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방법 논문

치료를 위해 혈액 망막 장벽 위반 및 잠재적 인 마약을 평가하는 급성 망막 모델

6.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/54619

⸱

2016년 9월 13일

 ,  ,  , 
1Graduate School of Biomedical Sciences, Rowan University, 2Department of Cell Biology, Rowan University School of Osteopathic Medicine

이 논문에서

요약

낮은 - 비용, 사용하기 쉽고 강력한 시스템은 히스타민에 의해 유도 된 혈액 망막 장벽 위반을 개선 할 수 잠재적 인 치료를 평가하기 위해 설립된다. 혈관 누수, 뮐러 세포 활성화 및 신경 프로세스의 연속성 잠재적 약물 폭신 (lipoxin) A4를 갖는 손상 응답 및 역전을 평가하기 위해 이용된다.

초록

혈액 망막 장벽 파괴를 개선할 수 있는 잠재적 치료법을 평가하기 위해 저렴하고 사용하기 쉽고 강력한 모델 시스템이 구축되었습니다. 염증 인자인 히스타민(histamine)은 혈관 밖에서 IgG의 양성 염색을 통해 배양된 망막의 혈관 무결성을 손상시키는 것으로 입증되었습니다. 히스타민 자체와 리폭신 A4와 같은 잠재적 치료제를 위한 후보 약물의 효과는 IgG 면역 염색을 통한 혈관 누출, GFAP 염색을 통한 뮐러 세포 활성화, MAP2 염색을 통한 신경 수상돌기의 변화라는 세 가지 매개변수를 사용하여 평가됩니다. 또한, 망막의 층상 조직은 뮐러와 신경절 세포의 폭과 연속성의 변화와 같은 과정을 자세히 분석할 수 있게 해줍니다. 제시된 데이터는 돼지 망막 배양에 관한 것이지만 이 시스템은 여러 종에 적용할 수 있습니다. 따라서 이 모델은 다양한 세포 유형에 대한 손상된 망막 혈관 무결성의 초기 효과를 조사하고 치료를 위한 잠재적 약물 후보를 평가할 수 있는 신뢰할 수 있는 도구를 제공합니다.

서론

증거의 성장 몸은 혈액 망막 장벽 (BRB) 1-5과 혈액 뇌 장벽 (BBB) ​​6,7과의 유사성의 존재를 지원합니다. BBB를의 타협은 단단히 이러한 정신 착란 (10)로 인과 적 또는 알츠하이머 병 (AD)과 같은 만성 신경 퇴행성 질환에 대한 진단 마커로 8,9 급성 조건을 연결되어 있습니다. 잠재적 인 약물 표적에 대한 이러한 병리 및 발견에 기계적인 통찰력은 일반적으로 뇌의 제한된 액세스 및 네트워크 복잡함에 의해 방해된다. 이러한 생체 내 이미징 (11), 뇌의 Organotypic 문화 (12), 차 세포 배양 13, 14 및 공동 문화 시스템 (15)과 같은 대안이 생성되었습니다. 그러나, 이러한 모델의 대부분은 세포를 식별하는 특수 장비, 긴 실험 기간 또는 여러 개의 마커를 필요로한다. 기능적 및 구조적 및 BBB BRB 유사성뿐만 아니라 DY 간의 상관이 둘의 sfunctions는 16-19을 주장하고있다. 또한, 쉽게 액세스 잘 정의 세포 유형 및 적층 구조는 뇌 윈도우로 잘 특성화 망막 수있다. BBB를하고 BRB의 구조적 및 기능적 아이덴티티 상세히 비교 남아. 그러나, 망막 병증은 특히 BRB 파기는 또한 밀접 당뇨병 18-19 및 AD (21, 22)을 포함하는 다양한 질병의 진행과 연관되어있다. 따라서, BRB는 부전 시스템 메커니즘을 묘사 할뿐만 아니라 잠재적 인 약물 스크리닝뿐만 아니라 확립 관심사이다. 이 보고서에서, 단순 급성 망막 문화를 사용하여 프로토콜 가능 BRB 부전을 개발하고 제공됩니다.

증가 BBB 투과성 및 AD와 같은 병리학 적 변화는 히스타민, 프로 염증 중재자 (12)와 함께 배양 뇌의 Organotypic 문화에 설립되었습니다. 따라서, 표시 시스템에서, 히스타민은 APPL이었다BRB 부전을 유도하기 위해 생체 망막 문화 IED. 이러한 뮤스의 musculus과 보스 황소 같은 여러 종에서 망막은, 테스트되었습니다. 때문에 상업적 가용성 및 인체 조직에 유사에 신선한 돼지의 시선은 여기에보고 된 데이터를 제공하기 위해 사용되었다. 히스타민 및 / 또는 다른 약물과 배양 한 후 망막은 면역 글로불린 G (IgG의) 혈액의 주요 구성 요소 중 하나로서 여러 단백질 (12)에 대한 면역 염색으로 평가 처리 하였다; glial fibrillary 산성 단백질 (GFAP), 아교 활성화를위한 잘 알려진 마커; 및 미세 소관 - 관련 단백질 2 (MAP2), 미세 소관의 조립에 필수적인 신경 세포 특이 적 세포 골격 단백질. 또한, 망막의 적층 구조는 그 폭과 연속성의 변화로 뮐러 세포 및 신경절 세포의 처리를 상세하게 분석 할 수있다. 따라서, 몇 가지 추가 매개 변수의 영향을 평가하기 위해 사용할BRB 위반 초기 단계에서뿐만 아니라 잠재적 인 치료의 반전 효과를 평가하는.

혈관 누출 (이어진), 아교 세포의 활성화 및 신경 세포의 손상 응답이 프로토콜에서, 약물 스크리닝의 전위 반전 효과는 세 가지 관점에서 평가된다. 몇몇 정량화 방법은 예를 들어, 발현이 면역, 프로세스 및 인핸스먼트 필터에 의해 도시 신경 프로세스 연속성 폭 측정 강도에 의해 도시 된 바와 같이, 사용된다. 더 나은 방법을 설명하기 위해 결과를 해석하는 데 도움이, 폭신 (lipoxin) A4 (LXA4), 내생 적 염증 부상에 대한 응답과 내피 기능 장애 (23)를 감쇠에서 합성 된 화합물은 데모 용으로 선택되었다.

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프로토콜

모든 프로토콜이 적용 어디에 기관 동물 관리 및 사용위원회의 정책을 준수하여 수행 하였다.

1. 준비

  1. 75 %로 안정화 매체를 준비 둘 베코의 수정 독수리 중간 (DMEM), 25 % 행크스 '균형 소금 솔루션 (HBSS). 사용할 때까지 -20 ° C에서 잘 나누어지는 및 저장을 섞는다.
  2. 인산염 완충 식염수 (PBS)를 준비하고 고압 증기 멸균에 의해 소독. 실온에서 용액을 저장한다. 실험 (물론 당 5 ㎖) 전에 37 ° C로 PBS를 따뜻하게.
  3. 10 %, 20 % PBS 및 30 % 수 크로즈를 준비한다. 개별적으로 살균에 대한 별도의 0.22 μm의 필터를 통해 모든 솔루션을 필터링합니다. 4 ° C에서 솔루션을 저장합니다.
  4. 90 mM의 농도로 PBS에 히스타민 스톡 용액을 제조 하였다. 0.22 μM 필터를 통해 용액을 여과에 의해 멸균. 나누어지는 및 -80 ° C에서 솔루션을 저장합니다. 여러 동결 및 해동 사이클을 피하십시오.
  5. 실험 전에 PBS에 신선한 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 확인합니다. 얼음에 놓습니다.
    주의 : 흄 후드에서 PFA를 유지하고 적절한 보호 장비를 착용하십시오.
  6. 안정화 매체 (망막 당 20 ml)에 녹여. 100 U / ml의 최종 농도로 페니실린 - 스트렙토 마이신을 추가한다. 실험 전에 인큐베이터에서 37 ° C의 매체 (망막 당 15 ㎖)의 따뜻한 부분입니다. 얼음 매체의 나머지를 남겨주세요.
  7. 얼음에 HBSS (망막 당 10 ml)에 놓습니다.

2. 망막의 Organotypic 문화

  1. 조직 문화 후드에 샘플을 전송합니다. 렌즈 주위를 절단하여 아이 컵을 엽니 다. 브러쉬를 사용하여 부드럽게 망막을 당겨없이 유리체 유머를 제거합니다. 조심스럽게 시신경 유두를 노출 브러시로 절단 가장자리에서 망막을 분리합니다. 광학 면도기와 신경과 망막을 해제 심한.
  2. 페트리 접시에 망막을 전송하고 조심스럽게 차가운 HBSS를 사용하여 한 번 망막을 씻어. i에서 HBSS에서 샘플을 배치가전​​. 단계 2.1 및이 공정을 반복하여 필요한만큼의 망막 해부.
  3. 대칭 면도칼로 절반 망막을 잘라. 부드럽게 안정화 미디어의 3 ㎖로 6 웰 플레이트에 샘플을 전송할 당 잘. 5 % CO 2를 함유하는 분위기 인큐베이터에서 37 ° C에서 30 분 동안 평형을 허용한다.
  4. 단계 2.3에서 배양하는 동안 다음과 같은 시약을 준비 : 따뜻한 매체에서 원하는 농도 (450 μM)에 히스타민 원액을 희석. 250 NG / ㎖의 최종 농도로 배지에 (아르곤하에 저장 됨) LXA4을 녹인다.
    참고 LXA4의 효과를 측정 할 때, 나머지 절반은 LXA4과 히스타민을 위해 사용되는 반면, 하나의 망막에서 절반이 히스타민 단독으로 사용된다.
  5. 조심스럽게 안정화 매체를 기음과 각 웰 (물론 당 3 ㎖)에 준비된 매체를 추가합니다. 5 % CO 2를 함유하는 분위기 인큐베이터에서 1 시간 동안 37 ° C에서 샘플을 인큐베이션.
  6. 린스한 번 따뜻한, 멸균 PBS에서 샘플.

3. 면역 염색에 대한 샘플을 준비

  1. 접시에서 대기음 PBS. 4 % PFA (웰 당 3 ㎖)를 첨가하고 실온에서 15 분 동안 배양한다.
  2. 빠르게 PFA를 대기음. 한 번 PBS를 사용하여 샘​​플을 씻어. 10 % 자당에 샘플 (물론 당 5 ml)에 전송하고 4 ℃에서 2 시간 4 품어.
  3. 30 %의 자당 (물론 당 5 ㎖)에 샘플을 전송하고 4 ℃에서 하룻밤 배양한다. 작업 동결 매질을 20 % 수 크로스의 두 부분으로 상업용 냉동 매체의 일부를 혼합한다. 거품이 사라 공기까지 4 ° C 하룻밤 이상에서 그것을 둡니다.
  4. 작업 동결 배지 샘플을 옮기고 실온에서 5 분 동안 평형을 허용한다. 사각형으로 각 망막 (5mm로 약 3mm)를 낸다.
  5. 조심스럽게 원통형 용기 (약 1cm 반경 × 2 cm 고도) 디바이스에 포함 된 작업 동결 미디어에 샘플을 전송알루미늄 호일에서에 다루지. 망막 슬라이스와 액체 질소에서 그들을 동결 (절편에 망막의 단면을 제공하기 위해 지향) 수직 있는지 확인합니다. 사용할 때까지 -80 ° C에서 블록을 저장합니다.
  6. 제 각각 14 μm의 두께 조각으로 그라 이오 스탯에 블록은 유리 슬라이드에 섹션을 탑재합니다. 사용할 때까지 -80 ° C에서 슬라이드를 저장합니다.

4. 면역 염색

  1. 한 번에 5 % 자당 인산 완충액 (SPB, PBS에서 5 % 자당, 산도 7.4)와 섹션을 씻으십시오. 실온에서 1 시간 동안 (10 % 정상 염소 혈청과 0.5 % 트리톤 X-100으로 5 % SPB) 버퍼 블록의 섹션을 인큐베이션하여 비특이적 결합 부위를 차단.
  2. 해당 차 항체 (슬라이드) 섹션을 품어 (1 희석 GFAP 또는 MAP2을, 500을 버퍼를 차단에서) 1 시간 동안. 솔루션을 대기음. 5 % SPB에 세 번 씻으십시오. 내생 IgG의 염색의 경우,이 단계를 건너 뜁니다.
  3. 해당 SECON와 섹션을 품어1 시간 :하기 Dary 항체 (블로킹 완충액 800 Cyanine3 / FITC 접합 된 당나귀 항 - 마우스 / 항 - 토끼 IgG를는 1 희석).
  4. 철저하게 5 % SPB 3 회 섹션을 씻으십시오. 매체 장착 DAPI를 함유 된 커버로 덮고에서 그들을 장착하여 현미경 샘플을 준비합니다.
  5. 그룹에서 등, 드웰 시간, 레이저 강도, 게인 값과 동일한 매개 변수 아래 20X 렌즈를 통해 레이저 공 초점 현미경, 캡처 이미지를 사용. 525분의 488 나노 미터로 785분의 561 나노 미터로 (Cyanine3를 검출) 적색 채널, 447분의 408 나노 미터로 (DAPI를 검출) 및 녹색 채널 (FITC를 검출) 블루 채널의 여기 / 방출 파장을 설정 .

5. 이미지 분석

  1. 다음 조건 (12)에 의하면 새는 혈관의 백분율을 정량화 : 카운트 부에서의면 내의 내피 세포 핵에서만 혈관 포함; 이 AG 표시되면 혈관 누설을 고려용기를 둘러싼 면역 염색의 radient.
  2. 발현 수준을 결정하기 위해, 관심 영역을 선택하고, 화상 해석 소프트웨어를 사용하여 회색의 평균 값을 측정한다.
  3. 프로세스의 폭을 측정하기 위해 처리 (예를 들어, 외부 핵 층 ONL) 구별되는 구역의 영역을 선택한다. 다음과 같은 프로세스가 볼과 연속 광학 필드를 선택합니다. , 미세한 설정에 따라 눈금 막대를 설정하는 과정에서 선을 그리고 측정을 수행합니다.
  4. 프로세스의 연속성을 분석하기 위해, 관심의 선택 영역, 그 주변의 분산과, 각 화소를 대체함으로써 이미지의 에지를 강화 분산이라는 필터를 적용한 자동 콘트라스트 및 밝기를 조정 라인 카운트에 의해 카운트를 정규화 지역.
  5. 두 꼬리 학생의 t의 -test를 사용하여 통계적 유의성을 계산합니다. * P <0.05; **, P <0.01; ***, P <0.001. 피많은 수단으로 결과를 ± SEM.

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결과

우리는 히스타민에 의해 유도 된 BRB 유출을 방지 할 수 잠재적 치료를 평가하는 저비용 시간 효율적이고 사용하기 쉬운 시스템을 제시한다. IgG의 제어 망막 (도 1a)의 용기 내에 구속되지만, 모델이 성공적으로 설정되었음을 확인 히스타민 노출 (도 1b)시 혈관 밖으로 유출.

LXA4는 제시된 시스템의 BRB 위반에 대한 의약품에 대한 심사를 입증하기 위해 선택되었다. BRB 부전은 그 자체로 큰 영향 (그림 1C)가없는 LXA4 (그림 1D)로 치료에 감쇠. 환입 누출 혈관의 비율로 정량하고, 그 결과 상당한 (도 1E)이다. 다른 두 망막 세포 유형, 뮐러 아교 세포 (그림 2)와

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토론

이 보고서에서 우리는 돼지 망막을 사용하여 BRB 기능 장애의 강력한 생체 외 급성 망막 모델을 제시합니다. 이 모델 시스템은 특별한 기기가 필요하지 않으며 대부분의 실험실 환경에서 쉽게 조정할 수 있습니다. 그러나 성공적인 결과를 얻으려면 몇 가지 단계에 세심한 주의가 필요합니다. 소스에서 안구를 얻은 후에는 4°C 또는 얼음 위에 보관하고 가능한 한 빨리 처리해야 합니다. 치료의 효과를 분석할 때 동일한 망막의 두 반쪽을 사용해야 합니다 - 절반은 실험 절차(기준선)로 인한 변화를 감지하고 다른 절반은 치료 효과를 감지합니다. 이 접근 방식은 또한 연령, 성별 및 건강과 같은 동물 변형에 대한 수정을 허용합니다.

이 프로토콜은 M. musculus 및 B. Taurus 와 같은 다양한 종의 망막에 성공적으로 적용될 수 있습니다(데이터는 표시되지 않음). 상업용 돼지 안구를 사용하는 것은 동물을 유지하는 것에 비해 상당한 비용 ...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

Bringhurst Meats(뉴저지주 베를린)는 돼지 눈알을 제공하는 데 진정한 도움을 준 것으로 인정

받고 있습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DMEM라이프 테크놀로지스 11965-092
HBSS라이프 테크놀러지 14170-112
설탕J.T.Baker4072-05
히스타민 시그마H7125-1G
페니실린-스트렙토마이신 Invitrogen
PFA전자 현미경 과학15710
냉동 매체 트라이앵글 바이오메디컬 사이언스TFM-5
일반 염소 혈청 RocklandD104-00-0050
Triton X-100SigmaT8787
GFAP 항체MilliporeAB5804
MAP2 항체EMD MilliporeMAB3418
FITC conjugated Donkey anti-rabbit IgGJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.711-095-152
Cy3 활용 당나귀 안티 마우스 IgGJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.715-165-150
Vector Laboratories, Inc.포함하는 마운팅 미디어H-1200
레이저 컨포칼 현미경니콘이클립스 Ti 현미경
이미지J국립 보건원1.45s
DAPI 를

참고문헌

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