여기서 Saccharomyces cerevisiae의 포자 형성은 96 멀티웰 형식으로 수행됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
영양 스트레스 기간 동안 Saccharomyces cerevisiae는 포자 형성으로 알려진 배우자 형성을 겪습니다. 질소와 탄소가 부족한 이배체 효모 세포가 포자 형성 과정을 시작합니다. 포자 형성 과정에는 감수 분열 후 포자 형성이 포함되며, 여기서 반수체 핵은 환경 저항성 포자로 포장됩니다. 당사는 96개의 멀티웰 플레이트에서 발아 효모의 효율적인 포자 형성을 위한 방법을 개발하여 포자 형성 표현형에 대한 효모 세포를 스크리닝하는 처리량을 늘렸습니다. 이러한 방법은 적절한 최소 배지를 사용하는 경우 영양 선택이 필요한 플라스미드를 함유한 효모를 사용한 스크리닝 또는 풍부한 포자 전형성 요법을 사용하는 경우 게놈 변형이 있는 효모를 스크리닝하는 것과 호환됩니다. 우리는 이 방법의 경우 포자 형성 중 폭기가 포자 형성에 중요하다는 것을 발견했으며 96 멀티웰 플레이트 형식과 호환되는 충분한 폭기를 보장하기 위한 기술을 고안했습니다. 이러한 방법은 대용량 플라스크 기반 실험에서 달성할 수 있는 일반적인 ~80% 수준의 포자 형성을 달성하지 못하지만, 이러한 방법은 소량 멀티웰 플레이트에서 약 50-60% 수준의 포자 형성을 안정적으로 달성할 수 있습니다.
서론
신진 효모의 포자 형성은 감수 분열 (1), 유전자 재조합 2의 메커니즘 (3) 세포 신호에 의해 발전의 제어, 개발 4의 영양 관리, 전사시 염색체 분리의 제어를 포함 생물학의 여러 측면, 통찰력을 제공하기 위해 연구되고있다 개발 5의 규제 및 포자 형성 (6)의 시험. 포자 형성 보호 포자 벽 (6)의 증착에 이어 머더 셀 내의 새로운 멤브레인 구획의 형성을 포함하는 신규 한 세포 분열 이벤트를 포함한다. 포자 세포 검사 이러한 연구들은 상대적으로 효율적인 방식으로 7,8- 약 24 시간에 포자 형성 과정을 거칠 수있는 급속 포자 효모 SK1, 활용. 효모 신진 포자 조건의 최적화는 9-13,이 실험 설명되었지만S는 고체 배지 또는 포자를 배양 튜브 또는 플라스크를 사용하여 수행되는 대규모의 액체 배양 물에서 포자를 조사 하였다.
여기에서 우리는 96 멀티 웰 플레이트 형식으로 효모 포자하는 방법을 설명합니다. 우리는이 방법에 대해, 통기 동기와 효율적인 포자 형성에 중요한 것을 발견하고, 작은 볼륨 멀티 웰 형식으로 충분한 포자 형성을 보장하기 위해 기술을 고....
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프로토콜
1. 포자 형성을위한 준비
참고 :.이 프로토콜에 설명 된 미디어는 표준 조리법과 방법을 사용하여 제조하는 13, 17 표 1은이 프로토콜에서 사용되는 다양한 미디어의 1 L에 대한 제제를 제공합니다.
| 박토 펩톤 | 효모 추출물 | 박토 한천 | 우선 당 | 칼륨 아세테이트 | 글리세린 | DDH 2 O |
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결과
이 프로토콜을 평가하기 위해, (전술 한 바와 같이) 멀티 웰 플레이트에서 세포를 포자로부터 얻어진 포자 효율은 형틀 (표 2)에 큰 볼륨을 사용 포자 세포를 비교 하였다. 멀티 웰 플레이트의 사용은 ~ 80 %의 효율은 통상적으로 볼 수있는 플라스크에 포자 볼 때 높은 효율을 달성하지 않았다. (유리 비드 또는 교반 막대로 제공됨) 적합한 통기 멀티 웰 플레이트에서 포자 것은 최적의 결과 (66 % 효율)를 5mm X 2mm 교반 막대를 사용하여 수득으로 충분한 포자 효율을 50 % 이상을 달성 할 수있다. 두 개의 서로 다른 균주 (야생 유형 및 smk1Δ)의 대표적인 포자는 여기 (그림 1) 표시됩니다. 이 세포는 포자 형성 배지에서 36 시간 후에 검사하고 96 웰 유리 바닥 판을 사용하여 시각입니다.
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토론
여기에서 우리는 96 멀티 웰 형식으로 SK1 효모를 포자를위한 프로토콜을 제시한다. 폭기는 교반 막대 또는 아니라 각각의 유리 구슬 중 하나의 사용을 필요로 효율적인 포자 형성을위한 열쇠입니다. 세포가 비드 또는 교반 막대 하나없이 진탕 배양기에서 96 멀티 웰 플레이트에 포자 경우, 세포가 효율적으로 sporulate하지 않습니다. 세포가 비드 또는 (교반없이 30 ° C에서 표 1 인에 비해 진탕 배양기에서 교반 막대, 하나없이 포자 때 포자 효율 단지 작은 증가는 볼 수 10 % 대 통에 17 %가 혼란에 배치 플레이트). 마찬가지로, 7mm의 교반 막대의 사용은 7mm가 바 인해 인접 우물에 교반 막대와의 상호 작용에 제대로 문화를 공기에 쐬다하지 않았다 저어 가능성이 있기 때문에, 가난한 포자 형성 효율 (28 %) 결과. 이 프로토콜은 SPO을 연구하기 위해 일반적으로 사용되는 동기 효율적으로 포자 SK1 효모 균주 7,8를 사용하여 포자 형성을위한 조건을 설명ru.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없습니다.
감사의 글
이 작품은 NIH에서 매사추세츠 보스턴 (LSH) 및 R15 GM86805 대학 (LSH)에서 조셉 P. 힐리 보조금에 의해 지원되었다. SMP는 매사추세츠 보스턴 대학에서 사노피 - 젠 자임 원정대에 의해 부분적으로 지원됩니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Nunc 1.3 ml DeepWell 플레이트 | ThermoScientific | 260251 | 포자 형성에 사용 |
| Nunc 2.0 ml DeepWell 플레이트 | ThermoScientific | 278743 | 포자 형성 준비에 사용, 단계 1.2.3 |
| 3 mm 유리 비드 | Fisher | 11-312A | 포자 형성에 사용 |
| 5 mm x 2 mm 교반 막대, 12개 팩 | Fisher | 14-511-82 | 포자 형성에 사용 |
| 96 글쎄 개구리 | V & P Scientific | VP407 | 1.2 |
| 라이브러리 복사기 | V&에 필요합니다. P Scientific | VP381 | 1.2단계에 필요함; frogger |
| 직사각형 페트리 접시 | ThermoScientific | 264728 | 1.2단계에 필요 |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | 배지에 필요 |
| 효모 추출물 | BD | 212750 | 배지에 필요 |
| Bacto Agar | BD | 212750 | 배지에 필요 |
| 포도당 | 매체에 필요한 | D16-3 | |
| 아세테이트 칼 | 매체에 필요한 Fisher | P171-500 | 매체에 |
| 필요한 글리세롤 | Fisher | G33-500 | 매체에 필요한 |
| 검은색 96웰 유리 바닥 플레이트 | MatTek | PBK96G-1.5.5-F | 는 2.4단계에 필요합니다 |
참고문헌
- Marston, A. L. Chromosome segregation in budding yeast: sister chromatid cohesion and related mechanisms. Genetics. 196 (1), 31-63 (2014).
- Keeney, S., Lange, J., Mohibullah, N. Self-organization of meiotic recombination initiati....
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재인쇄 및 허가
