낮은 - 비용, 사용하기 쉽고 강력한 시스템은 히스타민에 의해 유도 된 혈액 망막 장벽 위반을 개선 할 수 잠재적 인 치료를 평가하기 위해 설립된다. 혈관 누수, 뮐러 세포 활성화 및 신경 프로세스의 연속성 잠재적 약물 폭신 (lipoxin) A4를 갖는 손상 응답 및 역전을 평가하기 위해 이용된다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
혈액 망막 장벽 파괴를 개선할 수 있는 잠재적 치료법을 평가하기 위해 저렴하고 사용하기 쉽고 강력한 모델 시스템이 구축되었습니다. 염증 인자인 히스타민(histamine)은 혈관 밖에서 IgG의 양성 염색을 통해 배양된 망막의 혈관 무결성을 손상시키는 것으로 입증되었습니다. 히스타민 자체와 리폭신 A4와 같은 잠재적 치료제를 위한 후보 약물의 효과는 IgG 면역 염색을 통한 혈관 누출, GFAP 염색을 통한 뮐러 세포 활성화, MAP2 염색을 통한 신경 수상돌기의 변화라는 세 가지 매개변수를 사용하여 평가됩니다. 또한, 망막의 층상 조직은 뮐러와 신경절 세포의 폭과 연속성의 변화와 같은 과정을 자세히 분석할 수 있게 해줍니다. 제시된 데이터는 돼지 망막 배양에 관한 것이지만 이 시스템은 여러 종에 적용할 수 있습니다. 따라서 이 모델은 다양한 세포 유형에 대한 손상된 망막 혈관 무결성의 초기 효과를 조사하고 치료를 위한 잠재적 약물 후보를 평가할 수 있는 신뢰할 수 있는 도구를 제공합니다.
서론
증거의 성장 몸은 혈액 망막 장벽 (BRB) 1-5과 혈액 뇌 장벽 (BBB) 6,7과의 유사성의 존재를 지원합니다. BBB를의 타협은 단단히 이러한 정신 착란 (10)로 인과 적 또는 알츠하이머 병 (AD)과 같은 만성 신경 퇴행성 질환에 대한 진단 마커로 8,9 급성 조건을 연결되어 있습니다. 잠재적 인 약물 표적에 대한 이러한 병리 및 발견에 기계적인 통찰력은 일반적으로 뇌의 제한된 액세스 및 네트워크 복잡함에 의해 방해된다. 이러한 생체 내 이미징 (11), 뇌의 Organotypic 문화 (12), 차 세포 배양 13, 14 및 공동 문화 시스템 (15)과 같은 대안이 생성되었습니다. 그러나, 이러한 모델의 대부분은 세포를 식별하는 특수 장비, 긴 실험 기간 또는 여러 개의 마커를 필요로한다. 기능적 및 구조적 및 BBB BRB 유사성뿐만 아니라 DY 간의 상관이 둘의 sfunctions는 16-19을 주장하고있다. 또한, 쉽게 액세스 잘 정의 세포 유형 및 적층 구조는 뇌 윈도우로 잘 특성화 망막 수있다. BBB를하고 BRB의 구조적 및 기능적 아이덴티티 상세히 비교 남아. 그러나, 망....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
모든 프로토콜이 적용 어디에 기관 동물 관리 및 사용위원회의 정책을 준수하여 수행 하였다.
1. 준비
- 75 %로 안정화 매체를 준비 둘 베코의 수정 독수리 중간 (DMEM), 25 % 행크스 '균형 소금 솔루션 (HBSS). 사용할 때까지 -20 ° C에서 잘 나누어지는 및 저장을 섞는다.
- 인산염 완충 식염수 (PBS)를 준비하고 고압 증기 멸균에 의해 소독. 실온에서 용액을 저장한다. 실험 (물론 당 5 ㎖) 전에 37 ° C로 PBS를 따뜻하게.
- 10 %, 20 % PBS 및 30 % 수 크로즈를 준비한다. 개별적으로 살균에 대한 별도의 0.22 μm의 필터를 통해 모든 솔루션을 필터링합니다. 4 ° C에서 솔루션을 저장합니다.
- 90 mM의 농도로 PBS에 히스타민 스톡 용액을 제조 하였다. 0.22 μM 필터를 통해 용액을 여과에 의해 멸균. 나누어지는 및 -80 ° C에서 솔루션을 저장합니다. 여러 동결 및 해동 사이클을 피하십시오.
- 실험 전에 PBS에 신선한 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 확인합니다. 얼음에 놓습니다.
주의 : 흄 후드에서 PFA를 유지하고 적절한 보호 장비를 착용하십시오. - 안정....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
우리는 히스타민에 의해 유도 된 BRB 유출을 방지 할 수 잠재적 치료를 평가하는 저비용 시간 효율적이고 사용하기 쉬운 시스템을 제시한다. IgG의 제어 망막 (도 1a)의 용기 내에 구속되지만, 모델이 성공적으로 설정되었음을 확인 히스타민 노출 (도 1b)시 혈관 밖으로 유출.
LXA4는 제시된 시스템의 BRB 위반에 대한 의약품에 대한 심사를 입증하기 위해 선택되었다. BRB 부전은 그 자체로 큰 영향 (그림 1C)가없는 LXA4 (그림 1D)로 치료에 감쇠. 환입 누출 혈관의 비율로 정량하고, 그 결과 상당한 (도 1E)이다. 다른 두 망막 세포 유형, 뮐러 아교 세포 (그림 2)와
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
이 보고서에서 우리는 돼지 망막을 사용하여 BRB 기능 장애의 강력한 생체 외 급성 망막 모델을 제시합니다. 이 모델 시스템은 특별한 기기가 필요하지 않으며 대부분의 실험실 환경에서 쉽게 조정할 수 있습니다. 그러나 성공적인 결과를 얻으려면 몇 가지 단계에 세심한 주의가 필요합니다. 소스에서 안구를 얻은 후에는 4°C 또는 얼음 위에 보관하고 가능한 한 빨리 처리해야 합니다. 치료의 효과를 분석할 때 동일한 망막의 두 반쪽을 사용해야 합니다 - 절반은 실험 절차(기준선)로 인한 변화를 감지하고 다른 절반은 치료 효과를 감지합니다. 이 접근 방식은 또한 연령, 성별 및 건강과 같은 동물 변형에 대한 수정을 허용합니다.
이 프로토콜은 M. musculus 및 B. Taurus 와 같은 다양한 종의 망막에 성공적으로 적용될 수 있습니다(데이터는 표시되지 않음). 상업용 돼지 안구를 사용하는 것은 동물을 유지하는 것에 비해 상당한 비용 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
Bringhurst Meats(뉴저지주 베를린)는 돼지 눈알을 제공하는 데 진정한 도움을 준 것으로 인정
받고 있습니다.....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| DMEM | 라이프 테크놀로지스 | 11965-092 | |
| HBSS | 라이프 테크놀러지 | 14170-112 | |
| 설탕 | J.T.Baker | 4072-05 | |
| 히스타민 | 시그마 | H7125-1G | |
| 페니실린-스트렙토마이신 | Invitrogen | ||
| PFA | 전자 현미경 과학 | 15710 | |
| 냉동 매체 | 트라이앵글 바이오메디컬 사이언스 | TFM-5 | |
| 일반 염소 혈청 | Rockland | D104-00-0050 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| GFAP 항체 | Millipore | AB5804 | |
| MAP2 항체 | EMD Millipore | MAB3418 | |
| FITC conjugated Donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 711-095-152 | |
| Cy3 활용 당나귀 안티 마우스 IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 715-165-150 | |
| Vector Laboratories, Inc. | 포함하는 마운팅 미디어 | H-1200 | |
| 레이저 컨포칼 현미경 | 니콘 | 이클립스 Ti 현미경 | |
| 이미지J | 국립 보건원 | 1.45s |
참고문헌
- Cunha-Vaz, J., Bernardes, R., Lobo, C. Blood-retinal barrier. J Ophthalmol. 21, 3(2011).
- Kim, J. H., et al. Blood-neural barrier: intercellular communication at glio-vascular interface. J Biochem Molec Biol. 39, 339-345 (2006).
- Kumagai, A. K.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
