인지질 Scramblase 활동의 형광 기반의 분석

요약

우리는 옵신으로 재구성된 큰 단층 리포좀에서 인지질 스크램블을 측정하기 위한 형광 기반 분석을 설명합니다.

초록

Scramblases는 양방향 ATP 독립적 인 방식으로 막 이중층에 걸쳐 인지질을 이동시키다. 첫 번째 scramblase 식별 및 생화학, 감광체 로돕신의 아포 단백질을 옵신했다 확인합니다. 로돕신은 빛의 인식을 담당하는 망막의로드 시각 디스크 막에 지역화 G 단백질 결합 수용체이다. 로돕신의 scramblase 활동이 리간드 11- 시스 레티 날, 즉에 의존하지 않는다는 아포 단백질의 옵신도 scramblase으로 활성화됩니다. 스크램블링 구조적 및 규제 인지질 세포 생리에있어 중요한 역할을하지만, 몇 인지질 scramblases 지금까지 옵신 또한 확인되었다. 여기에서 우리는 옵신의 scramblase 활동의 형광 기반의 분석을 설명합니다. 옵신은 포스파티딜콜린, 포스파티딜 형광 NBD 표지 PC (1-P의 추적 량으로 구성된 대규모 단일 층 리포좀에 재구성almitoyl -2- {6- [7- 니트로 2-1,3-benzoxadiazole -4- 일) - 아미노] - 헥사 노일} - SN -glycero -3- 포스 포 콜린). Scramblase 활성 소포의 내부 전단에 위치 NBD-PC 분자들이 형광 화학적 막을 교차 할 수있는 환원제에 의해 제거되어 외주 전단에 액세스 할 수있는 정도를 측정함으로써 결정된다. 우리는 설명 방법은 일반적인 적용을 다른 막 단백질의 scramblase 활동을 확인하고 특성화하기 위해 사용될 수있다.

서론

감광체 로돕신 (문헌 ¹ 예 검토)는 원형 G 단백질 - 결합 수용체가 발견되는 인지질 제 scramblase이고 생화학 ^{2,3- 검증.} Scramblases는 transbilayer 인지질 운동의 본질적으로 느린 속도를 증가 인지질 수송있는 양방향의 생리 학적으로 적절한 수준으로, ATP 독립적 인 방식 ^4-6. 그 동작의 예는 소포체와 항시 스크램블링은 물론 당화 경로 ^(5)의 다양한 멤브레인 항상성 및 성장에 필요한 박테리아 세포질 막에서 발견 될 수있다. 이 역할 여기서 규제 인지질 사멸 세포의 표면에 포스파티딜 세린 (PS)을 노출시키기 위해 필요한 스크램블링 식세포 ⁷ - 신호 "나 먹을"단백질 인자의 생산을 촉진하는 활성화 된 혈소판에 응고 된 표면을 제공한다혈액 응고에 필요한 s의. 감광체 디스크 세포막, 로돕신의 스크램블링 활성을 ATP 의존적 단방향 지질에 의해 생성 된 이중층 두 막 전단지 간 인지질 불균형을 상쇄 제안 ABCA4 ^{4,8,9 10-12} flippase되었다.

로돕신은 세포막에서의 PS 노출에 필요한 ²⁺ 의존적 scramblases가 (기준 검토 <....

프로토콜

리포좀과 테오 1. 준비

1. 리포좀 형성
   1. 유리 주사기를 사용하여, POPC 몰비 52.5 μmol 지질을 수득하는 둥근 바닥 플라스크에 (클로로포름, 25 ㎎ / ㎖) 160 μL의 POPG (클로로포름, 25 ㎎ / ㎖) 1435 μL의 POPC를 추가 POPG = 9 : 1.
   2. (물 욕 용제이 볼륨이 필요 없음) 145 rpm의 회전 속도로 회전 증발기를 사용하여 30 분 동안 지질을 건조한 후, 실온에서 밤새 적어도 3 시간 또는 위해 진공 데시 케이 터로 플라스크를 전송할 (RT).
   3. 의 50 mM HEPES pH 7.4의 100 mM의 NaCl을 10 mL의 건조 된 지질 막을 수화 부드럽게 균질 현탁액 혼탁 결과까지 플라스크를 소용돌이 그래피 (이하, 완충액 A라고 칭함);
      주 :이 단계에서 지질 농도가 더 손실이 지금까지 발생하지 정상적으로 5.25 mm로 할 것으로 예상된다.
   4. 주파수 O 실온에서 10 분 동안 수욕에서 초음파 처리 현탁액F 40 kHz에서. 이 솔루션은 다소 명확하게 볼 것이다.
   5. 압출기를 사용하여 200 nm의 기공 크기를 갖는 멤브레인을 4 패스로 돌출하는 제 2 사이클에 이어 400 nm의 기공 크기를 가진 막을 통해 현탁액을 10 회 통과한다.....

결과

우리는 형광 기반의 분석을 사용하여 scramblase 활동의 특성을 LUVs에 옵신의 재구성에 대해 설명합니다. 우리는 스크램블링 옵신 - 중재 포스 포리 피드 속도에 하한치를 배치하고 옵신 기능적 소포로 재구성되는 올리고머 상태를 결정하는 결과를 분석한다.

최적의 재구성 조건을 식별하기 위해, 경험적으로 그들이 단백질의 삽입을 받아이되도록 LUVs을 팽윤 사용해야 세제의 양을 결정하는 것이 필요하다. 이러한 실험은도 2a에 도시되어있다. POPC의 분취 : POPG의 LUVs은 3 시간 동안 DDM 상이한 양으로 처리되는 시료의 흡광도는 540 nm의 때문에 소포 크기의 탁도 측정 및 측정된다. 540 nm의 (OD ₅₄₀₎ 그래프에서 측정 된 광학 밀도는 소포가 DDM의 CONCENTR로 팽창 보여줍니다A.......

토론

scramblase 활동 분석은 옵신는 인지질의 scramblase ^활동이이 결정하기 위해 원래 우리를 활성화. 분석은 또한 우리 특이성을 테스트하여 옵신의 scramblase 활성을 특성화하도록 허용 (우리는도 1a에 NBD-PC에 대해 표시 나에로 아실 체인 NBD 표지 NBD - 포스파티딜 에탄올 아민 등의 NBD 표지 된 리포터 지질의 다양한 사용 헤드 그룹, NBD-핑고 마이 엘린 또는 NBD-의 포스파티딜 ²⁾ 지질 소포 조성물 (효과 등, 소체의 구성 성분으로서 상이한 양의 콜레스테롤) 및 옵신 모든 전시 scramblase 활성 로돕신의 상이한 구조적 상태 여부. 이러한 분석은 인지질 비 구체적이고 로돕신의 구조적 상태와 무관하거나 ^2,3의 발색단이 망막 포함 여부 (> 초당 10,000 인지질), 로돕신의 scramblase 활동이 매우 빠른 것으로 나타났습니다. 이리,우리는 옵신를 포함 테오를 생성하.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린	Avanti 극성 지질	850457C	POPC
, 1-팔미토일-2-올레오일-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (나트륨 염)	Avanti Polar Lipids	840457C	, POPG
, 1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	810130C	NBD-PC
4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산	VWR Scientific	EM-5330	HEPES
NaCl	Sigma	S7653-1KG	NaCl
Dodecyl-β-D-maltoside	Anatrace	D310 5 GM	DDM
형광계 큐벳	sigma	C0918-100EA	큐벳
분광 형광계	Photon Technology International, Inc.	플루오리미터
나트륨 하이드로설파이트 기술 등급, 85%	Sigma	157953-5G	디티오나이트
GraphPad Prism 5 소프트웨어			Prism
Tris Base	VWR	JTX171-3	Tris
LIPEX 10 ml 압출기	노던 리피드, Inc.		압출기
Whatman, 드레인 디스크, PE, 25mm	시그마	28156-243	디스크 지원
Whatman Nuclepore 트랙 에칭 멤브레인, 0.4 &마이크로; m, 직경 25mm	Sigma	WHA110607	400nm 멤브레인
Whatman Nucleopore 트랙 에칭 멤브레인, 0.2 &마이크로; m, 직경 25mm	시그마	WHA110606	200nm 멤브레인
인산나트륨	Sigma	S3264-500G
VWR 배양 튜브, 일회용, 붕규산 유리, 13 x 100mm	VWR Scientific	47729-572	유리관
과염소산	시그마	30755-500ML
암모늄 몰리브덴산염 테트라하이드레이트	시그마	A-7302	암모늄 몰리브덴셜
(+)-나트륨 L-아스코르브산	시그마	A7631-25G	나트륨 아스코르브산염
바이오 비즈 SM2 흡착제	바이오 라드	1523920	폴리스티렌 비즈
2.0 ml 마이크로튜브 클리어	VWR Scientific	10011-742	재구성
튜브	VWR Scientific	53283-800	재구성 유리관
Zetasizer	맬번		증권 시세

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