체외 임피던스 분광학을 사용하여 혈액 - 뇌 장벽 모델 : T 세포 - 내피 세포 상호 작용에 초점

Summary

여기에서는 임피던스 세포 분광법을 사용하는 혈액-뇌 장벽의 체외 쥐 모델을 설명하며, 활성화된 T 세포와의 상호 작용 시 내피 세포 무결성 및 투과성에 미치는 영향에 중점을 둡니다.

Abstract

혈뇌장벽(BBB)의 파괴는 다발성 경화증(MS)과 같은 자가면역 질환 및 동물 모델 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)의 발병에 중요한 단계입니다. 이 과정은 BBB의 주요 구성 요소인 뇌 내피 세포(EC)를 가로질러 활성화된 T 세포의 전이가 특징이다. 그러나 이러한 T 세포와의 상호 작용에 대한 뇌 EC 기능에 미치는 영향은 대체로 알려져 있지 않습니다. 여기에서는 시간 경과에 따른 T 세포와의 상호 작용 중 일차 마우스 뇌 미세혈관 EC(MBMEC) 기능 및 장벽 무결성을 평가할 수 있는 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 경내피 전기 저항(TEER) 및 세포층 커패시턴스(Ccl)의 변화를 측정하여 EC 단층 무결성 및 투과성을 연구하기 위한 강력한 도구인 임피던스 세포 분광법을 사용합니다. EC와 직접 접촉하면 자극을 받았지만 미숙하지 않은 T 세포는 TEER의 감소와 Ccl의 증가로 시각화된 바와 같이 EC 단층 기능 장애를 유발할 수 있습니다. 이 분석은 지속적이고 자동화된 방식으로 EC 단층 무결성의 변화를 기록합니다. 이 단백질은 다양한 자극의 강도와 T 세포 활성화 수준을 구별할 수 있을 만큼 민감하며, 항체, 약리학적 시약 및 사이토카인과 같은 광범위한 물질을 사용하여 T 세포-EC 상호 작용의 표적 조절의 결과를 조사할 수 있습니다. 이 기술은 또한 in vitro T 세포 transmigration 분석에서 EC 무결성에 대한 품질 관리로 사용할 수 있습니다. 이러한 응용 프로그램은 생리학적 및 병태생리학적 조건에서 BBB 특성을 연구하기 위한 다목적 도구입니다.

Introduction

^{3 -} 혈액 - 뇌 장벽은 중추 신경계 (CNS) ¹ 전신 순환을 분리한다. 그것은 세포의 자유 운동과 수용성 분자의 확산을 억제하고 병원체 및 잠재적 유해 물질로부터 뇌를 보호하는 물리적 장벽을 제공한다. 그 장벽 기능에 더하여, BBB는 신경 조직의 적절한 작동을 보장 뇌 실질 조직에 산소와 영양분의 전달을 가능하게한다. BBB를의 기능적 특성은 높은 고도로 전문화되는 EC는 주요 구조 부재 인 상태의 세포 및 무 세포 구성 요소에 의해 조절된다. BBB를되는 EC의 꽉 접합 (TJ) 착체, fenestrations의 부족 pinocytic 매우 낮은 활성 및 완전히 활성 전송 메커니즘의 존재를 특징으로한다. 내피 세포, 성상 세포 엔드 피트 = 관련된 파를 포함 기타 BBB의 구성 요소 EC 기저막, 혈관 주위 세포enchymal 기저막 또한 BBB ^2,4의 개발, 유지 보수 및 기능에 기여 ^{- (6)과} 함께 뉴런과 마이크로 글 리아와 상기 CNS ^(7)의 적절한 기능을 가능하게하는 뇌 혈관 부 (NVU) 형성 ^{- 9.}

이러한 신경 변성, 염증 또는 감염 질환....

Protocol

동물 보호를위한 독일 가이드 라인에 따라 모든 실험에서, 쥐 사육하고 뮌스터 대학의 중앙 동물 시설에서 특정 병원균이없는 조건에서 유지했다. 모든 실험은 동물 실험 윤리위원회의 지침에 따라 수행 노르 트라 인베스트 팔렌, 독일 (LANUV, AZ 84-02.05.20.12.217)의 지방 당국에 의해 승인되었다.

1. MBMEC 분리 및 문화

참고 : 이전에 다음과 같이 수정하여 상세 ^(14)에 설명 된대로 MBMECs을 분리 :

1. CO ₂ 흡입 (6-8 주 이전) (20) 성인 C57BL / 6 마우스를 희생 심장 및 호흡 정지를 확인하는 그들의 죽음을 확인합니다.
2. 70 % 에탄올로 마우스를 씻어 가위를 사용하여 목을 벨; 집게와 가위를 사용하여 두피를 제거합니다. 난원 매그넘부터 두개골의 좌우에 절개를 만든다. 그것의 꼬리 측과 탁에서 두개골을 들어 올려집게로 뇌를 전자.
3. 층류 후드 만 피질 유지 페트리 접시에 뇌를 배치하고, 뇌간, 소뇌 및 시상을 제거 무균 핀셋을 사용한다.
   참고 : 현미경의 사용이 단계의 필요하지 않습니다.
4. 멸균 웨스턴 블로 팅 종이 위에 피질을 놓고 수막 더 이상 볼 수 있습니다 때까지 핀셋으로 가볍게 롤하지 않습....

Results

도 1은 T 세포와 내피 세포 간의 상호 작용을 연구하는데 사용되는 시험 관내 BBB 모델의 일반적인 개요를 제공한다. 실험은 세 가지 주요 단계로 구성됩니다. 첫 번째 단계는 뇌 피질에서 기본 MBMECs 단리하고, 5 일 동안 문화이다. 이들이 세포 배양 접시에서 컨 플루 언스에 도달하면 MBMECs는 트립신 처리하고 티이 구에 배치 투과성 인서트로 시드된다. 봉사자와 MBMECs의 CCL은 연속적으로 측정하고 3 ~ 5 일의 기간 동안 모니터링됩니다. 한편, T 세포는 고립 자극 (2 단계), 그리고 2 ~ 5 일, 종류와 자극의 강도 배양. 단계 3에서, T 세포에 첨가하고, CCL 안정된 로우 레벨이고 티이이 최대 레벨 일 때 MBMECs 함께 공동 - 배양 하였다. 봉사자가 고원에서 아직 공동 문화에 대해이 시점을 선택하는 것은 성공을 위해 매우 중요하다전체 측정. 그 T 세포는 ECS에 그들의 첨가시 활성화하여.......

Discussion

기술 된 프로토콜의 여러 단계를 성공적으로 실험에 필수적이다. 초기 MBMEC 분리 및 배양 동안, 작업 진균 포자 또는 세균 세포 배양의 오염을 방지하기 위해, 가능한 멸균 조건 하에서 수행하는 것이 중요하다. 내장 컴퓨터의 순수 배양을 얻기 위해서는이되는 EC 생존 가능 제 사흘 퓨로 마이신을 함유하는 배지가 아닌 다른 세포 유형 (특히 혈관 주위 세포) ^{(41, 42)을} 사용하도록 권장한다. 특별한주의 가치 다른 중요한 단계는 사전 - 활성화 된 T 세포를 추가하는 정확한 시점을 식별한다. 봉사자 측정 MBMECs의 첫 48 시간 동안 투과 삽입에 증식과 서로 간의 간격을 닫습니다. 안정된 낮은 수준 (약 0.6 μF / cm ^2)에 도달 할 때까지 따라서, CCL은 감소한다. 이 합류 EC 단층의 첫 징후이지만, 아직 단단한 장벽의 상징이 아니다. 후에 만CCL을은 봉사자가 증가하기 시작 않는 안정적인 수준에 도달했습니다. TJ 착체가 완전히 형성되고 EC 배리어가 완전히 밀폐되면.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
cellZscope	nanoAnalytics GmbH	www.nanoanalytics.com	포함: 24웰 셀 모듈, 컨트롤러, cellZscope 소프트웨어 v2.2.2가 설치된 PC
초원심분리기	Thermo Scientific	www.thermoscientific.com	SORVALL RC 6+; 로터 F21S-8x50y; MBMEC 분리
유세포 분석기	Beckman Coulter	www.beckmancoulter.com	T 세포 전이 분석을 위한
FlowJoJo7.6.5 소프트웨어	Tree Star	www.flowjo.com	T 세포 형질전환 분석을 위한
Oak Ridge 원심분리기 튜브, PC	Thermo Fisher Scientific	3118-0050	50 ml; MBMEC 절연용
Transwell 멤브레인 인서트 - 기공 크기 0.4 &마이크로; m	Corning	3470	TEER 측정을 위한 주요 판독 Transwell
멤브레인 인서트 - 기공 크기 3 &마이크로; M	Corning	3472	는 T 세포 전이 분석 전 품질 관리로 TEER 측정을 수행하며,
24웰 세포 배양 플레이트	Greiner	650 180	flat-bottom; MBMEC 배양
96웰 세포 배양 플레이트	Costar	3526	round-bottom; 면역 세포 배양용
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-090-976	T 세포 및 B 세포 분리용; 지지대 MACS LS 컬럼
OctoMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-109	수지상 세포 분리;세포 계수를 위한 MACS MS 컬럼
Neubauer 계수 챔버	Marienfeld	MF-0640010
세포 스트레이너, 70 µ m	면역 세포 분리를 위한	Corning	352350
세포 스트레이너, 40 &마이크로; 면역	세포 분리를 위한	m Corning	352340
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	면역 세포 격리를 위한
MACS LS 분리 컬럼	세포 및 B 세포 분리를 위한	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS MS 분리 컬럼	세포 분리를 위한	Miltenyi Biotec	130-042-201
마우스 CD4 MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-049-201	CD4+ T 세포 격리
마우스 CD19 MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-052-201	B 세포 분리
마우스 CD11c MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-052-001	수지상 세포 분리
인간 태반의 콜라겐 IV	Sigma	C5533	MBMEC 코팅 용액
Fibronectin 소 플라즈마	Sigma	F1141-5MG	MBMEC 코팅 용액
Collagenase 2 (CSL2)	Worthington	LS004176	MBMEC 격리
Collagenase/Dispase (C/D)	Roche	11097113001	MBMEC 절연
DNase I	Sigma	DN25	MBMEC 절연
Fetal bovine Serum (FBS)	Sigma	F7524	MBMEC 절연
소 혈청 알부민 (BSA)	Amresco	0332-100G	MBMEC 분리용
Percoll	Sigma	P1644-1L	MBMEC 분리용
DMEM (+ GlutaMAX)	MBMEC 분리 및 MBMEC 배양 배지용	Gibco	31966-021
페니실린/스트렙토마이신	시그마	P4333	MBMEC 분리 및 MBMEC 배양 배지
인산염 완충	MBMEC 및 면역 세포 분리를 위한	Sigma	D8537
MBMEC 배양 배지를 위한	Heparin		Sigma H3393
Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	MBMEC 배양 배지를 위한	PeproTech	100-18B
Puromycin	Sigma	P8833	; 처음 3일 동안만
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	MBMEC 수확용
콜라겐분해효소 IA형	시그마	C9891	수지상 세포 분리용
Trypan Blue 용액, 세포 계수용 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250061
면역 세포 분리를 위한	EDTA	Sigma	E5134
T 세포 배양 배지 X-VIVO용	1% L-글루타민	Gibco	21980-032
15	Lonza	BE04-418Q	빛으로부터 보호합니다; B 세포 배양 매체
&베타;-메르캅토에탄올	Gibco	31350-010	B 세포 배양 매체
L-글루타민 (100x Glutamax)	Gibco	35050-061	B 세포 배양 배지
마우스 MOG35— 55 펩타이드	Biotrend	BP0328	항원 특이적 T 세포 활성화를 위한
정제된 안티 마우스 CD3 Ab	BioLegend	100302	클론 145-2C11; 다클론 T 세포 활성화를 위해
정제된 NA/LE 안티 마우스 CD28 Ab	BD Pharmingen	553294	클론 37.51; 다클론 T 세포 활성화를 위해
재조합 쥐 IFN-γ	T-세포 전이분석 재	PeproTech	315-05
;	T-세포 전이분석	PeproTech	315-01A
; 항체	BD Biosciences	554408	클론 XMG1.2; 권장 최종 농도: 20 &마이크로; g/ml
Granzyme B 억제제 II	Calbiochem	368055	권장 최종 농도: 10 &마이크로; M
PE 안티 마우스 CD4 항체	Biolegend	116005	클론 RM4-4; T 세포 형질전환 분석용