단백질 상호 작용은 세포의 기능의 핵심이다. 열량 및 분광 기술은 일반적으로 그 특성을하는 데 사용됩니다. 여기에서 우리는 Shwachman - 다이아몬드 증후군 (SBDS)에 돌연변이 단백질과 신장 인자 같은 1는 GTPase (EFL1) 사이의 상호 작용을 연구하는 도구로 형광 이방성을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
단백질 - 단백질 상호 작용은 살아있는 유기체의 기능에 필수적인 역할을한다. 상호 작용이 식별되고 확인되면 그 구조 및 기계적인 레벨을 특성화하는 것이 필요하다. 여러 생화학 및 생물 물리학 적 방법은 이러한 목적을 위해 존재한다. 형광 표지 된 단백질의 형광 강도가 단백질 - 단백질 상호 작용에 따라 일정하게 유지 될 때 그 중에서도 형광 이방성 특히 사용하는 강력한 기술이다. 이 방법에서, 형광 표지 된 단백질을 선택적으로 수신 빔의 상대적인 방향에 따른 형광체의 일부를 여기 적절한 파장의 수직 편광 된 광에 의해 여기된다. 다음과 같이 생성 된 배출량은 누구의 수직 및 수평 평면에 관계 이방성 (r)을 정의하는 방향성을 가지고 : r은 (I VV -I VH가) / (I VV + 2I VH), 나는 절과 I = 위치
서론
세포는 끊임없이 서로 상호 작용 생체 거대 분자의 다수 포함되어 있습니다. 이 연관은 신호 전달, 유전자 발현 및 다른 이들 세포 이동의 조절에서 이들의 기능을 담당 세포 경로에 참여 착물을 일으킨다. 세포 내에서 발생하는 모든 단백질 - 단백질 상호 작용은 상호 작용 체라고하는 네트워크를 포함한다. 사카로 마이 세스 세레 비지에서의 단백질의 70 % 이상이 상호 작용 파트너 일을하는 것으로 나타났다. 셀의 상호 작용 체를 이해하고 그 기능은 복잡성과 생물의 다양성에 관련 정보를 제공합니다. 여러 방법은 단백질 - 단백질 상호 작용을 확인하고 특성화하기 위해 설명되었다. 효모 두 하이브리드 2, 단백질 단편 보완 분석 (3), 질량 분석 및 단백질 microarra에 결합 친 화성 정제 4로 넣어 방법을 통해 높은 다른YS는 5,6- 작용을 식별하기 위해 사용된다. 식별되면,이를 검증하기 위해 필요하며, 이는 경우에 따라 달라질 수있다. 일반적으로, 이들 실험은 유전자 결실 또는 단백질 중 하나의 과다 발현에 의해 상호 작용 쌍 등의 각 부재의 수준에서 작용 자체를 방해 포함하고 상기 다른 부재의 특성의 변화 나 함수를 찾고 세포 수준. 이어서,....
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프로토콜
1. SBDS 플래시 태그 단백질 발현 및 정제
주 : 이방성 실험 들어, 플래시 태그 시스테인은 시스테인 - - 프로의 Gly-Cys 또는 Cys이고-는 PCR에 의해 서열을 코딩하는 인간 SBDS의 C 말단에 추가 된 시퀀스에 대응. 이 구조는 발현 벡터 pRSET-A에 서브 클로닝하여 N- 말단 헥사 히스티딘 태그 (그의 태그)를 코딩하는 단백질을 발현하는 대장균 C41 세포에 형질 전환하고, 시퀀스 및 C 말단 플래시 태그 (10)를 부호화 인간 SBDS.
- SBDS 플래시 단백질 발현
- 관할 E. 변환 표준 열 충격 프로토콜 (19)을 이용하여 플라스미드 pRSET-HisSBDS 플래시와 대장균 C41 셀. 100 μg의 / ㎖의 앰피 실린이 보충 된 고체 루리아 - 베르 타니 (LB) 배지에서 세포를 플레이트. LB 고체 배지 조성물은 10g의 NaCl, 5g 효모 추출물, 10g 트립 톤 1 L의 볼륨 20g 한천로 구성되어 있습니다.
- 37 ° C에서 문화 형질 전환 된 박테리아까지600 nm의 (A 600)에서 흡광도를 100 μg의 / ㎖의 앰피 실린이 보충 된 LB 액체 매....
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결과
어떤 이방성 실험을 수행하기 위해 그 종의 혼합물의 관찰 이방성을 수학 식 5에 의해 표현되기 때문에, 형광체의 형광 강도의 큰 변화를 배제하는 것이 중요하다 :
F 내가 각 구성 요소 및 R의 소수 형광을 나타낸다 내가 해당 이방성이다. 각 성분의 소수 형광 양에 따라 식 (6)에 의해 정의되는 농도 및 상대적인 형광 :
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토론
단백질과 대부분의 생화학 실험에 관계없이 사용되는 기술, 순수 단백질뿐만 아니라, 그들 중 많은 양뿐만 아니라 필요합니다. 그것은 여기에 제시된 경우와 같이이 때문에, 실험의 이러한 유형에 사용되는 단백질은, 이종 발현에 의해 얻어진다. 개화 분광법은 공부 분자에 형광의 존재를 필요로한다. 이들은 대부분의 단백질에 공통적 모두에 존재할 것이기 때문에, 방향족 잔기가 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하기 위해 분석을 그 신호를 복잡하게 이용하지만, 단백질의 고유 형광을 구성 수용체 단백질과 리간드. 또한 트립토판의 수명은 형광 이방성 실험하기에는 너무 짧다. 이러한 이유로, 단백질 연구 중 하나 외인성 형광 단을 추가하는 것이 일반적이다. 이를 위해, 형광 염료 4 ', 5'- 비스 (1,3,2 dithioarsolan -2- 일) - (F) 사이의 배위 결합을 통해 SBDS의 C 말단에 첨가유전 공학에 의한 단백질에 도입 된 tetracysteine 모티브로 luorescein. 형광을 지탱 단백질을 선택하.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없으며 경쟁하는 금전적 이해관계도 없습니다.
감사의 글
저자는 CONACyT 프로젝트 번호 167359 및 177138와 DGAPA-UNAM 프로젝트 번호 IN201615의 재정적 지원을 인정합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.5mm 유리 구슬 | Biospec 제품 | 11079105 | |
| Tris Base | Formedium | TRIS01 | 초순수 |
| 글리세롤 | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| 염료 4',5'-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein | ThermoFischer Scientific | LC6090 | 이 키트에는 FlAsH 태그 Ampiciline을 표시하는 염료가 포함되어 있습니다 |
| IBI Shelton Scientific, Inc | IB02040 | ||
| D(+)-글루코스 무수 | formedium | GLU03 | |
| D(+)-갈락토스 | formedium | GAL03 | |
| L-류신 | formedium | DOC0157 | |
| l-tryptofan | Formedium | DOC0189 | |
| Bezamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | B6506-5G | |
| PMSF | Gold Biotechnology, Inc | P-470-25 | Phenylmethylsulfonyl fluoride |
| NaCl | Formedium | NAC02 | 염화나트륨 |
| 글리세롤 | Tecsiquim, S.A. 드 C.V. | GT1980-6 | |
| MgCl2 | Merck Millipore Corporation | 1725711000 | 염화마그네슘 |
| 이미다졸 | 시그마-알드리치 | I2399-500G | |
| 2-메르캅토에탄올 | 시그마-알드리치 | M6250-100ML | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786-500G | 인산칼륨 이염 기성 |
| NaH 2 < / sub>PO 4 < / sub> | Sigma-Aldrich | S3139-500G | 인산 나트륨 아미노산이없는 일 염 |
| 효모 질소 염기 | Formedium | CYN0410 | |
| 효모 추출물 | Formedium | YEM03 | 마이크로 과립 |
| L-Tyroisne | Formedium | DOC0193 | |
| 아데닌 황산염 | Formedium | DOC0230 | |
| Casamino acids | Formedium | CAS03 | |
| Tryptone | IBI Shelton Scientific, Inc | IB49182 | |
| IPTG | Formedium | IPTG025 | |
| 여과 유닛 | Merck Millipore Corporation | UFC901096 | Amicon Ultra-15, membrana PLGC Ultracel-PL, 10 kDa |
| 멤브레인 필터 | Merck Millipore Corporation | GSWP04700 | 멤브레인 필터, 혼합 셀룰로오스 에스테르, 친수성, 0.22 &마이크로; 남, 47 mm, 흰색, 일반 |
| Ni2+ 친화도 칼럼 | QIAGEN | 30760 | 카트리지는 5 ml Ni-NTA Superflow |
| Strong Sulfopropyl 양이온 교환기 컬럼 | GE Healthcare Life Science | 17-5157-01 | HiTrap SP Sepharose FF 5 ml |
| 크기 제외 컬럼 | GE Healthcare Life Science | 28989335 | HiLoad 16/600 Superdex 200 PG |
| 형광 셀 | Hellma Analytics | 111-057-40 | |
| 분광 광도계 | Agilent Technologies | G6860AA | 캐리 60 UV-Vis |
| 셰이커 | ThermoFischer Scientific | SHKA4000-7 | MaxQ 4000 벤치탑 온도 범위 Ambient-15° to 60° C |
| Centrifuge | ThermoFischer Scientific | 75004271 | Heraeus Megafuge 16R |
| FPLC | Pharmacia Biotech | 단종 | FPLC 시스템 전도도 UV-MM II 모니터 P500 펌프 분 |
| 획 분광 형광계 | Olis | 해당 없음 | Olis DM 45 with Polarization Toolbox |
참고문헌
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).
- Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340, 245-246 (1989). <....
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