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방법 논문

작은 별 말미의 반구 Physa에서 전체 폴립 재생을 유도 Nematostella의 vectensis

8.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/54626

⸱

2017년 1월 14일

 , 
1Department of Biochemistry and Cell Biology, Center for Developmental Genetics, Stony Brook University

이 논문에서

요약

여기에서는 자포동물(cnidarian anthozoan) 모델인 Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis에서 재생을 유도하고 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 형태학적 병기 결정 시스템을 사용하여 재생을 절단하고 분류하는 방법을 보여주며, 이 시스템을 사용하여 폴립 구조 재생에서 자가포식에 대한 요구 사항을 밝힙니다.

초록

자포 동물, 특히 히드라가 손상되거나 절단 구조 및 참으로 틀림없이 250 개 이상의 년 전 Trembley의 작품을 통해 현대 생물학의 질문을 출시 이러한 연구를 다시 생성하는 것으로 첫 번째 동물했다. 현재 재생의 연구는 스폰지에서 포유 동물을 통해 같은 히드라, planaria 및 Urodeles 등 모두 "고전적인"재생 생물을 이용하여 부활뿐만 아니라, 후생 동물의 범위에 걸쳐 종의 확대 스펙트럼을 볼 수있다. 생물학적 현상과 같은 고유의 관심 외에도, 재생이 종의 다양한 작동 방식을 이해하는 재생 과정이 일반적인 기능 및 / 또는 종 또는 상황에 특정 세포 및 분자 메커니즘을 공유하는지 여부에 대한 정보를 통보하는 것입니다. 작은 별의 말미는 Nematostella의 vectensis는 재생을위한 신흥 모델 생물이다. 히드라처럼, Nematostella하지만 t에서, 고대 문, 자포 동물의 구성원 인그는 클래스 산호충 강, 진화 적으로 더 기초 인 히드로 충에 자매 계통 군. Nematostella에서 재생의 따라서 측면을 비교하고 히드라 등 자포 동물의 것과 대조 흥미로운 일이 될 것이다. 이 글에서, 우리는 이등분 관찰하고 physa 호출되는 Nematostella 성인의 반구 끝의 재생을 분류하는 방법을 제시한다. physa 자연스럽게 무성 생식의 수단으로 분열을 거쳐, 자연 분열 또는 physa 수동 절단 중 하나는 복잡한 형태학의 재 성장과 개혁을 트리거합니다. 여기서 우리는 Nematostella 재생 준비 시스템합니다 (NRSS)에 다음의 간단한 형태 학적 변화를 성문화했다. 우리는 클로로퀸의 효과, 리소좀 기능 블록의 자식 작용의 억제제를 테스트 할 NRSS를 사용합니다. 결과는 자식 작용이 억제 될 때 용종 구조, 특히 장간막의 재생이 비정상이라고 나타낸다.

서론

하나의 히드라의 재생의 관찰 실험 과학 1, 2 등 생물학의 출현에 정액 사건이었다. 재생은 생물학에 매우 폭 넓은 매력의 현상 유지와 비슷하게 사람을 누워. 인간의 재생에 한계를 이해하고 극복하기 위해 발달 생물 학자, 의사, 의학자 및 조직 엔지니어를위한 잠재력은 더 본질적으로 재미보다 재생 생물학을합니다.

이제, 이러한 게놈 시퀀싱 및 이득 및 기능 도구의 손실과 같은 새로운 기술의 사용으로, 필드가 떨어져 재생 메커니즘을 애타게 태세 궁극적으로 재생하는 방법을 다양한 종 이해할 수있는 동안 다른 사람은 할 수 없습니다. 분자 세포 및 형태 학적 반응에 공통성의 정도는 밝혀지지 남아 있지만 지금까지 그것을 다시 생성 할 수 있습니다 동물 중 기본 응답이 있었다 imagi있는 것보다 더 유사하다는 것을 나타납니다NED 만 10 년 전 3.

특히 자포 동물은 형태 학적 다양성의 폭 넓은 스펙트럼 속에서 거의 모든 신체 부위의 재생에서 손쉬운 있습니다. 고독한 신선한 물 용종에서 히드라는 포르투갈 사람-O-전쟁과 같은 복잡한 식민지 siphonophores에, 거대한 산호초를 구축 작은 해양 폴립과 함께, 재생을위한 메커니즘 이외에, 자주 재생하는 모드입니다 수리 또는 부상 포식으로 인해 손상되거나 손실 된 신체 부위를 개혁. 자포 동물의 다양한 종의 재생을 위해 유사하거나 다른 메커니즘을 사용할지 여부를 근본적으로 흥미로운 질문 4-6이다.

우리와 다른 사람들이 anthozoan을 개발 한 Nematostella는 재생 7-17 모델로 vectensis. 우리는 최근 abora부터 타개 조직의 형태 학적으로 균일 한 편에서 전신의 재생을 설명하기위한 스테이징 시스템을 개발폴립 (10)의 리터 끝. 모든 수준에서 양분 때 Nematostella 용종이 다시 생성 할 수 있지만, 우리는이 자연 무성 분열 (18)의 정상 평면에 가까운 때문에 부분적으로 가장 형태 학적으로 단순한 지역의 physa의 반구 위치에 성인을 삭감하기로 결정하고, 또한 때문에 허가 관찰하고 몸 전체가 단순한 형태 구성 요소에서 재 조립하는 방법의 분자 분석.

Nematostella 재생 스테이징 시스템 (NRSS)은 일반 배양 조건에서, 절단 physa에 의해 재생의 모든 측면의 진행을 득점하는 데 사용할 수 형태 벤치 마크의 비교적 간단한 세트를 제공하거나 실험적으로 같은 작은 분자 치료, 유전자 조작으로 상황을 교란 , 또는 환경 변경. 예상 된 바와 같이, 재생은 NRSS의 세포 및 분자 이벤트가 참조 할 수있는 형태소 지지체로서 채택되고10.

마지막으로 절단 우리의 방법은 최근의 연구 (17)에 사용되는 핀 포인트 구멍보다 큰 크기의 벌어진 구멍 여러 주문을 생산하고, 아직 모두 상처를 6 시간의 주위에 치유. 상처 봉합의 시각 체포와 별개의 단계를 문서화하는 것은 상처의 크기와이 종료하는 데 걸리는 시간의 외관상의 독립성을 설명하는 실험 방법을 제안한다. 따라서,이 프로토콜에 의해 제공되는 반구 절단 공정의 깊은 시각적 이해는,이 모델은 재생 시스템으로 추가 조사를 돕고 Nematostella의 vectensis를 사용하여이 스테이징 시스템의 적용 범위를 확장 할 것이다.

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프로토콜

온도, 영양과 빛 / 어둠의 사이클에 대한 동물의 1. 컨디셔닝

  1. 전 세계적으로 수많은 Nematostella 연구소 중 하나, 또는 비영리 업체에서 Nematostella vectensis 성인을 얻습니다 (표 1)
  2. 에, 어둠 속에서 일정한 온도 (일반적으로 사이 18 및 21 ° C)에서 Nematostella 유지 "/ 배 1"인공 해수 천 (PPT) 당 12 부품의 염분에서 (ASW). 일반적으로, 간단한 소다 석회 유리 배양 접시에 250 mL의 1.5 L 용량 (11) 문화를 유지한다.
    참고 :이 간단한 배양 조건은 일반적으로 Nematostella을 연구 실험실들 사이에서 사용되지만, 문화주의는 19 자동화 할 수 있습니다.
  3. 일주일에 4 배 - 2 노 플리 우스 Nematostella 갓 부화 아테 피드. 얕은 직사각형 유리 접시 (20) 또는 30 ° C에서 전체 강도 (36 PPT) 또는 1 / 3 배 ASW에서 해치 아테 미아는 낭종,소규모, 상업적 또는 집에서 소금물 새우 부화장의 수의. 인큐베이터를 사용할 수없는 경우, 새우 RT에서 부화하지만 그래서 더 느리게 할 것입니다.
    참고 :이 종종 완성을위한 이상 24 시간을 필요로한다.
  4. 적어도 일주일에 한 번 말미잘 배양 물을 교체합니다. 최고의 성인 건강을 위해, (비누)없이 철저하게 깨끗한 문화 트랩 먹지 않는 음식 폐기물, 그리고 동물을 얽히게 할 수 코트 그릇과 축적 된 점액 분비물의 일주일에 한 번 그릇.

영양 금연실 동물 2. 선택 및 휴식

  1. 거의 같은 길이의 선택 크기 일치 용종 (3-5cm, 때 자연적으로 완화) 이전 절단에 사흘 동안 식민지에서 분리 한 그릇에 배치합니다.
    주 : 절삭 선정 동물의 수는 실험에 의해 결정된다 물론 진행되고 있지만, 일반적으로 우리는 여섯 복제 샘플 포인트 당 적어도 다섯 동물을 추천한다. 그러므로,전형적인 실험에서 30 동물의 최소 미리 선택 될 것이다. 일반적으로, 나중에 점수에 영향을 줄 수 있습니다 (아래 참조) 불규칙 절단 이후 최소 수 (30) 이상을 선택하는 것이 현명합니다.
  2. 이전에 절단에 실내 조명에 인큐베이터에서 한 시간 이상을 선택 동물의 접시를 제거합니다.
    실내 조명 및 취급의 진동에 노출 가능성이 동물이 수축하게됩니다, 그래서 그들은 적응 또는 실험실 벤치에 배양하여 "완화"할 필요합니다. 동물 접촉하는 내화물과 빛에 노출이 될 것이며, 그 시점에서 부드러운 피펫 팅에 의해 이동 될 수있다.
  3. 선택 사항 : (1 / 3X ASW에서) 7.5 %의 MgCl 2를 첨가하여 동물을 마취. 부드럽게 표준 플라스틱 5 mL를 피펫으로 그릇에의 MgCl 2 솔루션을 추가 할 수 있습니다.
    동물은 결국 빛을 물리적 조작에 길들여 될 것입니다 있지만, 그것은 t "수정"유지하거나 동물을 마취하는 것이 유리할 수있다 : 참고그들은 긴 16,21,22하게 한 후 그 상태를 편안합니다.
  4. 12 PPT의 ASW를 포함 100mm 직경의 멸균 유리 절단 접시의 바닥에, 절단 할 수있는 풀에서 다섯 동물 (1 / 3 배 ASW에서) 전송 넓은 구멍 (> 0.5 cm) 플라스틱 피펫을 사용합니다. 40X - 10 사이의 가변 배율의 실체 현미경의 무대에 접시를 놓습니다.
    참고 : 동물 마취 및 절단 완화되지 않은 경우, 그들은 여전히 ​​다시 편안하게하는 데 몇 분 정도 필요할 수 있습니다 따라서 터치 입체경 조명에 응답하고있다.

3. 절단 수술

  1. 멸균 메스를 사용하여, 약 한이 넓고 더 장간막을 포함하지 않는 그대로입니다 physa의 섹션을 얻을 목적으로, 각각의 폴립에서 반구 physa을 절단.
    참고 : 이상적인 컷 사이트가 장간막의 종료에 불과 반구입니다. 절단의면에 얇은 리터에 적절한 장간막에서 변화가있다아이 네스는 각 mesenterial 삽입 (그림 1, 화살표)에 대응. 이 구멍 17,30를 '연결'용이하게 할 수있다 점액을 생산하기 때문에 장간막의 부재는 매우 중요하다.
    1. 절단의 원하는 사이트에서 동물과 접촉 메스 블레이드를 배치합니다. 이 중 비 보조 (프리 핸드)를 수행하거나 부드럽게 # 5 포셉 (뒤몽 스타일 또는 유사한)와 함께 동물의 몸을 파악하여.
    2. 몸에 걸쳐 '흔들'운동에 메스의 곡선 블레이드를 활용하여 조직을 잘라.
      참고 : 조직이 메스가 요동으로 깨끗하게 절단 및 기증자로부터 physa의 원하는 부분을 해방해야합니다. 조직의 작은 조각들이 여전히 본체와 연결 physa 경우, 메스로 절단. 이것은 physa에 손상을 줄 수 있으므로, 당겨 연결 부분을 분리하지 마십시오.
  2. 접시에서 각 절단 '기증자'용종을 제거하고 SEPA에 반환'풀 절단 수술'라고 표시된 속도 그릇; 그릇 날짜 및 주식 문화에 반환.
    참고 : 절단 용종이 정상적으로 공급 될 수 후 하루 내에 반구 상처를 치유하고 있습니다. 그들은 원하는 경우 physa 다시 절단 할 수있는 시점에서 2 주 이내에 정상적인 찾고 physa를 다시 생성합니다.
  3. 다음, 이미 각 웰 12의 PPT ASW의 10 ㎖를 갖는 멀티 웰 세포 배양 접시에 별도 멸균 웰에 각각 physa 전송할 12의 PPT ASW 절삭 접시에 남아 절제 physa 린스.
    참고 :이 예에서는 각 해수 잘 잡고 10 mL의 다섯 적출 physa으로, 여섯 웰 플레이트를 사용합니다. 일반적으로 해수에 의한 처리 및 잠재 증발의 움직임에 공기에 노출을 방지하기 위해 충분히 physa을 포함해야한다. 플레이트 또는 우물 뚜껑이 있어야합니다.
  4. 3.3 각각의 실험적인 치료를 위해 각 웰 예약에 적어도 5 physa를 수집 - 반복 3.1 단계를 반복합니다.
  5. 잠하는 온도에서 physa을 품어계획된 실험 심문에 대한 재생의 최고 속도를 IDE. 중생의 원하는 속도에 의해 결정되는 고정 된 온도에서 온도 조절 배양기에 physa을 포함하는 판을 놓습니다.
    참고 : physa이 누락 된 조직을 재생, 15 및 27 ° C 사이의 온도에서 배양 할 때 전체 용종을 형성 할 것이다. 재생 속도는 처음 두 단계 제외한 온도 의존적이다. 모든 온도에 대해 4 단계에 도달 평균 하루는 절단 후 7 일 이내입니다,이 또한 21 ° C에서의 재생과 일치한다. 27 ° C에서 4 단계는 약 3 일 이전에 도달하고 15 ° C에서, 4 단계는 21 ° C (또한 참조 참조 10)에서 재생에 비해 약 3 일 지연됩니다.

4. Nematostella 회생 준비 시스템과 재생을 평가 (NRSS)

  1. 변수 magnific와 스테레오 화합물 현미경을 사용하여 physa 점수ATION (10 - 80X). 스테이지 0으로 갓 잘라 Nematostella의 physa 점수와 동시에 NRSS (10)를 사용하여 매일 포스트 절단 (DPA)에 점수를 계속합니다.
    참고 : 키 준비 기준 및 세부 사항 참조 (10)를 참조하십시오.
    1. 갓 잘라 physa이 이완 풍선을 닮은 컵 - 모양의 덩어리로 나타나는 경우 열려있는 상처 부위로, 스테이지 0 (오픈 상처) 등 physa 점수 것은 가능성을 볼 수 있습니다.
      주 : 상처의 가장자리는 처음부터 뭉쳐 수 있지만, 티슈 계속 축소되고 강성이 부족하다. 오픈 상처의 가장자리는 상처 치유 등의 방사형 수축을 겪고 관찰 할 수있다.
    2. 절단 상처가 닫혀 나타나는 경우 1 단계 (폐쇄 상처) 등 physa 점수.
      주 : 상처 위치가 미래 경구 자극에 해당 할 것이다. 미래 구두 극 주변의 외부 표면은 기본 방사상으로 대칭 내배엽 mesenterial 삽입에 해당하는 별개의 아치를 표시하기 시작할 수 있습니다.
    3. 점수 산도YSA 구강 극의 표면이 방사상으로 대칭 패턴으로 배열하고 홈으로 구분 팔 제기 아치를 공개, 비정상적으로 나타나는 경우 2 단계 (레이디 얼 아치) 등. 아치의 정점에 작은 반구형 소포을 준수하십시오. 그들은 같은 높이 넓은 가능성 과도 대해, 그리고 초기 단일 외배엽 세포 층에 의해 구성된다.
      참고 : 어떤 경우에는 두 층 소포가 안정 수 있습니다. 참고 :이 이상이 단계에서 점액 층이 physa 멤브레인 '시스'에서 (그림 2) 캡슐화 나타날 수 있습니다. 이 밀봉재 득점을 용이하게 제거되어야한다.
    4. 내배엽과 외배엽 조직 층을 포함하는 촉수의 싹이 안정적으로 적어도 일부 반경 아치의 구두 끝 부분에 형성되어있는 경우 3 단계 (촉수)로 physa 점수.
      참고 : 촉수들이 넓은하고 최소한의 운동성보다 길다. physa 증가 보여하지만, 장간막의 초보가 마주 변수 인플레이션이 될 수 있도록체강 (coelenteron)에 mesenterial 삽입에서 연장 ible.
    5. physa들이 연결 표시되는 위치에서 측정 된 두 배로 반경 폭 이상입니다 구강 - 반구 길이로, 몸 벽에 삽입에서 coelenteron로 연장 팔 구별, 눈에 보이는 장간막이 포함 된 경우 4 단계 (선형 장간막)로 physa 점수 그 반구 끝 (enterostome)에서 인두합니다.
      참고 : 네 개 이하의 장간막은 "주름"내부 무료 가장자리가. 인두 볼 수 있습니다. 이상 팔 촉수는 운동성, 볼 수 있습니다 때때로 그들은 몸으로 계약.
    6. physa이 주름과 개 이상의 장간막을 가지고 있으며, 주름 무대 동물은 거의 "정상"성인 외관이 4보다 더 완전하고 꾸불 꾸불 한 경우 5 단계 (우세 주름 장간막)로 physa 점수 있지만 볼 수는 없다 생식 세포.

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결과

절단 된 physa에서 재생하는 동안 형태 학적 이벤트의 진행은 각 NRSS 단계에서 physa의 대표적인 전망을 포함 그림 1A에 표시됩니다. 전형적인 physa 컷 사이트는 성인 (화살촉)에 표시됩니다. 그림 1A의 사진은 완전히 형성 용종을 통해 갓 잘라 physa에서 구강 및 신체 구조의 점진적 재생을 보여줍니다. 도 1b는 각각 4 단계 및 5 단계에서의 내부 격벽의 장간막의 구성을 표시 하였다. 4 단계에서 일부 장간막은 "주름"을 부족하지만, 대부분은 주름을 개발해야 5 단계로 자격을합니다. 그림 1D는 집게 (그림 1E)를 제거 할 수 있습니다 점액의 막에 싸여 physa을 보여줍니다. (가 부당 동물 트랩 않는) 재생 통상 무해은 멤브레인 physa를 기록하고 방해 할 수 ...

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토론

상처 치유 및 재생의 모델로 Nematostella의 사용은 점점 더 인기를 끌고있다. 따라서,이 할당과 비교 될 수 효과적인 세포 및 분자 분석 전에 특정 프로토콜의 형태 패턴을 가시화 할 수있는 것이 중요하다. 삶의 포스트 플랜 울라 단계에서, 거의 모든 위치에서 절단 누락 된 구조를 개혁 할 수있는, 재생 "유연성"의 높은 수준을 Nematostella. 따라서, 여러 연구자들은 다른 연령대에, 재생 절단으로 인한 또는 폴립의 다른 지역에서 부상을 조사하고 7-18 크기했다.

여기에 설명 된 준비 시스템은 생식 조직을 부족 해부학 전체 청소년 용종에 성인의 반구 끝에서 절단 physa의 형태 학적으로 균일 한 섹션의 변화를, (이 재생 청소년들이 성적 m가 될 때 우리는 아직 결정하지 않은 다음ature). 이 접근법은 최대 근처 복잡 하나 조직 간단한 퇴화로부터 재생을 조사한다. 최소 그룹 크기가 잠...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 작품은 GHT에 뉴욕 줄기 세포 과학 (NYSTEM C028107) 그랜트에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Nematostella vectensis, 성인해양 생물학 연구소 (MBL)비영리 공급업체
유리 배양 접시, 250 mLCarolina 생물학적 공급741004250 mL
유리 배양 접시, 1,500 mLCarolina 생물학적 공급7410061,500 mL
폴리에틸렌 전사 피펫, 5  mLUSA 사이언티픽 1022-2500좁은 구멍, 눈금이 매겨진
폴리에틸렌 전사 피펫, 테이퍼형Samco202-205넓은 구멍을 만들기 위해 팁 1인치를 잘라냅니다
일회용 메스깃털 안전 면도기 Co. Ltd번호 10블레이드는 곡선이어야 합니다
.#5 Dumont 파인 포인트 핀셋RobozRS5045대체 공급업체 사용 가능
Pyrex Petri 접시, 직경 100mmCorning3160다른 유리 페트리 플레이트를 대체할 수 있습니다
. 멸균 6-웰 플레이트Corning Falcon 다른 제조사의 353046 또는 유사한
균 12-웰 플레이트Nunc 다른 제조업체의 150628 또는 유사
멸균 24웰 플레이트Cellstar, Greiner bio-one662-160또는 다른 제조업체의
유사 염수 새우 hathery 키트San Francisco Bay; drsfostersmith.comCD-154005소금물 새우 재배 옵션
식료품점에서파이렉스 베이킹 접시소금물 새우
재배 옵션인공 해수 믹스 50 갤런 이상 인스턴트 오션; drsfoster-smith.comCD-116528기타 브랜드는 충분할 수 있습니다
플라스틱 통은 재고 ASW 준비를 위한다양한일반 25 갤런 플라스틱 쓰레기통 OK
폴리프로필렌 Carboy CarolinaBiological Supply716391ASW @ 12 ppt 비커의 작업 재고
, 졸업, 4,000 mLPhytoTechnology LaboratoriesB19936 ppt ASW를 12 ppt로 희석하기 위해
실체현미경 및 광원다양한 연속 1 - 40X 배율
.은 멸 흔히 볼 수 있는.

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