높은 처리량, 멀티 플렉스 및 대상 단백체 CSF 분석은 퇴행성 신경 바이오 마커 및 아포 지단백 E 이소 상태를 정량화하기

요약

우리는 임상 번역 잠재력 개발 된 높은 처리량, 멀티 플렉스 및 대상 단백체 뇌척수액 (CSF) 분석에 대해 설명합니다. 시험은 예컨대 아포지 단백질 E 변형 (E2, E3 및 E4)과 같은 신경 퇴행에 대한 잠재적 마커 및 위험 인자를 정량하고, 그 대립 유전자 발현을 측정 할 수있다.

초록

많은 신경 퇴행성 질환은 여전히 효과적인 치료법이 결여되어있다. 식별하고 이러한 질병을 분류하기위한 신뢰할 수있는 바이오 마커는 미래의 새로운 치료법의 개발에 중요하다. 종종 잠재적 인 새로운 바이오 마커는 그들의 개발과 높은 비용의 한계로 병원으로하지 않습니다. 그러나, 액체 크로마토 그래피 - 탠덤 모니터링 다양한 반응을 이용하여 표적 단백질 체학은 / 질량 분석 즉, 삼중 사중 극자 질량 분석기를 사용하여 (MRM 된 LC-MS / MS)를 빠르게 진단 실험실로 임상 번역 바이오 마커를 평가하고 검증하는 데 사용될 수있는 하나의 방법이다 . 전통적으로,이 플랫폼은 임상 실험실에서 작은 분자의 측정에 광범위하게 사용되고 있지만, 그것은 그것을 ELISA (효소 결합 Immunosor에 매력적인 대안을 만드는 단백질을 분석 할 수있는 잠재적 인굴곡 량 법) 방법을 기반. 우리는 E 이성체 4 (ApoE4로)를 아포지 단백질 공지 된 위험 인자의 검출 및 정량화를 포함한 치매 다중화 마커를 측정하는 방법을 프로테오믹스 타겟 여기서 설명한다.

번역 분석에 적합하게하기 위하여, 신속한 간단한 매우 특정하고 비용 효율적인 설계된다. 이를 달성하기 위해, 분석법 개발의 모든 단계들이 분석되어 각각의 단백질과 조직에 대해 최적화되어야한다.이 방법은 번역 타겟 프로테오믹스 MRM 된 LC-MS / MS를 개발하는 다양한 팁과 포함하는 일반적인 흐름을 설명 .

방법 개발 검출을위한 MS를 보정 트립신 quantotypic 펩티드의 사용자 지정 합성 버전을 사용하여 최적화 한 다음 이전에 MS의 분석 크로마토 그래피 분리에 내인성 펩티드의 정확한 식별을 결정하기 위해 CSF로 급증한다. 압솔뤼을 달성하기 위해TE 정량 짧은 아미노산 서열 태그에 트립신 절단 부위를 포함하는 펩티드와 안정 동위체 표지 내부 표준 버전은, 상기 분석에 포함된다.

서론

알츠하이머 병, 루이체 치매 및 파킨슨 질환과 같은 신경 퇴행성 질환의 증가 효과는 많은 국가 ^하나의 사회 경제적 문제가되고있다. 식별 및 질병의 초기 단계에 환자를 분류하고, 잠재적 인 새로운 치료를 모니터링하는데 사용될 수있는 추가의 바이오 마커가 필요하다. 이 방법의 전반적인 목표는 신경 퇴행의 가능성 CSF 마커의 유효성을 검사하는 간소화 된 경제 및 빠른 방법에 대한 일반적인 파이프 라인을 만드는 것입니다. 이론적 디스커버리 실험에서 여러 잠재적 바이오 마커 단백질을 평가하기 쉽게 수정할 수있는 방법으로 타겟 프로테오믹스 또는 펩티드 MRM LC-MS / MS를 사용하는 것이다. 이러한 더 빠른 크로마토 그래피 분리 (<10 분) 및 평가를 통해 다중화 될 수있다. 신경 퇴행성 바이오 마커이 다중 화면 내에서, 우리는 알려진 치매 위험 인자의 아포지 단백질 이소 E4 (ApoE4로)를 포함했다 그래서 우리는 캘리포니아N이 별개의 ^{유전자형이} 테스트에 대한 필요성을 제거함으로써 동시에 그 상태 발현 수준을 결정한다. LC MS / MS 일상적 정확하게 예컨대 ELISA 또는 방사선 면역 측정법 (RIA) 등의 다른 방법보다 작은 분자를 정량 선호하는 방법으로 사용된다. 분석 단백질 MS 기술의 사용이 시프트는 면역 기반 기술의 문제에 의해 주로 구동되었다. 이러한 교차 특이도, 일괄 배치 변화에 제한된 수명, 높은 비용을 포함한다. 따라서, 표적 단백질 체학은 급속 같은 웨스턴 블로 팅, RIA와 ELISA로 항체 기반의 방법에 성장 대안이되고있다. 그러나, 하나의 분석에 많은 마커를 다중화 할 수있는 능력은 면역 기반 방법 ^(3)을 통해이 기술의 중요한 이점이다. 이 기술은 많은 조직에 적용 할 수 있으며, 플라즈마 ⁽⁴⁾ 및 소변 ^5,6- 포함한 많은 프로테오믹스 연구 검증 전략으로 사용되어왔다.

테chnique는 삼중 사중 극 질량 분석기를 사용하여에 액세스 및 전문성이있는 기관에 적용 할 수 있습니다. 펩타이드 디자인은 오픈 소스 데이터베이스의 사용 증가와 상대적으로 간단하다. 사용자 정의 펩타이드 합성의 경쟁 시장은 그들이 훨씬 더 저렴합니다. 무거운 펩티드 그러나, 고가이며, 따라서 표지가 대규모로 이동하기 전에 작은 집단에 평가되어야한다. 기술이 가장 큰 병원 쉽게 타겟팅 프로테옴 분석을 실행하도록 구성 될 수있는 삼중 사중 기반 플랫폼을 갖는 임상 진단 세팅에서 사용하는 성장 가능성이있다. 방법의 하나는 이러한 응용 프로그램, 루틴 진단 설정으로 제작, 겸상 적혈구 빈혈 ⁷ 신생아 혈액 현장 심사에 최근 응용 프로그램입니다.

프로토콜

참고 :. 여기에 설명 된 전체 프로토콜의 개략적 인이 Fi를 gure 1에 제시되어이 방법의 개발에 사용 된 모든 샘플은 흑자 임상 진단 샘플이며 런던 블룸 스 버리 윤리위원회의 윤리 승인을 가지고있다.

평가를 위해 타겟팅 된 CSF의 MRM LC-MS / MS 분석. 후보 표지자 펩타이드 생성의 전체적인 과정을 나타낸 도식도 1 단백질 타겟으로부터 선택된다. 맞춤 합성 펩티드의 사용을 통해, 타겟팅 된 LC-MS / MS 다중 방법이 생성된다. 평가 후 분석은 신경 퇴행의 가능성이 마커의 효능을 평가하는데 사용될 수있다.

1. 펩타이드 선택 및 디자인

참고 : 마커 펩타이드 기준이 고유해야한다는 것입니다 (proteotypic > 강한)과 단백질 (quantotypic)의 양적 풍요 로움을 나타내는. 펩티드의 Uniprot 웹 사이트의 '폭발'검색 도구 고유 여부를 확인하려면 (http://www.uniprot.org/blast/)를 사용할 수 있습니다.

1. 즉, 표적 단백질 (마커)의 목록을 정의 아포 E (표 2 참조).
   참고 : 마커가 이전 프로테옴 프로파일 링 실험 ^(8)로부터 확인 된 경우 해당 데이터 세트에서 최상의 응답을 제공하는 펩티드를 선택합니다.
2. 이 정보를 사용할 수없는 경우, 이러한 MS-다이제스트 같은 소프트웨어 도구를 사용하여 이러한 표적 단백질의 실리 트립신 소화 오픈 소스 웹 사이트를 사용합니다.
3. 트립신 및 번역 수정을 게시 민감하지 않은 펩타이드를 선택합니다.
   참고 :이 정보는 Uniprot 웹 사이트 www.uniprot.org 확인할 수 있습니다. LC-MS 샘플 준비하는 동안 화학적 변형하는 경향이 펩티드를 피하십시오.
<리> 선택된 펩타이드의 사용자 지정 합성을 주문하십시오.
주 : 표식 펩티드 맞춤 다양한 상업 회사에 의해 합성 할 수있다. 아포 총 아포 수준을 측정하기 위해 사용되는 펩티드는 quantotypic AATVGSLAGQPLQER로 측정되었다. E2와 E4 변형을 결정하는 데 사용 proteotypic 펩티드 서열은 각각, 위치 (158) (및 RLAVYQAGAR CLAVYQAGAR) 및 위치 112 (LGADMEDVCGR 및 LGADMEDVR)에 트립신 펩티드이다.

표준 펩타이드 2. 준비

주 : 가장 양적 전환을 선택하기 위해, 매트릭스 (CSF)의 검출이 최적화 될 필요가있다. 다중 펩티드를 최적화하는 가장 효율적인 방법은 공지 된 농도의 펩티드 풀을 생성하는 것이다. 이러한 풀은 분석법 개발 표준 곡선을 위해 사용될 수있다.

1. 1 ㎎ / ㎖ 재고로 (펩타이드 세부 사항은 표 2에 제시되어있다) 합성 펩티드를 재현 탁에 따라 농도는 지침을 제조하고 있습니다. 기본적으로 명령어를 사용할 수없는 경우, 50 : 50 (v / v)의 아세토 니트릴 (ACN)에 재현 탁 펩타이드 / H ₂ O
2. 낮은 바인딩 microcentrifuge 관에 주식 농도와 각 펩타이드의 풀 1,000 pmol의에서 펩타이드의 1시 10분 희석을 준비합니다. 단축 진공 청소기 집중에 -20 ° C에서 최종 수영장과 상점을 건조시킵니다. 나중에 사용하기 위해 여러 풀을 준비합니다.
3. 나누어지는 낮은 결합 튜브로 CSF 100 ㎕. 동결 건조 뇌척수액을.
4. 10 pmol의 1 / μL의 농도를 얻기 위해 분해 완충액 (100 mM 트리스 염산, pH가 7.8, 6 M 우레아, 2 M 티오 우레아, 2 % ASB14)에 모아 ​​1000 pmol의 펩티드를 분취 재현 탁.
5. 0, 1, 2, 5, 10, 15 μM의 농도에서 CSF의 동결 건조 된 100 ㎕의 분취 액으로 풀링 펩티드 스파이크. 이러한 TR의 소화 효율을위한 내부 표준 및 제어 역할을하는 효모에 놀라로 손상 관련이없는 단백질의 20 NG 추가ypsin.
6. 20 μL의 최종 금액에 버퍼를 소화와 CSF 씩을 최고. 와동.
7. 디티 오 트레이 톨, 1.5 μL (100 mM 트리스 염산, pH가 7.8 1 ㎖의 30 ㎎)을 첨가하고 실온에서 1 시간 동안 흔들어.
8. 요오도 아세트 아미드 3 μL (100 mM 트리스 염산, pH가 7.8 1 ㎖의 35 ㎎)을 첨가하고 어두운 곳에서 45 분간 실온에서 진탕.
9. DDH ₂ O의 165 μl를 추가
10. 0.1 μg의의 10 μl를 추가 / 50 mM의 중탄산 암모늄 완충액, pH가 7.8에 재현 탁 순서 등급 수정 트립신 솔루션 μL. 37 CO / N에서 물을 욕조에 품어 샘플을 동결하여 소화를 중지합니다. 분석 할 준비가 될 때까지 보관은 -20 ° C에서 소화.

MS 펩타이드 감지 3. 최적화

1. 적절한 소프트웨어, 예를 들면, 스카이 라인 ^(9)에, 복사 펩티드의 순서가 최적화 될 붙여 넣습니다. 정보를 획득하기 위해 상기 단백질 서열 클릭예상 전구체 이온 질량 및 생성물 이온.
2. 재고 농도에서 펩티드를 희석 (1) NG / MS 방법 개발을위한 ml의 농도로 추가 (2.1 절 참조).
3. 직접 최적 유속으로 질량 분석기에서 펩타이드 주입 (일반적으로 0.1-0.8 ㎖ / 분) 0 - 5 % 충돌 에너지.
4. 실험 다중 하전 이온 전구체 ^(8)를 식별하기 위해 MS 스펙트럼을 획득. 가장 강도 (doubly- 또는 삼중 충전 전구체 이온이 좋습니다) 제공 전구체 이온 (m / z)를 선택합니다.
5. 펩타이드를 Reinfuse 충돌 유도 해리 (CID)에 의해 펩타이드를 단편화하는 충돌 에너지를 적용합니다. 최고의 조각 패턴 얻기 위해 콘 충돌 에너지 최적화 (부모 이온보다 바람직하게는 더 큰 조각 이온의 단일 또는 이중 부과 조각 이온 질량을 권장합니다).
6. 실험적으로 얻은 전환이 실리에서 발생하는 전환과 일치하는지 확인 </ EM> (단계 3.1에 기재된 바와 같이). 전구체 이온 당 적어도 두 가장 강렬한 전환을 이용하여 MRM 방법 파일에 전이 목록을 저장한다. 최종 분석에서 확인을 위해 정량 1과 1 : 2 전환을 포함합니다.
   참고 : 일부 MS 제조업체는 기능을 가지고 (즉, 워터 Intellistart) 자동 MRM 또는 SRM 분석 최적화. 0.1 % FA로 70 % ACN - 가능하다면 (50)에 결합 된 모바일 단계와 펩티드를 달이다.

4. LC-MRM 방법 개발

주 : 울트라 성능 삼중 사중 극자 질량 분석기에 연결된 액체 크로마토 그래피 (UPLC) 시스템에 의해 합성 펩티드의 혼합물을 분석 할 수 있습니다. 소스가 깨끗한 지 확인합니다. 용매 A는 0.1 % FA와 _DDH이 0이고; 용매 B는 0.1 % ACN FA로된다.

1. 동일한 위상의 사전 컬럼에 C-18 상 (1.6 μm의 직경, 90 Å 기공, 2.1 mm × 50 mm 길이)로 포장 및 첨부 된 UPLC 컬럼을 갖춘 LC-MS 시스템을 사용합니다.
2. 300 μL 유리 삽입 튜브에 10 분 및 전송 60 μL에 대한 16,000g에서 얼음, 원심 분리기에 제상 CSF 다이제스트와 C. ^O를 -20에서 다시 나머지를 저장
3. 10 분 1 사용하여 표준 곡선 지점에서 최고 농도의 주입 - 40 % ACN 선형 구배 (기울기 설정에 대한 표 1 참조)
4. 3 단계에서 생성 된 모든 전환과 결과 크로마토 그램 및 노트 유지 시간과 펩타이드 당 상단이 가장 강한 (정량적) 전환을 엽니 다.
5. 이 정보를 바탕으로, 펩티드를 (예를 들어 그림 2 참조) 측정 할 시간이 초과 채널 (단계 3.6에서 만든) 10 분 MRM 방법을 업데이트합니다. 감도를 유지하기 위해, 8보다 큰 피크 당 점으로 각 채널을 유지하고 각각의 펩타이드 적어도 하나의 전환을위한 0.01 초보다 큰 드웰 시간.
6. MRM 방법에서 '용매 지연'을 포함 : 처음에 한 10 첫 번째 피크 용출 전에 초 때까지단계, 마지막 피크 용출 후 20 초간의 끝에서 다른. MS 방법 파일에 메소드 이벤트에서 "용매 지연"을 선택하여이 작업을 수행합니다.
7. 초과 MRM 방법을 통해 표준 곡선을 실행하고 선형성 확인하여 (단계 3.6에서 생성) 전환과 간섭되는 비특이적 피크가 없는지 확인합니다.
8. 펩타이드는 방법을 통해 비 아군 풀링 제어 및 질병 CSF를 실행하여 검출되어 있는지 확인합니다.
9. 분석에서 검출 한계 이하 펩티드를 제거합니다.

펩타이드 전환의 그림 동적 MRM MS 방법 2. 예. 시간이 초과 채널 설립 체류 시간에 따라 그룹화 할 수 있습니다. 선택된 표식 펩티드는 크로마토 그래피 컬럼에서 용출로 MRMs를 사용하는 것은 시간 형 방식으로 통합하기 위해, TRA의 수를 최소화시간 기간 동안 nsitions 및 분석의 감도를 증가시킨다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

내부 표준 5. 추가

주 : 앞서 설명 된 바와 같이 ^10, 안정 동위 원소 표지 된 내부 표준 물질을 분석에 포함시킬 수있다. 때문에 이러한 표준의 비용으로, 이는 제 행렬에서의 펩타이드를 평가 의뢰한다.

1. CSF의 검출에 최적화 된 이상적인 펩티드를 결정 : 가장 높은 강도 및 간섭 피크없이, 가장 반복되는 펩티드를 선택합니다.
2. 펩티드 대응 설계 내인성 펩티드 적어도 6 다 대하여 펩티드의 질량을 증가 무거운 ¹³ C ¹⁵ N 아미노산 라벨을 포함한다. 무거운 PEP 6 추가적인 아미노산 중의 N- 또는 C- 말단 - 또한, (4)의 태그를 추가조류는 트립신 소화 제어 할 수 있습니다.
3. 소화 버퍼에 안정 동위 원소 표지 내부 표준 물질을 희석 (단계 2.4 참조). 이전에 개발하는 동안 관찰 abundancies에 따라 다양한 수준으로 급상승하여 CSF에서 아군됩니다 안정 동위 원소 표지 내부 표준의 이상적인 양을 결정합니다. 내인성 펩티드 안정 동위 원소 표지 표준 : 1의 비율로 약 1을 달성하는 것을 목표로하고 있습니다.
   주 : 안정 동위 원소 표지 된 내부 표준 물질은 다양한 상업 회사에 의해 합성 할 수있다.

CSF 환자 샘플 6. LC-MRM 분석

1. 스파이크 CSF 100 ㎕로 안정 동위 원소 표지 된 표준의 양을 최적화하고, 혼합물을 동결 건조.
2. 버퍼 다이제스트의 20 μL에서 CSF를 재현 탁 포인트 2.7에 설명 된대로 소화를 수행 - 2.10.
3. 4 단계에서 개발 된 LC-MRM 방법을 사용하여 샘플을 분석한다.
4. 정량 분석을위한 표준 PEP 실행할표준 곡선에서 0 -15 pmol의 농도에서 조류. 표준 곡선의 제조 단계 2.5를 참조하십시오.

7. 데이터 분석

주 : 정량적 데이터를 기준 피크 내부 표준 (무거운 표지 된 펩티드)의 강도 비에 기초한다. SRM / MRM 데이터 분석에 대한 자세한 정보는 이전 ^{10 설명했다.} 비율 데이터는 절대 수준을 결정하거나 무거운 표지 된 펩타이드의 첨가 농도에서 그들을 계산하는 표준 곡선으로 사용될 수있다.

1. 질량 분석기 제조업체의 표준 소프트웨어 ^(10)를 사용하여 LC-MRM 데이터를 분석 할 수 있습니다. 또한, 정량 MRM 데이터 ^(10)를 분석하는 스카이 라인 소프트웨어를 사용합니다.
2. 예를 들면 아군 효모에 놀라 또는 각 실행에 안정 동위 원소 표지 표준으로 내부 표준의 반응을 확인하여 실행의 감도를 확인합니다. 변화 (CV)의 계수가보다 큰 있지 않은지 확인25 %.
3. 수동 정확도를 보장하기 위해 데이터를 검토 주석. 즉, 적절한 안정 동위 원소 표지 내부 표준에 각각의 펩타이드 및 비율을 분석 가능한 경우 펩타이드의 안정 동위 원소 표지 된 버전을 사용하십시오.
4. CSF 100 ㎕ 당 pmol의 절대 값을 얻기 위해 동시에 실행 된 적절한 표준 곡선으로 비율 데이터를 실행.
5. 변화 (CV)의 계수를 계산합니다. 각 펩타이드에 대한 CV 높은 풍부한 펩타이드 25 % 이하 15 % 이하이어야한다.
   참고 : 100 ㎕를 CSF 값에 따라 절대 값 pmol의 후속 하류 통계 분석에 사용 할 수 있습니다.

8. 아포 지단백 E 이성체 상태

주 : 아포 이성체 상태를 결정하기 위해, 해당 펩티드의 존재는 각각의 이성체의 존재를 판단함으로써 수행 될 수있다.

1. > 1,000 신호의 CSF 임계 값을 100 ㎕의 아포를 고려그 펩타이드에 긍정적으로 -to-잡음. 환자의 이소 상태를 확인 할 수없는 요구되는 펩티드 / 그림 5를 참조하십시오. 아포 E 식을 총 각 이성체의 %를 계산하여 대립 유전자의 발현을 확인합니다.

결과

전술 한 방법을 사용하여, 54 단백질 74 펩티드로 이루어진 높은 처리량을 10 분 다중 분석이 신경 퇴행성 질환 알츠하이머 병 및 루이체 치매 (LBD) ^(8).도 3의 마커에 대한 분석으로 개발되었다 게시 다중화 크로마토 그램이다 이전에 ⁸ 분석에서 중요한 펩타이드 마커. 분석 및 정량 전이에 포함 된 펩티드. 표 2에 주어진이 방법에 의해 생성 된 데이터는 관련 안정 동위 원소 표지 된 내부 표준으로 표준화 된 비율을 제공한다. 이들 값은 절대 pmol의 / 100 μL의 CSF 농도를 결정하는 표준 곡선을 넣을 수있다. 이들 값은 다음 통계적 임상 샘플의 변화를 분석 할 수있다.

이전 ⁸ 74 PE 정량 한 바와 같이,이 CSF 분석...

토론

모든 MS 기반 분석에서와 같이, 상기 방법에서 중요한 단계는 내부 표준 물질의 적정하고 정확한 양의 측정이다. 절대 정량이 사용되는 경우, 표준 곡선 아군 펩티드의 정확한 양 또한 중요하다.

우리의 분석은 CSF 또는 종래 MS 분석에 정리하거나 탈염 같이 임의의 유형의 사용의 석출을 필요로하지 않는 - 그것은 전적으로 한 냄비 반응 방법이다. 인해 CSF의 작은 부피와 한정된 복잡도 (플라즈마에 비해)에, 이들 단계하여 분석을 단순화하고 진단 설정에 번역이 더 적합 최종 프로토콜에서 제거 될 수 있음이 밝혀졌다. 주 열 분석하고 MS 방법에서 용매를 지연 미리 열의 개재물 500 개 이상의 샘플에 대한 실행시 MS 감도를 유지하기에 충분한 것으로 보인다. 분석-UPLC runni로NG 시간은 명백하게 행렬 다이제스트 CSF에서 정확한 피크를 식별하는 데 중요하다 짧다.

이 아군은 합성 펩티드의 사용과 표준 곡선에 의해 달...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아세토니트릴(ACN), LC-MS 등급	Fisher	A955-1
포름산, LC-MS 등급,	Fisher	A117-50
디티오트레이톨 (DTT)	시그마	D5545 - 5 g
염산, 37% w/w	VWR	BDH3028 - 2.5 LG
요오도아세트아미드	시그마	I1149 - 수
		S318-500
트립신, 염기서열분석 등급, 변형	Promega	V5113
트리플루오로아세트산(TFA), LC-MS 등급	Fisher	A116-50
우레아	시그마	U0631- 500g
물, LC-MS ULTRA 크로마솔프	플루카	14263
맞춤형 합성 펩타이드 탈염 1-4 mg	Genscript	맞춤형
헤비 라벨링 아미노산 [13C; 15N] 맞춤형 펩타이드	Genscript	맞춤형
ASB 14	Merck Millipore	182750 - 25g
Thiourea	Sigma	T7875 - 500g
Tris base	Sigma	T6066
VanGuard precolumn	Waters	186007125
Cortecs UPLC C18 + 1.6 μ 엠  2.1 x 50 mm 칼럼	Waters	186007114
Yeast Enolase	시그마	E6126
300 μ l 클리어 스크류 탑 글라스 바이알	Fisher scientific	03-FISV
Y 슬릿 스크류 캡	Fisher scientific	9SCK-(B)-ST1X
동결 건조기	Edwards Mudulyo	Mudulyo 시스템
집중 장치/속도 진공	Eppendof	집중 장치  plus 5301
Xevo -TQ-S 질량분석기	Waters
Acquity UPLC 시스템	Waters