니다.Na2MoO4*2H2ORoth0274.2또는 현지 공급업체를 사용하십시오
2SO4Grü ssing GmbH12174또는 현지 공급 업체
NaClFisher ChemicalS316060현지 공급 업체
NaOHChemSolute13,751,000또는 현지 공급 업체
NH4NO3RothK299.1또는 현지 공급 업체
Nicotinic acid (Free acid)Sigma를 사용합니다. AldrichN-4126
Nourseothricin 디하이드로겐 황산염   Werner BioAgents5,001,000
영양소 육수 Difco현지 공급 업체
페놀 : 클로로포름 : 이소 아밀 알코올 (25 : 24 : 1) pH 6.7시그마 알드리치P3803위험 물질. 제조업체의 안전 지침을 확인하십시오.
폴리에틸렌 글리콜 (PEG)Sigma AldrichP-3640
Potassium acetateAppliChem121479대안적으로 현지 공급업체
Pyridoxin (monohydrochlorid)Sigma AldrichP-9755
Riboflavin을 사용하십시오.Sigma AldrichR4500
RNaseASigma AldrichR5503
SDSRothCn30.3또는 현지 공급 업체
소형 주사기BD300300사용 또는 현지 공급 업체
멸균 필터, 22 µ를 사용합니다. mVWR28145-477또는 현지 공급 업체
SorbitolRoth6213.1사용 또는 현지 공급
Thiamin-hydrochlorideServa36020.02또는 현지 공급 업체
tri-Na-CitrateFisher Chemical사용 S332060현지 공급 업체
Tris-(hydroxymethyl) aminomethaneVWR사용103156X현지 공급업체
인 Tris hydrochlorideRoth9090.4사용하거나 현지 공급업체
Triton X-100을 사용합니다.세르바 37240또는 현지 공급 업체
ZnCl2< / sub>Fluka96470또는 현지 공급 업체 사용
용액 구성 / 재료용액 구성
Carboxin재고 : 메탄올 5 mg / ml, 최종 농도 : 2 µ g/ml
CM 플레이트0.25 % (w/v) 카사미노산, 0.1 % (w/v) 효모 추출물, 1.0 % (v/v) 홀리데이 비타민 용액, 6.25 % (v/v); Holliday 소금 용액, 0.05 % (w / v) DNA degr. 유리산, 0.15 % (w/v) NH4NO3, 2.0 % (w/v) Bacto Agar; 5 M NaOH를 사용하여 pH 7.0으로 조정하십시오. 오토클레이브 후 1% 포도당을 첨가하십시오 
Geneticin (G418)재고 : H2< / sub>O에서 50 mg / ml, 최종 농도 : 500 µ g/ml
HCl 세척 유리 구슬(0.35-0.45mm)유리 구슬을 농축된 HCl(25%, 7.8M)로 덮고 60분 동안 배양합니다. 여러 번 흔들어줍니다. 디캔트 HCl(디캔트 액체 보관) 및 유리 구슬을 3M HCl(디캔트 액체 보관)로 세척합니다. pH가 7이 될 때까지 이중 증류된 H2O로 유리 구슬을 여러 번 세척합니다(액체는 더 이상 황록색이 아니어야 함). 유리 구슬을 분주하고 180°C에서 건조시킵니다. 디캔팅된 HCl은 폐기 전에 중화되어야 합니다. 
헤파린재고 : 15 mg / ml
Holliday 소금 용액16.0 ‰ (승/패) KH2PO4, 4.0 ‰ (승/패) Na2SO4, 8.0 ‰ (승/패) KCl, 1.32 ‰ (승/패) CaCl2*2H2O, 8.0 & (V/V) 미량 원소, 2.0 ‰ (승/패) MgSO<이하 >4; 멸균 여과액
Holliday 비타민 솔루션 0.1‰ (승/패) 티아민, 0.05‰ (승/패) 리보플라빈, 0.05‰ (승/패) 피리독신, 0.2‰ (승/패) Ca-판토테나트, (0.05‰ (승/패) 아미노 벤조산, 0.2‰ (승/패) 니코틴산, 0.2‰ (승/패) 콜린클로라이드, 1.0‰ (w/v) 미오-이노시톨; -20 °에서 저장 될 수 있습니다. C
Hygromycin재고 : PBS에서 50 mg / ml, 최종 농도 : 200 µ g / ml
Nourseothricin재고 : H<2 / sub>O에서 200 mg / ml, 최종 농도 : 150 µ g/ml
NSY-글리세롤-매체0.8 % (w/v) 영양 육수, 0.1 % (w/v) 효모 추출물, 0.5 % (w/v) 자당,  80.0 % (v/v) 87% 글리세린 (f.c. 69.6%) 
RegLight1.0% (w/v) 효모 추출물  0.4 % (w/v) 박토 펩톤, 0.4 % (w/v) 자당, 18.22 % (w/v) 소르비톨, 1.5 % (w/v) 한천
SCS, pH 5.8용액 1: 20 mM 트리-Na-시트레이트, 1 M 소르비톨; colution 2: 20 mM 구연산, 1 M 소르비톨, pH 5.8에 도달할 때까지 용액 1에 용액 2를 첨가; 오토클레이브
STC, pH 81 M 소르비톨, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM CaCl2; 필터 멸균
STC/PEG40 % (v/v) PEG in STC-buffer 
TE 완충액, pH 81.31 mM 트리스 베이스, 8.69 mM 트리스 -HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O
TE/RNase10 &마이크로; TE 완충액에 있는 g/ml RNaseA
미량 원소0.06‰ (승/패) H3BO3, 0.14‰ (승/패) MnCl*4H2O, 0.4 & (승/패) ZnCl2, 0.4 & (승/패) Na2MoO4*H2O:2, 0.1 ‰ (승/패) FeCl3*6H2O, 0.04‰ (승/패) CuSO4*5H2O
Trichoderma 용해 효소 용액12.5 mg/ml SCS; 필터 멸균;
Tris-HCl pH 7.5806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base를 사용하기 직전에 준비; pH를 확인하고 필요한 경우 HCl로 조정; 오토클레이브
Usti-lysis 버퍼 1, pH 810mM Tris-HCl(pH 8.0), 10mM NaCl, 1%(w/v) SDS, 2%(v/v) TritonX-100, 1mM EDTA. pH 측정기를 사용하여 pH를 측정하지 마십시오. 
Usti-lysis buffer 2mix Usti lysis buffer 1 with 1x TE in a 1:1 ratio
YEPS-Light medium1.0% (w/v) 효모 추출물, 0.4% (w/v) 박토 펩톤, 0.4% (w/v) 자당, 플레이트: 1.5% (w/v) Bacto Agar
은 인 를 사용인 을 사용211677;은 은 인 을 인 은 대안적으로 사용합니다.은 인 을 인 위험 물질을 대안적으로 사용할 G065015을 인 을 인 을 사용하거나 . Na인 업체 는 를 인 준비

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