방법 논문

Adenofection : 고갈-구조 실험에 의해 세포 Morphodynamics 분자 샤페론의 역할을 공부하는 방법

DOI:

10.3791/54557

⸱

2016년 9월 16일

 ,  ,  ,  , 
1Département de biologie moléculaire, biochimie médicale et pathologie, Faculté de médecine, Centre de recherche sur le cancer de l'Université Laval, 2Oncology, Centre de recherche du CHU de Québec, Université Laval, 3Laboratoire d'études moléculaires des valvulopathies (LEMV), Groupe de recherche en valvulopathies (GRV), Quebec Heart and Lung Institute/Research Center, 4Department of Surgery, Université Laval

이 논문에서

요약

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우리는 세포의 무결성과 단백질 항상성을 보존하는 고갈 구조 실험 방법을 설명합니다. Adenofection은 단일 세포 수준에서 유사분열 세포 분열 및 근육 발생과 같이 미세하게 조정된 액틴 기반 역학에 의존하는 생물학적 프로세스 내에서 단백질의 기능 분석을 가능하게 합니다.

초록

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이러한 유사 분열 및 세포 분화 등 세포 과정은 크게 세포 골격 구조의 적절한 리모델링에 의존하는 세포 모양의 변화에​​ 의해 지배된다. 이는 주어진 시간과 장소에서 고차 고분자 구조의 조립 분해, 단백질의 과발현에 의한 교란에 특히 민감한 방법을 포함한다. 근처 대 정상 세포 형태를 단백질 항상성을 유지하고 유지할 수있는 방법은 세포 과정의 넓은 범위에서 목적 단백질의 기능적 기여도를 결정하는 것이 매우 바람직하다. RNA 간섭에 기초하여 과도 플리 구조 실험은 단백질의 기능 및 구조적 요구를 분석하기위한 강력한 방법이다. 그러나, 생리 학적 수준의 최소 편차를 갖는 목적 단백질의 재 도입이 어려운 과제이다. 여기에서 우리는 분자 보호자의 역할을 연구하기 위해 개발 된 방법이라고 adenofection을 설명D 분열하는 세포의 정상적인 동작 파트너 액틴 개조와의 관계. HeLa 세포는 siRNA 이중 가닥의 3'UTR 영역 타겟팅 BAG3 고갈되었다. GFP-태그 BAG3 단백질은 형질 전환 시약에 결합하는 재조합 아데노 바이러스를 사용하여 세포의> 75 %로 동시에 재 도입 하였다. Adenofection는 스트레스 반응의 부재, BAG3 고갈 HeLa 세포에 가까운 생리적 수준 BAG3-GFP 단백질을 발현 할 수 있었다. 이펙트 내인성 열 쇼크 단백질 샤페론 단백질 항상성의 주요 응력 - 유도 조절기의 레벨에서 관찰되지 않았다. 또한, 세포 형질 형질시 형광 마커의 발현을 구동 배큘로 바이러스를 첨가함으로써, 시간 경과에 의해 미세한 분열 세포 역학 해부 수 정상적인 분열 진행 최소 교란으로 분석한다. Adenofection은 근육 모세포은 diff의 기능 분석을위한 하드에 감염시킬 마우스 세포에도 적용하고, 적합myotubes에 erentiation. 따라서 adenofection 구조 - 기능은 고차 세포 골격 역학에 의존하는 중요한 생물학적 과정에 관여하는 단백질의 분석을 수행하기 위해 다양한 방법을 제공한다.

서론

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포유 동물 세포에서 유전자 발현의 불 활성화 작용은 단백질의 기능을 해부 금 표준이다. 새로 아연 손가락 클레아 제와 같은 특정 사이트 클레아 제의 사용을 기반으로 게놈 편집 기술을 개발하고 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 회문 반복 (CRISPR)은 / CAS9 이제 타겟 유전자 삭제 및 돌연변이 1, 2와 세포주의 생성을 할 수 있습니다. 이 새로운 접근 방식은 우리가 단백질의 기능과 인간 질병의 유전에 대한 우리의 이해를 공부하는 방법을 혁신해야합니다. 일부 경우에서, 그러나, 장기 또는 완전한 유전자 녹아웃 바람직하지 않다 이차 전지 및 보상 메커니즘을 유발할 수있다. 유전자 조작 된 세포주의 생성은 또한 제한된 증식 능력 때나 다양한 세포 유형의 돌연변이의 큰 집합의 스크리닝 받고자 일차 세포 배양 물을 처리 할 때 제한 될 수있다. 이는 종종 셀 B의 의존성을 결정하기 위해 필요한단백질의 구조적 요구 사항에 대한 학적 처리. 이를 위해 다양한 세포 배경 일시적 플리 구조 실험 있도록 RNA 간섭에 의한 가역적 최저 여전히 구조 기능 관심 3의 단백질 분석을 수행하는 간단하고 강력한 접근 남아있다. 그러나, 이러한 접근법의 주요 단점은 어려움 효율적인 침묵을 달성하고, 세포 집단의 대부분에 가까운 생리적 수준의 관심 또는 그의 ....

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프로토콜

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중간 및 솔루션 1. 준비 (모든 멸균 여과)

  1. 마우스 C2C12 근육 세포 (분화 연구)
    1. C2C12 세포 배양 유지 성장 중간 500ml의 준비 : 10 % FBS 및 2mM의 글루타민으로 보충 된 DMEM 고 글루코오스한다.
    2. C2C12 차별화 100 ml의 차별화 중간 (DM)를 준비 : 2 % 말 혈청 DMEM 높은 포도당을.
  2. 헬라 세포 (유사 분열 세포 연구)
    1. 준비 500ml의 αMEM 헬라 RFP-H2B 세포 배양 유지 실험 : 10 % FBS와 2 mM L 글루타민 (αMEM 10 %)으로 보충 αMEM.
    2. 헬라 RFP-H2B 셀 동기화 (데 옥시 리보 뉴 클레오 시드 / 리보 뉴 클레오없이) 500 ml의 αMEM 마이너스를 준비 : 10 % FBS와 2 mM의 L 글루타민 (αMEM 마이너스 10 %)로 보충 αMEM 마이너스를.
    3. 헬라 - RFP-H2B 리터에 대한 페놀 레드없이 20 ㎖를 αMEM 준비필자 셀 획득 : αMEM 페놀 레드가없는 10 % FBS와 2 mM L 글루타민.
    4. 100 MM의 티미 딘을 준비합니다 텍싱....

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결과

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양이온 성 지질을 사용하여 BAG3-GFP 플라스미드 DNA의 형질이 HeLa 세포에서 이종 발현과 관련이 매우 높은 BAG3 수준을 (그림 2A)를 베어링 거의 검출 단백질의 수준 등을 보여주는 몇 가지 세포. 이러한 세포에서 단백질 항상성의 손실은 핵 주변 집계 (그림 2A, 화살표)에 BAG3-GFP의 축적에 의해 입증되었다. 반면, BAG3-GFP를 운반하는 아데노 바이러스와 세포 전달보다 균일 한 낮은 표현과 BAG3-GFP의 정확한 현지화 (그림 2B, 혼자 감염)을 나타냈다. 놀랍게도, 아데노 바이러스 전달 중 양이온 성 지질의 추가 (즉, 아데노 바이러스 입자의 형질)은 세포 (그림 2B, Adenofection)의 대부분에 균일 한 표현을 유지 허용하면서 상당히 유사한 MOI에서 셀 당 BAG3-GFP 발현을 증가했다.......

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토론

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여기서는 화학량 론 및 단백질 복합체 및 거대 구조 역학에 영향을 미치는 단백질의 과발현에 특히 민감한 세포 생물학적 과정의 기능적 분석에 적용 가능하다 플리 구조 실험이 수행 될 수 있도록하는 방법을 설명했다. 유사 분열 세포 분열은 세포의 전체 구조에서 가장 극적이고 아름다운 변화를 포함 미세 조정 세포 morphodynamics의 극단적 인 예입니다. 세포 이미징을위한 굴지 및 tubulin의 마커의 낮은하지만 검출 양을 소개 시판 BacMam 시약과 결합 adenofection를 사용하여 적절한 유사 분열 세포 리모델링에 보호자 복잡한 BAG3-HSPB8의 기여 명확하게 입증 될 수있다. Fuchs의 외.의 최근 연구에서, 우리는 BAG3의 고갈이 불가능 관련된 스핀들 방향에 결함이 단단한 유사 분열의 굴지 피질을 설정하고 액틴이 풍부한 조립됩니다 보여 주었다후퇴 섬유 (14). 적절한 스핀들 역학은 BAG3 침묵에 따라 HSPB8 수준에서 볼 수 감소를 수정 야생형 BAG3-GFP의.......

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 연구는 캐나다 보건 연구소(Canadian Institutes of Health Research, 보조금 번호 7077), 벨리니 재단(Bellini Foundation) 및 로비 폰다지오네(Roby Fondazione)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
C2C12 마우스 MyoblastsATCCCRL-1772
아데노바이러스 맞춤형 설계Welgen맞춤형 설계
염화칼슘Fisher ScientificC79-500
CellLight® Actin-GFP, BacMam 2.0써모 피셔C10582
CellLight® Tubulin-RFP, BacMam 2.0써모 피셔C10614
Dulbecco' s 변형 된 독수리' s 매체 (DMEM), High GlucoseThermo Fisher11965-092
EDTASigmaE5134
Fetal Bovine Serum (FBS)Thermo Fisher12483-020
FibronectinSigmaF1141
Glass bottom dish, 35 mmMatTek CorperationP35G-1.5-20-C Case
HeLa-RFP-H2BDr Sabine Elowe의 친절한 선물, 쿠에큐트; bec, 캐나다Klebig C et al. 2009
HEPESFisher ScientificBP310-1
Horse Serum, New ZealandThermo Fisher16050-122
KClFisher ScientificBP366-500
L-글루타민써모 피셔25030081
리포펙타민® RNAiMAX 트랜스펙션 시약Thermo Fisher13778-150
Minimal Essential Medium (MEM) AlphaWisent310-101-CL
Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Desoxyribonuleosides/RibonucleosidesThermo Fisher12000-022
Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Phenol RedThermo Fisher41061-029
Na2HPO4BiobasicS0404
NaClFisher ScientificBP358-10
OptiMEMThermo Fisher11058-021
rAVCMV-LifeAct-TagGFP2IBIDI60121
siRNA 듀플렉스Dharmacon맞춤형 설계
티미딘시그마T9250
트립신 2.5%써모 피셔15090-046

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat Rev Genet. 11 (9), 636-646 (2010).
  2. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157

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AdenofectionDepletion RescueMolecular ChaperonesCellular MorphodynamicsBAG3 ProteinsiRNA TransductionAdenovirus ExpressionGFP TaggingMitotic AnalysisLive Cell Imaging

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