방법 논문

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DOI:

10.3791/54592

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2016년 12월 8일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, University Hospital Münster, 2Institute of Biochemistry, University of Münster

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기에서는 임피던스 세포 분광법을 사용하는 혈액-뇌 장벽의 체외 쥐 모델을 설명하며, 활성화된 T 세포와의 상호 작용 시 내피 세포 무결성 및 투과성에 미치는 영향에 중점을 둡니다.

초록

혈뇌장벽(BBB)의 파괴는 다발성 경화증(MS)과 같은 자가면역 질환 및 동물 모델 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)의 발병에 중요한 단계입니다. 이 과정은 BBB의 주요 구성 요소인 뇌 내피 세포(EC)를 가로질러 활성화된 T 세포의 전이가 특징이다. 그러나 이러한 T 세포와의 상호 작용에 대한 뇌 EC 기능에 미치는 영향은 대체로 알려져 있지 않습니다. 여기에서는 시간 경과에 따른 T 세포와의 상호 작용 중 일차 마우스 뇌 미세혈관 EC(MBMEC) 기능 및 장벽 무결성을 평가할 수 있는 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 경내피 전기 저항(TEER) 및 세포층 커패시턴스(Ccl)의 변화를 측정하여 EC 단층 무결성 및 투과성을 연구하기 위한 강력한 도구인 임피던스 세포 분광법을 사용합니다. EC와 직접 접촉하면 자극을 받았지만 미숙하지 않은 T 세포는 TEER의 감소와 Ccl의 증가로 시각화된 바와 같이 EC 단층 기능 장애를 유발할 수 있습니다. 이 분석은 지속적이고 자동화된 방식으로 EC 단층 무결성의 변화를 기록합니다. 이 단백질은 다양한 자극의 강도와 T 세포 활성화 수준을 구별할 수 있을 만큼 민감하며, 항체, 약리학적 시약 및 사이토카인과 같은 광범위한 물질을 사용하여 T 세포-EC 상호 작용의 표적 조절의 결과를 조사할 수 있습니다. 이 기술은 또한 in vitro T 세포 transmigration 분석에서 EC 무결성에 대한 품질 관리로 사용할 수 있습니다. 이러한 응용 프로그램은 생리학적 및 병태생리학적 조건에서 BBB 특성을 연구하기 위한 다목적 도구입니다.

서론

3 - 혈액 - 뇌 장벽은 중추 신경계 (CNS) 1 전신 순환을 분리한다. 그것은 세포의 자유 운동과 수용성 분자의 확산을 억제하고 병원체 및 잠재적 유해 물질로부터 뇌를 보호하는 물리적 장벽을 제공한다. 그 장벽 기능에 더하여, BBB는 신경 조직의 적절한 작동을 보장 뇌 실질 조직에 산소와 영양분의 전달을 가능하게한다. BBB를의 기능적 특성은 높은 고도로 전문화되는 EC는 주요 구조 부재 인 상태의 세포 및 무 세포 구성 요소에 의해 조절된다. BBB를되는 EC의 꽉 접합 (TJ) 착체, fenestrations의 부족 pinocytic 매우 낮은 활성 및 완전히 활성 전송 메커니즘의 존재를 특징으로한다. 내피 세포, 성상 세포 엔드 피트 = 관련된 파를 포함 기타 BBB의 구성 요소 EC 기저막, 혈관 주위 세포enchymal 기저막 또한 BBB 2,4의 개발, 유지 보수 및 기능에 기여 - (6)과 함께 뉴런과 마이크로 글 리아와 상기 CNS (7)의 적절한 기능을 가능하게하는 뇌 혈관 부 (NVU) 형성 - 9.

이러한 신경 변성, 염증 또는 감염 질환과 같은 신경 질환의 다양한에서 BBB의 기능을 손상 2,5,10. TJ 복합체 분자 반송기구의 이상 조절은 BBB 침투성 백혈구 혈관 외 유출, 염증 및 신경 손상을 증가하도록 이끈다. 이러한 병태 생리 학적 조건에서 BBB 특성을 연구하기 위해, 다양한 시험 관내 BBB 9,11,12 모델을 확립 하였다. 이들은 장벽 무결성, 투과성뿐만 아니라 전송 메커니즘의 변화에 ​​귀중한 통찰력을 제공하고 있습니다. 이 모델은 인간, 마우스, 쥐, 돼지 또는 b의 내피 세포를 사용양의 기원 13-18; 25 - 기본 내피 세포 또는 세포주 생체 (19)보다 밀접 BBB를 모방하기 위해 혈관 주위 세포 및 / 또는 성상 세포와 단종으로 또는 함께 두 배양한다. 최근 몇 년 동안, transendothelial 전기 저항 (봉사자)의 측정은 내피 차단 성 (26, 27)을 평가하기 위해 널리 허용 도구가되었습니다.

티이은 세포 단층을 가로 질러 이온 플럭스 임피던스를 반영하고 그 감소 손상된 내피 장벽 완전성 따라서 증가 된 투과성 민감한 척도를 제공한다. 30 - 다양한 티이 측정 시스템은 상피 Voltohmmeter (EVOM), 전지 셀 기판 임피던스 감지 (ECIS), 실시간 세포 분석 15,28 등이 개발되었다. 티이 인접되는 EC의 이온 플럭스 (paracellular 행)에 대한 내성을 반사하고 정비례장벽의 무결성. 임피던스 분광 27,31에서는 복잡한 총 임피던스 (Z)가 CCL을 측정함으로써 배리어의 무결성에 대한 추가 정보를 제공하는 측정된다. CCL은 세포막 (세포 횡단 경로)를 통해 용량 성 전류에 관한 것으로, 셀 층은 막의 양쪽에 전하를 분리하는 등가 전기 회로에 캐패시터와 같은 역할을하고 역 장벽 완전성에 비례한다. 투과성 인서트 상에 성장하면되는 EC가 부착 증식 미다 공막에 걸쳐. 이것은 (자체 커패시터처럼 동작)과 그것의 최소 레벨에 도달 할 때까지, 용량의 감소로 연결 삽입물의 배경 전류 용량 저항. 이것은 TJ의 설립 뒤에 것은 인접되는 EC 사이의 공간 떨어져 그 인감 복합체. 이 paracellular 경로를 통해 이온 플럭스를 제한하고, 그것의 고원에 도달 할 때까지 봉사자는 증가한다. 염증성 조건 하에서, 그러나, endotheli알 배리어가 손상되어 TJ가 방해받을 착물 삽입물의 용량 성 성분이 다시 상승을 CCL 증가로 티이 감소한다.

우리 티이 측정은 자동 세포 모니터링 시스템 (32)을 사용하여 그 임피던스 분광법의 원리를 따르고 이전 어플리케이션을 확장한다. 여기, 우리는 면역 세포와 뇌 내피 세포의 상호 작용을 포함하는 차단 성 연구를 가능하게하는 생체 외 BBB 모델을 설명; 특히 활성화 된 T 세포이다. 37 - 이러한 병태 생리 학적 조건은 다중 경화증 및 동물 모델 실험자가 면역 뇌척수염 (33)와 CNS의자가 면역 질환에서 관찰된다. 여기서, 중요한 단계는 전역 BBB encephalitogenic, 미엘린 특정 T 세포의 윤회이다. 이것은 뇌 실질에 혈관 주위 공간과 항목에서의 재 활성화 뒤에, 그들은 다른 면역 세포를 모집하고 저 곳diate 염증 및 후속 탈수 초화 1,35,38. 그러나, 이러한 T 세포와 내피 세포 간의 상호 작용의 분자 메커니즘은 BBB의 주성분은 잘 이해되지 않는다. 우리의 프로토콜은이 격차를 작성하고 활성화 된 T 세포와의 직접 접촉하고 복잡한 상호 작용에 따라 내피 세포 (즉, 장벽 무결성 및 투자율)의 결과에 대한 새로운 통찰력을 제공하는 것을 목표로하고있다.

여기에 설명 된 프로토콜은 미세 다공성 멤브레인 투과성 인서트에 단층으로 성장 기본 마우스 뇌 미세 혈관 내피 세포를 사용한다. 내피 세포를 공 배양된다 polyclonally 또는 항원 특이 적 방식으로 어느 사전 - 활성화 될 수있는 CD4 + T 세포와. 활성화 미리 아니지만 나이브 T 세포 MBMECs 공동 배양 티이 감소하고 MBMEC 부전 및 장벽 파괴의 정량적 측정 값을 제공 CCL의 증가를 유도한다. 기술비 침습적이다 : 그것은 내장 대신 EC 단층의 주요 교란을 방지 젓가락 전극의 사용; 세포 마커의 사용없이 장벽 기능을 모니터링하기 위해 사용될 수있다. 이 자동화 된 방식으로 연속적인 계측을 동시에 시간에 따른 두 개의 장벽 파라미터 (티이 및 CCL)의 독립적 인 평가를 가능하게한다. 상기 방법은 또한 다른 T 세포 활성화의 수준 및 EC를 그러한 T 세포의 효과를 구별 할 정도로 민감하다.

그것은 기능 분석의 넓은 범위에서 사용할 수있다 : 염증 과정에 연루 다른 사이토 카인 및 / 또는 케모카인은 MBMECs 및 T 세포의 공동 배양에 첨가 될 수있다; EC의 또는 T 세포 양측에 세포 부착 분자에 대한 차단 항체를 사용할 수있다; 및 T 세포 활성화 마커 또는 세포 용해 특성의 억제제는 T 세포 프라이밍 또는 내장 컴퓨터와의 공동 - 배양 동안 첨가 될 수있다. 분석은 T 세포 윤회에 유용분석법은 T 세포를 첨가하기 전에 MBMEC 단층 무결성 품질 관리 역할을 할 수있다. 이 모든 것은이 방법을 EC 단층 무결성 활성화 T 세포의 효과에 초점을 시험 관내에서 BBB를 연구하는 다용도 공구를 신뢰할 수있다. 이것은 자기 반응성 encephalitogenic T 세포는 BBB를 통과 염증 및 신경 손상을 일으킬 MS 및 동물 모델 EAE 같은자가 면역 질환의 발병 기전에서 BBB 중단의 메커니즘을 이해하는데 특히 중요하다.

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프로토콜

동물 보호를위한 독일 가이드 라인에 따라 모든 실험에서, 쥐 사육하고 뮌스터 대학의 중앙 동물 시설에서 특정 병원균이없는 조건에서 유지했다. 모든 실험은 동물 실험 윤리위원회의 지침에 따라 수행 노르 트라 인베스트 팔렌, 독일 (LANUV, AZ 84-02.05.20.12.217)의 지방 당국에 의해 승인되었다.

1. MBMEC 분리 및 문화

참고 : 이전에 다음과 같이 수정하여 상세 (14)에 설명 된대로 MBMECs을 분리 :

  1. CO 2 흡입 (6-8 주 이전) (20) 성인 C57BL / 6 마우스를 희생 심장 및 호흡 정지를 확인하는 그들의 죽음을 확인합니다.
  2. 70 % 에탄올로 마우스를 씻어 가위를 사용하여 목을 벨; 집게와 가위를 사용하여 두피를 제거합니다. 난원 매그넘부터 두개골의 좌우에 절개를 만든다. 그것의 꼬리 측과 탁에서 두개골을 들어 올려집게로 뇌를 전자.
  3. 층류 후드 만 피질 유지 페트리 접시에 뇌를 배치하고, 뇌간, 소뇌 및 시상을 제거 무균 핀셋을 사용한다.
    참고 : 현미경의 사용이 단계의 필요하지 않습니다.
  4. 멸균 웨스턴 블로 팅 종이 위에 피질을 놓고 수막 더 이상 볼 수 있습니다 때까지 핀셋으로 가볍게 롤하지 않습니다.
  5. (프로토콜 14 아래) 기계적 및 효소 분해 후 긴 멸균 바늘과 5 ml의 플런저를 사용하여 밀도 구배에서 내피 세포를 수집한다. 내피 세포는 적혈구와 레드 링 위의 어두운 층으로 나타납니다. 새로운 50 ㎖ 원심 분리 튜브에이 계층의 양도 20 ~ 25 ml의; DMEM과 튜브를 맨.
  6. 세탁기 (14)의 두 라운드 후, 퓨로 마이신을 함유 MBMEC 매체 (4 μg의 / ㎖)의 용액에 6 세포를 재현 탁하고, 24 웰 플레이트의 웰에 코팅 여섯을 시드; 조직에서 그들을 떠나37 ° C, 5 % CO 2 인큐베이터에서 배양을 사흘 동안 (여기서부터 "인큐베이터 '이라 함).
    참고 : MBMEC 코팅 용액의 자세한 내용은 자료 표를 참조하십시오.
  7. 퓨로 마이신없이 신선한 MBMEC 매체의 각 웰에 1 ml에 첨가하여 배지를 변경; 두 개 더 일 다시 37 ° C와 5 % CO 2의 접시를 넣어.

2. 수확 MBMECs

  1. MBMEC 분리 후 5 일째에, MBMEC 코팅액으로 미리 도포 투과성 인서트 : 인서트 당 용액 80 μl를 첨가하고 3 시간 동안 CO 2, 37 ℃ 그대로두고 5 %.
  2. 조심스럽게 코팅 용액을 피펫 30 분 동안 삽입 자연 건조를 할 수 있습니다. 매체 씻어 MBMECs을 사용하여 웰 플레이트의 각 실온 2 ㎖ (RT) PBS 추가; 이 단계를 반복합니다. 0.05 % 트립신 - EDTA (물론 당 300 μl를) 추가하고 5 ~ 10 분 동안 인큐베이터에서 접시를 둡니다.
  3. 중지 각 웰에 MBMEC 매체의 2 ML을 추가트립신. 15 ㎖의 원심 분리 튜브에 수집 된 세포를 전송하고 4 ℃에서 8 분 동안 700 XG에 그들을 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 퓨로 마이신없이 MBMEC 매체의 1 ml의 세포를 재현 탁.
  4. 세포를 계산; 0.04 % 트리 판 블루 90 μL (세포의 10 배 희석)와 세포 현탁액의 10 μl를 섞는다. 피펫 유리 커버 셀 카운팅 챔버 (혈구) 사이 혼합물 10 μL. 챔버 (N)의 네 사분면에 트리 판 블루 무료 세포를 카운트하고 카운트 세포 (N ')의 평균 수를 결정 다음과 같이 N'= N / 4.
  5. 다음 식을 사용하여 (106 세포 / ㎖로) 세포 농도를 계산 : C = N '× 104는 혈구의 크기에 의해 지정된 10 단계 2.4에서 희석 계수이다 × 10 × 104.
  6. 시드 인서트 당 260 μL의 부피에 2 × 104 세포. 물론 각각의 하부 구획에 MBMEC 매체의 810 μl를 추가. 섹션 4를 진행 준비가 될 때까지 인큐베이터에 삽입와 함께 접시를 놓습니다.
    참고 : 상부 및 하부 구획의 볼륨을 삽입 특정하고 모든 24 웰 형식에 대해 작동하지 않습니다.

3. CD4 + T 세포의 분리 및 자극

  1. CD4 + T 세포 분리
    1. CO 2 흡입에 의해 (6-8 주 이전) 성인 마우스를 희생 심장 및 호흡 정지를 확인하는하여 죽음을 확인합니다.
    2. 깨끗한 절개 보드의 뒷면에 마우스를 놓고 70 % 에탄올로 씻어; 비장과 림프절 (사타구니, 겨드랑이, 상완과 자궁 경부를) 복막을 열고 제거 멸균 가위와 집게를 사용; 마지막으로, 얼음 PBS 5 ㎖를 함유하는 15 mL의 원심 분리 튜브에 조직을 옮긴다.
    3. 층류 후드에서 상부에 70 μm의 셀 스트레이너와 50 ㎖ 원심 분리 튜브로 조직을 PBS로 경사 분리하여 조직을 전송; 균질화스트레이너를 통해 1 ML의 플런저를 눌러 조직.
    4. 4 ℃에서 5 분 동안 500 XG에 FACS 버퍼와 원심 분리기를 30 ML을 추가합니다. 상청액을 폐기하고 FACS 완충액 10ml에 세포를 재현 탁. 튜브에 FACS 버퍼의 또 다른 20 ㎖를 추가, 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 정지를 필터링합니다.
    5. 4 ℃에서 5 분 동안 500 XG에 그것을 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 FACS 버퍼 500 μL의 세포를 재현 탁.
    6. 마우스 CD4 자기 마이크로 비즈의 20 μl를 추가 잘 혼합하여 4 ℃에서 15 분 동안 품어. 4 ℃에서 5 분 동안 500 XG에 FACS 버퍼와 원심 분리기를 25 ML을 추가합니다.
    7. 한편, 자석 내로 LS 분리 컬럼을 배치하고 FACS 완충액 3 ㎖로 씻어. 뜨는을 취소하고 FACS 버퍼의 3 ml의 세포를 재현 탁.
    8. 컬럼에 셀을 추가합니다. 세 번 버퍼 FACS 3 ㎖에 열을 씻으십시오. 자석에서 열을 제거하고 새 15 ML의 센트리에 배치fugation 튜브. , FACS 버퍼의 5 ML을 추가 5 분 4 °에 C 500 XG에 열 플런저와 원심 분리기를 가진 레이블 세포를 세척합니다.
    9. 상층 액을 제거하고 T 세포의 배지 3 ㎖에 세포를 재현 탁. 웰당 배지 100 ㎕에 2.4 종자에 1 × 105 세포를 바와 같이 세포를 카운트.
  2. CD4 + T 세포 자극
    1. 클론 성 CD4 + T 세포 자극
      1. 사전 코트 원하는 최종 농도에서 정제 된 항 - 마우스 CD3 항체 PBS에서 (복제 145-2C11)와 둥근 바닥 96 웰 플레이트. 예를 들어, 1 μg의 / ㎖에서 α-CD3와 전체 판 코트를 미리하는 PBS, 소용돌이의 5 ml의 항체의 10 μL (주 농도 = 0.5 ㎎ / ㎖)을 혼합하여 혼합의 50 μl를 추가 잘 멀티 채널 피펫 각.
      2. 3 시간 동안 인큐베이터에있는 접시를 남겨주세요. T 세포를 분리 한 후, PBS로 두 번 프리 코팅 된 플레이트를 세척한다. (복제 정제 된 항 CD28 항체 추가원하는 최종 농도 절연 T 세포 (행 37.51) 예를 들면, 1 μg의 / ㎖)에서; 잘 섞다. T 세포를 시드 및 2-3 일 동안 인큐베이터에서 그들을 떠난다.
    2. 수지상 세포와 항원 특이 적 CD4 + T 세포 자극
      참고 : DC가 항원 제시 세포 (장갑차)로 사용하는 경우, 이러한 예외를 제외하고, T 세포 분리를위한 프로토콜을 따르십시오
      1. 비장을 균질화하기 전에, 0.5 ㎎ / ㎖로 PBS에 콜라게나 형 IA 1 ㎖로 주입하고, 15 mL의 원심 분리 튜브로 옮긴다.
      2. 15 분간 37 ℃ 수조에서 인큐베이션. PBS로 세척 한 후, FACS 버퍼에 펠렛을 재현 탁하고 20 마우스의 CD11c 자성 마이크로 비즈의 μL 대신 CD4 마이크로 비드를 추가합니다.
      3. 석사 분리 컬럼 및 적절한 볼륨을 사용하여 FACS 버퍼 1 ㎖에 열을 씻어; FACS 완충액 1 ㎖에 재현 탁하고 세포를 FACS 완충액 3 회 1 ㎖로 칼럼을 세척 하였다.
      4. 광고수지상 세포 (예를 들면, 수초 희소 돌기 아교 세포 당 단백질 (MOG) AA 35-55 20 μg의 / ㎖)에 대한 선택의 D 항원이 잘 혼합 종자 5 × 104 세포 T 세포 배양액 100 ㎕에 당 96 라운드 - 바텀 잘.
      5. 프로토콜 T에 대한 세포 분리에 기재된 바와 같이, 끝 부분 96 둥근 바닥 웰 당 T 세포 배양액 100 ㎕에 1 × 105 T 세포를 추가한다.
    3. B 세포 항원 특이 적 CD4 + T 세포 자극
      참고 : B 세포 장갑차로 사용하는 경우, 이러한 예외를 제외하고, T 세포 분리를위한 프로토콜을 따르십시오
      1. 누구의 B 세포 (B 세포 특히 MOG 35-55을 인식 예를 들어, IGH MOG (목) 마우스,) 항원 - 특정 형질 전환 마우스에서 비장을 사용합니다.
      2. (TCR MOG (2D2) 생쥐에서 예) 항원 특이 적 T 세포를 사용한다. 마우스 CD19 자기 마이크로 비드 대신 CD4 마이크로 비드의 20 μl를 추가합니다.
      3. 는 B CEL에 선택의 항원을 추가LS (예, 20 μg의 / ㎖에서 MOG 35-55)은 96 둥근 바닥 웰 당 B 세포 배양액 100 ㎕를 5 × 104 세포를 잘 혼합 종자.
      4. 당 T 세포 배양액 100 ㎕에 1 × 105 T 세포를 추가 96 둥근 바닥 웰, T 세포의 분리를위한 프로토콜에 기술 된 바와 같이.

4. 설치 및 봉사자 측정을 수행

  1. 층류 후드 아래 봉사자 상품의 24 웰 모듈을 놓습니다. 집게를 사용하여 기기에 MBMECs으로 뚜껑과 장소 삽입물을 제거합니다.
  2. 모듈 우물의 하부 구획에 새로운 매체의 810 μl를 피펫 : 삽입 잘 모듈의 벽 사이에 조심스럽게 추가합니다.
  3. 뚜껑을 닫고 인큐베이터에서 악기를 배치합니다. 그 컴퓨터에 기기를 연결; 악기 컨트롤러를 켜고 소프트웨어를 엽니 다.
  4. 팝업 창에서 '새로운 측정'을 선택합니다. 체CK '쇼 봉사자'와 '쇼 CCL'상자; 다음 Enter 키를 눌러 '시작'. 첫 번째 측정을 완료 한 후, 모든 봉사자 및 CCL 값을 볼 수있는 '결과'탭에서 '모든 우물을 검사'를 선택합니다.
  5. '파일 이름'> 다른 이름으로 저장> 파일 : 파일을 저장합니다.
    주 : 티이 및 CCL 연속적 자동화 된 방식으로 측정 된 바와 같이, 3 내지 5 일의 기간에 걸쳐 이들 값을 감시한다. 세포 생존 능력이 최적이 아닌 봉사자의 증가의 부족에 의해 시각으로 매체를 변경하면, 필요하지 않습니다.
  6. CCL은 안정 미만 1 μF / cm 2이고, 티이가 최대 레벨에 도달 할 때 T 세포 MBMECs 공동 배양하기위한 시점을 선택한다.
  7. 조심스럽게 절대 봉사자 및 CCL 값을 검사하고 MBMECs는 우물을 취소하여 합류 충분히 단일 층을 개발하지 않은있는 우물을 제외 할 수 있습니다.
  8. 그룹 우물의 나머지 : 잘 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 '새 평균 아니라 잘 추가'를 선택합니다. 남팝업 창에 전자; 모든 개별 웰 그룹화하는 동일한 기능을 수행.
  9. 그들 모두가 공동 문화 이전과 같은 초기 조건이 있는지 확인하기 위해 평균 우물을 확인합니다. 어떤 유의 한 차이의 절대 값 티이 있거나 티이 경사면, 또는 표준 오차가 너무 큰 경우, 그룹핑을 다시.
    참고 : 우물의 최적의 그룹 내에서 실험 그룹 사이에 모두 봉사자 값에 최소한의 변화를 제공합니다.
  10. '실험'탭을 눌러 '일시 정지', 악기를 분리하고 인큐베이터 밖으로 가져 가라. 층류 후드 아래에 뚜껑을 제거합니다.
  11. 준비 미리 활성화 원하는, 또는 특정 사이토 카인, 항체 또는 다른 물질없이 그리고 / 또는 나이브 T 세포 : 제조 T 그래피 믹스 NA / LE 래트 항 마우스 IFN-γ 항체 (클론 XGM1.2) 예를 들어 세포의 봉사자 악기의 웰 당 20 μg의 / ㎖에서.
    참고 사항 : 그랜 자임 B 억제제 같은 물질을 사용하는 경우, 그들은되는T 세포 자극의 처음에 T 세포 배양 dded : 예, 그랜 자임 B 억제제 II (Calbiochem 사)를 DMSO 10 μM의 최종 농도 절연 T 세포와 혼합된다. 자세한 내용은 재료 및 장비를 참조하십시오.
  12. 삽입의 매체 (상부 잘 함)의 일부를 제거 (가 MBMEC 단일 층을 방해 할 수있는 모든 매체가 피해야한다 제거) 예를 들어, 조심스럽게 150 μL를 피펫.
  13. 조심스럽게 2 × 10 5 세포 / 삽입을 포함하는 배지 150 μl를 피펫 팅에 의해 MBMECs에 T 세포를 추가합니다.
    주 : 사전 활성화 된 T 세포를 수확하는 경우에만, 트리 판 블루 세포 무 발파를 계산.
  14. 뚜껑을 닫고 다시 인큐베이터에 악기를 배치합니다. 악기를 눌러 '이력서 측정'을 다시 연결합니다. 하고 '실험'탭에서 24 시간을 눌러 '정지'후 파일 (파일> 저장)를 저장합니다.

5. 데이터 내보내기 및 통계 분석

  1. [파일]> [내보내기]를 선택하여 결과를 내 보냅니다.
  2. 팝업 윈도우의 "설정"탭에서 "필드 구분 기호"옵션에서 "소수 구분"옵션 "을 .dot"와 "도표 작성"을 선택합니다.
  3. "내보내기 결과"탭에서, 파일 이름을 모든 우물을 내보낼 확인하고 "데이터 선택"옵션에서 "봉사자"및 "CCL"확인란을 선택합니다.
  4. 보도는 "수출 데이터는"내 보낸 파일을 열고, 스프레드 시트에 데이터를 복사합니다.
  5. 공동 문화 전에 마지막 시점의 설정 봉사자 및 CCL 값을 100 %로 다른 모든 위해 따라 값을 변경 : (각 실행 (측정 주어진 봉사자 및 CCL 값으로, 각 복제으로 분류)) 내 보낸 데이터를 정상화 '100 %'실행에 대해 실행됩니다.
  6. 개별 웰을 이용하여 각 처리 군에 대한 평균의 표준 오차를 표시하는 그래프를 생성하기 원하는 소프트웨어 정규화 된 데이터를 복사한다.
  7. 피선택의 통계 소프트웨어를 사용하여 다중 비교에 대한 페로 니 보정과 양방향 ANOVA 통계 테스트를 erform.

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결과

도 1은 T 세포와 내피 세포 간의 상호 작용을 연구하는데 사용되는 시험 관내 BBB 모델의 일반적인 개요를 제공한다. 실험은 세 가지 주요 단계로 구성됩니다. 첫 번째 단계는 뇌 피질에서 기본 MBMECs 단리하고, 5 일 동안 문화이다. 이들이 세포 배양 접시에서 컨 플루 언스에 도달하면 MBMECs는 트립신 처리하고 티이 구에 배치 투과성 인서트로 시드된다. 봉사자와 MBMECs의 CCL은 연속적으로 측정하고 3 ~ 5 일의 기간 동안 모니터링됩니다. 한편, T 세포는 고립 자극 (2 단계), 그리고 2 ~ 5 일, 종류와 자극의 강도 배양. 단계 3에서, T 세포에 첨가하고, CCL 안정된 로우 레벨이고 티이이 최대 레벨 일 때 MBMECs 함께 공동 - 배양 하였다. 봉사자가 고원에서 아직 공동 문화에 대해이 시점을 선택하는 것은 성공을 위해 매우 중요하다전체 측정. 그 T 세포는 ECS에 그들의 첨가시 활성화하여...

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토론

기술 된 프로토콜의 여러 단계를 성공적으로 실험에 필수적이다. 초기 MBMEC 분리 및 배양 동안, 작업 진균 포자 또는 세균 세포 배양의 오염을 방지하기 위해, 가능한 멸균 조건 하에서 수행하는 것이 중요하다. 내장 컴퓨터의 순수 배양을 얻기 위해서는이되는 EC 생존 가능 제 사흘 퓨로 마이신을 함유하는 배지가 아닌 다른 세포 유형 (특히 혈관 주위 세포) (41, 42)을 사용하도록 권장한다. 특별한주의 가치 다른 중요한 단계는 사전 - 활성화 된 T 세포를 추가하는 정확한 시점을 식별한다. 봉사자 측정 MBMECs의 첫 48 시간 동안 투과 삽입에 증식과 서로 간의 간격을 닫습니다. 안정된 낮은 수준 (약 0.6 μF / cm 2)에 도달 할 때까지 따라서, CCL은 감소한다. 이 합류 EC 단층의 첫 징후이지만, 아직 단단한 장벽의 상징이 아니다. 후에 만CCL을은 봉사자가 증가하기 시작 않는 안정적인 수준에 도달했습니다. TJ 착체가 완전히 형성되고 EC 배리어가 완전히 밀폐되면...

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공개 사항

I. Kuzmanov, A. M. Herrmann, S.G. Meuth, H. Wiendl 및 L. Klotz는 공개할 것이 없습니다. H.-J. Galla는 자동 세포 모니터 제조업체인 nanoAnalytics GmbH의 과학 고문입니다.

감사의 글

우리는 봉사자 측정에 관한 도움이 토론 아니카 Engbers과 우수한 기술 지원을위한 프랭크 커스 박사 마르쿠스 SCHAFER (nanoAnalytics GmbH의)에 감사하고 있습니다. 이 작품은, HW 및 LK, CRC TR128에 SFB1009 프로젝트 A03는 A08 돌출 독일 연구 협회 (DFG)에 의해 지원되었다; Z1 및 B01는 LK 및 LK에 HW 및 (뮌스터의 의료 학부) 임상 연구를위한 학제 ​​간 센터 허가 번호 KL2 / 14분의 2,015합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
cellZscopenanoAnalytics GmbHwww.nanoanalytics.com포함: 24웰 셀 모듈, 컨트롤러, cellZscope 소프트웨어 v2.2.2가 설치된 PC 
초원심분리기Thermo Scientificwww.thermoscientific.comSORVALL RC 6+; 로터 F21S-8x50y; MBMEC 분리
유세포 분석기Beckman Coulterwww.beckmancoulter.comT 세포 전이 분석을 위한
FlowJoJo7.6.5 소프트웨어Tree Starwww.flowjo.comT 세포 형질전환 분석을 위한
Oak Ridge 원심분리기 튜브, PCThermo Fisher Scientific3118-005050 ml; MBMEC 절연용
Transwell 멤브레인 인서트 - 기공 크기 0.4 &마이크로; mCorning3470TEER 측정을 위한 주요 판독 Transwell
멤브레인 인서트 - 기공 크기 3 &마이크로; MCorning3472는 T 세포 전이 분석 전 품질 관리로 TEER 측정을 수행하며,
24웰 세포 배양 플레이트Greiner650 180flat-bottom; MBMEC 배양
96웰 세포 배양 플레이트Costar3526round-bottom; 면역 세포 배양용
QuadroMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-090-976T 세포 및 B 세포 분리용; 지지대 MACS LS 컬럼
OctoMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-042-109수지상 세포 분리;세포 계수를 위한 MACS MS 컬럼
Neubauer 계수 챔버MarienfeldMF-0640010
세포 스트레이너, 70 µ m면역 세포 분리를 위한Corning352350
세포 스트레이너, 40 &마이크로; 면역세포 분리를 위한m Corning352340
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303면역 세포 격리를 위한
MACS LS 분리 컬럼세포 및 B 세포 분리를 위한Miltenyi Biotec130-042-401
MACS MS 분리 컬럼세포 분리를 위한Miltenyi Biotec130-042-201
마우스 CD4 MicroBeadsMiltenyi Biotec130-049-201CD4+ T 세포 격리
마우스 CD19 MicroBeadsMiltenyi Biotec130-052-201B 세포 분리
마우스 CD11c MicroBeadsMiltenyi Biotec130-052-001수지상 세포 분리
인간 태반의 콜라겐 IVSigmaC5533MBMEC 코팅 용액
Fibronectin 소 플라즈마SigmaF1141-5MGMBMEC 코팅 용액
Collagenase 2 (CSL2)WorthingtonLS004176MBMEC 격리
Collagenase/Dispase (C/D)Roche11097113001MBMEC 절연
DNase ISigmaDN25MBMEC 절연
Fetal bovine Serum (FBS)SigmaF7524MBMEC 절연
소 혈청 알부민 (BSA)Amresco0332-100GMBMEC 분리용
PercollSigmaP1644-1LMBMEC 분리용
DMEM (+ GlutaMAX)MBMEC 분리 및 MBMEC 배양 배지용Gibco31966-021
페니실린/스트렙토마이신시그마P4333MBMEC 분리 및 MBMEC 배양 배지
인산염 완충 MBMEC 및 면역 세포 분리를 위한SigmaD8537
MBMEC 배양 배지를 위한HeparinSigma H3393
Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)MBMEC 배양 배지를 위한PeproTech100-18B
PuromycinSigmaP8833; 처음 3일 동안만
0.05% Trypsin-EDTAGibco25300-054MBMEC 수확용
콜라겐분해효소 IA형시그마C9891수지상 세포 분리용
Trypan Blue 용액, 세포 계수용 0.4%Thermo Fisher Scientific15250061
면역 세포 분리를 위한EDTASigmaE5134
T 세포 배양 배지 X-VIVO용1% L-글루타민Gibco21980-032
15LonzaBE04-418Q빛으로부터 보호합니다; B 세포 배양 매체
&베타;-메르캅토에탄올Gibco31350-010B 세포 배양 매체
L-글루타민 (100x Glutamax)Gibco35050-061B 세포 배양 배지
마우스 MOG35— 55 펩타이드BiotrendBP0328항원 특이적 T 세포 활성화를 위한
정제된 안티 마우스 CD3 AbBioLegend100302클론 145-2C11; 다클론 T 세포 활성화를 위해
정제된 NA/LE 안티 마우스 CD28 AbBD Pharmingen553294클론 37.51; 다클론 T 세포 활성화를 위해
재조합 쥐 IFN-γT-세포 전이분석 재PeproTech315-05
;T-세포 전이분석PeproTech315-01A
; 항체BD Biosciences554408클론 XMG1.2; 권장 최종 농도: 20 &마이크로; g/ml
Granzyme B 억제제 IICalbiochem368055권장 최종 농도: 10 &마이크로; M
PE 안티 마우스 CD4 항체Biolegend116005클론 RM4-4; T 세포 형질전환 분석용
용 지원 T 수지상 유형 식염수(PBS) MBMEC 배양 배지를 위한IMDM + 는 조합 쥐 TNF-&알파를 위한 NA/LE 정제 안티-마우스 IFN-&감마를 위한

참고문헌

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