방법 논문

인간의 간세포 암 세포주 인 HepG2와 3 차원 간 모델 다시 채워에서 바이러스 성 벡터의 연구

DOI:

10.3791/54633

⸱

2016년 10월 24일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Applied Biochemistry, Institute of Biotechnology, Berlin University of Technology, 2Department of Medical Biotechnology, Institute of Biotechnology, Berlin University of Technology, 3Department of Bioprocess Engineering, Institute of Biotechnology, Berlin University of Technology

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

탈세포화된 쥐 간의 재세포화된 세포외 기질은 바이러스 또는 바이러스 벡터의 분포 및 전이유전자 발현을 연구하기 위해 인간화된 3차원 생체 외 모델로 사용할 수 있습니다.

초록

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이 프로토콜은 3 차원 (3D)의 발생 생체 간 모델 및 바이러스 벡터 시스템의 연구 및 개발에의 응용을 설명한다. 이 모델은 인간 간세포 세포주와 decellularized 래트 간 세포 외 기질을 다시 채우기에 의해 얻어진다. 이 모델은 살아있는 동물에 유해한 실험을 대체하는 혈관 3D 전지 시스템 연구를 허용한다. 또 다른 장점은 동물 모델보다 인간 생리에 가까운 모델의 인간화 특성이다.

본 연구는 아데노 - 관련 바이러스 (AAV 벡터) 유래의 바이러스 벡터와이 간 모델의 전달을 입증한다. 미디어와 3D 간 모델을 공급하는 관류 회로는 벡터를 적용 할 수있는 쉬운 방법을 제공합니다. 시스템 간 주요 대사 파라미터의 모니터링을 허용한다. 최종 분석을 위해, 조직 샘플은 recellulariza의 범위를 결정하기 위해 수행 될 수있다조직 학적 기술에 의해 기. 전달 된 유전자의 바이러스 벡터와 표현의 분포를 정량적 PCR (qPCR에), 웨스턴 블롯 및 면역 조직 화학 염색에 의해 분석 될 수있다. 기초 연구 및 유전자 치료 응용 개발 벡터 모델의 다수의 애플리케이션은 신규 한 항 바이러스 치료법의 개발, 암 연구 및 바이러스 벡터에 관한 연구 및 잠재적 부작용을 포함하여 구상 할 수있다.

서론

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대부분의 최신 생물 의학 연구는 본질적으로 3차원(3D)인 2차원(2D) 세포 배양 실험 또는 동물 모델의 두 가지 접근 방식 중 하나에 의존합니다. 그러나 이러한 방법에는 몇 가지 심각한 단점이 있습니다. 2D 배양에서 성장한 세포는 3D 조건에서 배양된 세포와 유전자 발현 패턴 및 세포 생리학이 다른 것으로 나타났습니다. 1 동물 모델은 윤리적 문제와 관련이 있을 뿐만 아니라 종종 인간의 생리학을 잘 모델링하지 않습니다. 인간에게 처음 투여하기 전에 동물 모델에서 화합물의 명백한 독성 효과가 없다는 것을 확인해야 하지만, 임상 시험에서 심각하고 때로는 치명적인 부작용이 발생한 여러 사례가 문서화되었습니다. 2

개

이러한 단점을 극복하기 위해 인간화된 3D 체외 장기 모델은 중요한 연구 도구가 되었습니다. 적절한 조건에서 배양되면 세포는 스페로이드로 알려진 3D 구조로 자체 조립됩니다. 그러나 이러한 스페로이드는 혈관 시스템이 없어 작은 분자 화합물, 큰 생물학적 제제 및 바이러스 벡터의 분포를 제한합니다. 예를 들어, 아데노바이러스 벡터는 인간 교모세포종에서 준비된 스페로이드의 외부 세포층만 형질도입했습니다. 3 이 문제에 대한 해결책은 혈관계(vascular system)를 포함하는 장기 모형을 사용하는 것이다. 이를 위해 관심 기관을 동물로부터 이식할 수 있고, 동물 세포를 인간 세포로 대체할 수 있습니다. 세제 또는 나트륨 콜레이트로 처리하여 동물 간을 탈세포화하는 다양한 방법이 설명되었습니다. 4-6 그 결과로 생성된 세포외 기질(ECM)에는 다양한 세포 과정을 조절하는 사이토카인과 성장 인자를 보유하고 있습니다. 7 기능적 장기 모델을 얻기 위해 인간 세포와의 재세포화를 위한 발판으로 사용할 수 있습니다.

최근 연구에서는 인간화 3D 간 모델을 사용하여 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터의 분포 및 전이유전자 발현을 연구했습니다. 8개의 AAV 벡터는 유전자 치료 응용 분야에서 가장 유망한 바이러스 벡터에 속합니다. 9 서구 세계에서 최초이자 현재까지 유일하게 승인된 유전자 치료 개입은 지단백질 리파아제의 전달을 위해 AAV 벡터를 사용합니다. 10

분

프로토콜

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참고 : RL은 Landesamt 대 아퍼 싶게 Soziales (LaGeSo)에서 장기의 외식에 대한 윤리적 승인을 획득했습니다. 간은 스터 쥐에서 외식되었다. 대정맥과 간 포털 정맥은 22 G 정맥에 삽관 하였다. 외식 간의 탈세 포화하는 방법은 이전에 설명되었다. 1 % 나트륨 데 옥시 콜레이트와 쥐 간 과도한 관류에 의해 수득 된 4,5- 여기서 사용 세포 외 매트릭스.

쥐 간의 세포 외 기질 (ECM) 1. Recellularization

  1. 간 세포주 인 HepG2의 확장
    1. 배양 된 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI) 10 % 소 태아 혈청 및 2 mM 글루타민 및 페니실린 및 스트렙토 마이신이 mM의 각각의 보충 1640의 간암 세포주 인 HepG2.
    2. T175 병 1.5 × 10 7 세포를 시드 및 37 ℃, 5 % CO 2에서 세포 성장 2.
    3. 300 XG에서 세포를 스핀 다운 4 ml의 PBS에서 그들을 재현 탁하고 현미경 아래 노이 바 우어 챔버와 세포를 계산합니다. 하나 T175 병은 약 4.5 × 10 7 세포를 얻을 것입니다.
      참고 : 문화 ECM 당 6 × 10 8 인 HepG2 세포 (4-5 × 10 8 세포 각각 10 × 175cm 2 배양 플라스크)와 쥐의 간 ECM의 recellularization 충분한 세포 수를 포함해야합니다.

figure-protocol-1
그림 1. 생물 반응기 시스템. A)이 생물 반응기 시스템은 주문 제작했다. 그것은 37 ° C와 5 % CO 2의 장기 모델을 유지합니다. 연동 펌프의 유량 간은 성장 챔버 내에 배치된다) B. 개별적으로 조절하고 연결할 수있다연동 펌프, 중간 저장, 버블 트랩 및 압력 센서로 구성 관류 회로에 에디션. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 전자 재료의 Recellularization
    1. 간 관류 챔버, 관류 시스템, 매체의 저장 및 버블 트랩을 포함, 생물 반응기 시스템을 설정합니다. 생물 반응기 시스템 (121 ° C, 15 분) 소독.
    2. 연동 펌프와 생물 반응기 시스템을 연결하고 인큐베이터가 적절한 조건을 제공하는 배치 (37 ° C, 5 % CO 2). 생물 반응기 시스템 (그림 1)의 간 관류 챔버에서 decellularized 쥐의 간 비계 8 놓습니다.
    3. 관류 시스템에 관 클립을 사용하여 유관 포털 정맥과 대정맥을 연결합니다. (1.1에서 설명) 150 ml의 RPMI 배지로 발판을 평형/ 분 1.25 mL의 유속으로 5 D 이상.
    4. 미디어 회로로부터 간 발판을 분리하고 5 ML의 주사기를 사용하여 포털 정맥 (5 ㎖)에 3 × 10 8 인 HepG2 세포와 지지체를 접종, 공기 방울 형성을 방지하고 세포가 그들을 배양하여 ECM을 다시 채울 수 있도록 펌프와 발판에 1 시간은 꺼져.
    5. 점차적으로 10 분 동안 125 ml / 분으로 시작 펌프를 조정함으로써, 유량을 증가; 20 분 동안 250 ml / 분 최종적 3.75 ㎖ / 분으로 30 분간.
    6. 반복은 6 × 10 (8)의 총 세포 수에 도달 1.2.4-1.2.5 단계를 반복합니다.
    7. / 분 3.75 ml의 유속으로 바이오 리액터 시스템을 실행. 문화 이주에 대한 recellularized 쥐의 간.
      참고 : 새로운 배지 (50 ㎖) 매일과 매체의 3 분의 1을 교체합니다. 이러한 락 테이트 탈수소 효소 활성 매체 샘플의 pH 및 글루코스 및 락 테이트의 농도 등의 생체 변수를 측정하기 위하여 배양액 샘플.

Recellularized 쥐 간 2. 형질 도입

  1. AAV 벡터의 대규모 생산
    1. 전술 한 바와 같이 생산 정제 및 AAV 벡터를 정량화 : 11
      1. 간략하게, 롤러 병에서 AAV 벡터를 생성하고 iodixanol 구배 원심 분리에 의해이를 정제. PD10 겔 여과 컬럼을 통해 여과하여 잔류 iodixanol를 제거합니다. 표준으로 게놈 AAV의 DNA를 사용하여 qPCR에 의한 AAV 벡터의 농도를 결정합니다.
        참고 : 본 연구에 사용 된 자기 보완, pseudotyped AAV2 / 6 벡터 전달 효율 및 내생 적 발현 유전자의 최저 대한 shRNA를 발현 카세트 (인간의 시클로 필린의 B (hCycB), 그림 2)을 보여주기 위해 기자로 EmGFP 인코딩 . 혈청 형 6 (간 모델 당 2.7 × 10 13 AAV 벡터)의 pseudotyped scAAV 벡터의 충분한 양을 확인합니다.

figure-protocol-2
본 연구에 사용 된 자기 보완, pseudotyped AAV2 / 6 벡터 그림 2.지도. 게놈은 AAV2의 반전 터미널 반복 (ITR) 구성 및 제어 아래의 shRNA뿐만 아니라 CMV 프로모터의 제어하에 EmGFP를 인코딩 U6 프로모터의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 간 모델의 형질 도입
    1. PBS의 각각의 양을 첨가하여 5 ㎖ 2.7 × 10 13 벡터 게놈의 최종 농도로 AAV 벡터 용액을 조정한다.
    2. 정맥에서 튜브를 제거하여 미디어 회로로부터 간을 분리합니다. 포털 정맥의 정맥에 5 ML의 주사기를 연결하고 전체 AAV 벡터 용액 (5 ml)에 주입.
      참고 : OptionallY는 간 걸쳐 AAV 벡터 용액의 분배를 수행하는 페놀 레드 (5 μg의 / ㎖)을 추가한다.
    3. 펌핑없이 1 시간 동안 품어. 서서히 10 분 / 125 ㎖로 분부터 유량을 증가; 2.5 ㎖ / 20 분, 30 분 3.75은 ㎖ / 분 분간. 문화 육일 동안 recellularized 쥐의 간.
      주 : 매체의 3 분의 1을 교체 1.2.7에 따라 주에 주어진

Recellularized 형질 쥐 간 3. 평가

  1. 헤 마톡 실린 및 에오신 (HE) 염색 및 면역 조직 화학적 분석
    1. 메스를 사용하여 각 간 로브에서 샘플 (0.5 × 0.5 × 1.5 cm)를 가져 가라.
    2. 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA), 4 ℃에서 1.5 시간 동안 + 4 % 수 크로스 용액 (3.1.1부터) 샘플을 인큐베이션. (주의 :.. PFA는 항상 흄 후드 내에서 PFA를 유지하고 적절한 보호 복을 착용 독성 및 발암) 세척 PBS로 3 회 (세척 단계 당 1 분) 8 %에 품어4 ℃에서 자당 하룻밤.
    3. 플라스틱 cryomolds에 매체를 고정 부어 기포의 매체 무료 고정에 샘플을 배치합니다. 샘플이 잘 덮여 때까지 고정 매체를 추가합니다. 스토어 더 사용할 때까지 -80 ° C에서 샘플을 포함.
    4. cryotome (12) 냉동 섹션 (10 μm의)를 준비합니다. 헤 마톡 실린 + 에오신 염색 8 recellularization을 평가합니다. (: EmGFP 여기) 유전자-의 이익에 대한 면역 조직 화학 염색에 의해 전달 효율을 평가합니다.
  2. 분자 생물학적 시료 채취
    1. 생검 펀치 (직경 4mm)와 각 간 로브 샘플. EmGFP의 유전자 발현의 평가를위한 제조업체의 지침에 따라 전체 RNA, DNA와 단백질을 분리, 8을 노크 hCycB.

결과

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recellularization 정도의 평가를 위해, 크라이 섹션은 각각 recellularized 간 모델의 각 로브로부터 제조 하였다. 그런 다음 섹션을 헤 마톡 실린 및 에오신 염색으로 분석 하였다. 도 3에서 알 수있는 바와 같이, TLM1, TLM2로 표시된 세 간 모델은 각 로브는 (recellularized하지만 형질 도입되지 않은 제어 간 모델) Ctrl 키 (간 모델 일 +2를 형질) 인 HepG2 세포의 증식을 하였다. 이 간세포 암 세포주는 15 세의 아르헨티나 소년의 종양 조직에서 설립되었다. 간 모델의 일부 영역을보다 집중적으로 다른 사람보다 recellularized했다. 이러한 차이에 대한 이유가 결정될 남아있다.

figure-results-1
그림 3. 헤 마톡 실린과 세 가지의 각 엽의 에오신 염색 간 모델을 분석 TLM1 + 2 :. 형질 간모델 1, 2; recellularized하지만 형질 도입되지 않은 Ctrl 키 : 컨트롤 간 모델입니다. 스케일 바 : 200 μm의. (참고 허가를 재 인쇄. 8) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

다음 단계에서, 간 모델의 전달을 평가 하였다. 이를 위해, DNA를 간이 모델의 각각의 펀치 생검 28로부터 제조하고, 벡터 역가 qPCR에 의해 정량화 하였다. 평균 셀 (VG / 셀) 당 55에서 90 내재화 벡터 게놈 두 형질 간 모델에서 측정되었다. 2D 세포 배양 실험에서 30 VG / 셀 강한 유전자 발현 및 RNAi를 매개 된 침묵 충분 보여준다. EmGFP의 생산은 RT-PCR 및 웨스턴 블롯으로 분석 하였다. 사실, 리포터의 발현은 각각의 mRNA와 단백질 수준에서 생검 80-90 %가 검출되었다.도 8은 전달 효율의 포괄적 인 사진을 얻기 위해 극저온 섹션 immunohistologically 분석 하였다. 도 4에서 알 수있는 바와 같이, DAPI 염색으로 가시화로 성공적 recellularized 된 간 모델의 영역도 EmGFP 발현의 면역 조직 화학적 분석에서 강한 형광 신호를 주었다. 예상대로되지 AAV 벡터로 처리 제어 간 모델은 임의 EmGFP 발현을 나타내지 않았다.

figure-results-2
EmGFP 표현의 그림 4. 면역 조직 화학적 분석 간 모델을 DAPI 염색 (파란색)에 의해 가시화했다 다시 채워 세포.; EmGFP 발현은 면역 화학적 염색 (적색)에 의해 가시화되었다. TLM1 + 2 : 형질 간 모델 (1)과 (2); recellularized하지만 형질 도입되지 않은 Ctrl 키 : 컨트롤 간 모델입니다. 스케일 바 : 200 μm의. (허가를 재 인쇄참고 문헌에서. 8) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

최종 테스트에서 hCycB의 AAV 매개 된 녹다운을 QRT-PCR로 분석 하였다. hCycB의 최저 70 ~ 90 % 사이 인 것으로 밝혀 두 형질 간 모델의 모든 돌출부 (도 5)에 대하여 평균 하였다.

figure-results-3
hCycB의 그림 AAV-형질 3D 간 모델 hCycB 5. RNAi를 매개 최저. 음소거는 QRT-PCR에 의해 결정되었다. 평균값과 표준 편차 (SD)를 비 형질 제어의 평균 값 (각각 TLM1 2) 각각의 형질 3D 간 모델의 모든 샘플에 대해 계산 된 정규화 된 (Ctrl 키.). (R의 허가를 다시 인쇄EF. 8) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

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여기에 설명 된 재구성 차원 간은 인간화 시스템에서 바이러스 벡터를 연구하는 모델을 제공합니다. 인간의 간세포 암 세포주와 쥐의 간의 ECM의 다시 채우기가 큰 바이오 의약품의 연구를 허용하는 혈관 시스템을 생성합니다. 이러한 결과는 개념 증명 재구성 간 모델을 효율적으로 바이러스 벡터로 형질 도입 될 수있다 제공한다.

여기에 도시 된 실험에서 간 각자 로브는 AAV 벡터에 의해 형질 도입 하였다. 그러나, 몇 가지 예비 실험에서, 단일 엽 세포 증식을하지 않았다. 이 혈관 폐색 시스템에서 세포 파편 또는 다른 구성 요소를 방지하는 것이 중요하다. 모든 돌출부가 관류 될 수 있는지 여부를 시험하기 위해, 페놀 레드 등의 무독성 염료 간 모델을 플러싱 할 수있다.

또 다른 중요한 문제는 멸균 간 골격을 유지하고있다. 에탄올 또는 항생제 치료는 disadv 동안antageous 혈관 시스템, γ-방사선의 세포 외 기질의 조사가 혈관을 보존 시료를 멸균.

recellularization 절차 및 시간 다시 채우기 위해 사용되는 세포의 수는 재현 가능한 결과를 얻기 위해 조정되어야 할 수 있도록 또한, 이식 된 간 크기가 다르다.

본 연구에 사용 된 쥐 간은 비교적 큰 셀 테스트 시약 (예컨대, AAV 벡터)의 대용량을 필요로한다. 또한, 다시 채우기 절차는 2 주 이상 걸렸다. 이것은 합리적인 노력을 함께 할 수있는 복제의 수를 제한합니다. 현재는보다 적은 세포 적은 테스트 시약의 사용을 허용 쥐 간 부피의 약 오분있는 마우스 간을위한 모델을 설정한다. 세포 수의 비례 미세화는 타당하지만, 정확한 양은 작고에 결정되어야그녀의 실험.

본 모델의 또 다른 단점은 간세포 인 HepG2 세포주를 사용하는 것이다. 실험은 생리 학적 관련성이 모델을 제공 유도 다 능성 줄기 세포로부터 분화 된 간세포의 사용을 개발하는 것이 계속된다. 또한, 간은 간세포, 예를 들면, 쿠퍼 세포 및 sinosoids 외에도 여러 종류의 세포로 구성된다. 우리는 ECM이 여러 세포 유형으로 recellularized 때 다른 세포 유형의 자연 환경을 다시 채워야한다고 가정합니다.

차원 간 모델은 몇 가지 장점을 결합한다. 생체 내 모델에서 기존의 가장 큰 단점은 동물 생리학은 인간의 생리 실질적으로 차이가 있다는 것입니다. 인간 환자의 치료 독성 부작용 때문에 미결 남아있다. 이러한 단점은 더 가깝게 후 생물학 반영 인간 세포 간 차원 모델을 재구성함으로써 극복 될 수있다남자 환자.

간 모델의 두 번째 장점은 동물 복지에 기여한다. 동물 성분이 재구성 실험 요구되지만 잉여 동물 즉 즉, 추가적인 동물은 필요하지 않다, 다른 동물 실험을 위해 희생되었다 사용될 수있는 바와 같이, 방법은 여전히 3R 원칙 (여분 환원, 정제)의 목적을 따른다 접근 방식은 완전히 자주 생체 실험과 연관된 동물의 고통을 피할 수 있습니다. 구 상체는 3D 시스템에서 세포 과정을 연구하기위한 대체 수단이다. 많은 생물학적 물질이 구조의 내측 부분에 깊이 침투하지 않도록하지만, 타원체는 혈관 아니다. 이러한 문제는 혈관 간 3D 모델로 극복되었다.

가 유전자 치료에 가장 유망한 후보 중에서 때문에 여기에 설명 된 실험에서 AAV 벡터는 조사했다응용 프로그램. 수많은 유전자 치료 접근법 간염 바이러스 또는 알파 -1- 항 트립신 결핍증 감염의 치료를 위해, 예를 들면, 간을 표적 겨냥은 3D 간암이 AAV 벡터를 개발하는 과정에서 사용될 수있다. 또한, 물론, 다른 hepatotropic 바이러스 벡터, 예를 들어, 아데노 바이러스 벡터의 조사에 적합하다. 또한, 이러한 간염 B 또는 C 바이러스 감염성 간염 바이러스를 연구하기 위해 사용될 수있다. 또, 예를 들면, 바이러스의 새로운 전략을 설계하는데 이용 될 수있다. 또한, 3D 모델 기관의 암을 치료 및 독성 학적 연구를 수행하기 위해 새로운 세포 증식 치료법을 개발하는 유망한 도구를 나타낸다. 긴 안목에서 인공 간은 이식 등 재생 의학에 이용 될 수있다. 함께, 차원 간 모델은 감염 생물학에 응용 프로그램 및 생물 의학 연구의 다른 분야의 넓은 범위를 제공합니다.

공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 기술 지원을 해준 베른트 크로스티츠(Bernd Krostitz), 프로젝트에 초기에 기여한 라도슬라프 케지에르스키(Radoslaw Kedzierski), 교정을 해주고 도움이 되는 의견을 해준 에릭 웨이드(Erik Wade), 생물반응기를 제공하고 장기 탈세포화에 대한 귀중한 경험을 공유해 준 헤이케 월스(Heike Walles) 교수에게 감사를 표한다. 우리는 또한 베를린 공과 대학의 프로젝트 및 출판에 대한 자금 지원에 감사드립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
인큐베이터Fraunhofer/
연동 펌프Fraunhofer/
Flange with grooveDuran2439454modified by gaffer
O-Ring 투명Duran2922551
퀵 릴리즈 클램프Duran2907151
Flat Flange LidDuran2429857gaffer에 의해 수정됨
나사산 튜브Duran2483802gaffer에 의해 수정
나사산 튜브Duran2483602gaffer에 의해 수정
실리콘 씰링 링 Duran2862012
나사 캡Duran2924013
나사 캡 조리개가 있는Duran
조리개가 있는 2922709 나사 캡Duran2922705
필터Sarstedt831,826,001
실리콘 튜빙VWR228-1500
튜브 커넥터IsmatecISM556A
생체 적합성 튜빙IsmatecSC0736
T175 배양 플라스크Greiner bio-one660 160
RPMI 1640BioWest SAS (Th. Geyer)L0501-500
글루타민BioWest SAS (Th. Geyer)X0551-100
트립신BioWest SAS (Th. Geyer)L0940-100
페니실린/스트렙토마이신BioWest SAS (Th. Geyer)L0022-100
태아 송아지 혈청CC proS-10-M
티슈-텍 O.C.T.Weckert-Labortechnik600001
HepG2DSMZACC 180
Cryomold 15 x 15 x 5 mmSakura4566
생검 펀치 4 mmpfm medical48401
Nucleospin miRNAMacherey & Nagel740971.10
뉴클레오스핀 RNA/DNA 버퍼 세트Macherey & Nagel740944
됨 됨 나사 캡 Duran 2924008

참고문헌

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재인쇄 및 허가

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3DAAVHepG2PCR

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