여기에서는 zymosan 및 IgG 코팅 비드를 포함하여 0.5μm보다 큰 곰팡이, 칸디다 알비칸스 및 미립자와 같은 병원체의 식세포작용 중 이벤트의 초기 폭포를 시각화하고 정량화하는 현미경 기반 기술에 대해 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
포유류의 몸은 병원균의 침입으로부터 자신을 방어하는 데 도움이 메커니즘의 다양한 계층이 장착되어 있습니다. 이러한 호중구, 수지상 세포, 대 식세포 등 - - 면역 시스템의 전문 식세포 감지하고 식균 작용 (1)를 통해 이러한 침입하는 병원균을 취소 할 수있는 타고난 능력을 유지합니다. 식균 작용은 세포 표면 2, 3에서 막 개편과 액틴 리모델링의 안무 이벤트를 포함한다. 식세포가 성공적으로 내면화와 식균 작용의 모든 단계가 충족 된 경우에만 외국 분자를 근절. 이러한 단계는 인식 및 세포 표면에 존재하는 패턴 인식 수용체에 의한 병원균 (PRRS)의 결합을 포함 액틴 부화 막의 돌기 (pseudopods) 내지 식세포 컵의 형성은 미립자를 둘러싸하고 phagosome의 절단은 phagolysosome 성숙이어서 그 결과병원체 3,4- 사멸.
식균 작용의 다양한 단계의 이미징 및 정량이 세포 과정의 분자 메커니즘을 해명하기위한 수단이다. 본 원고는 식균 작용의 여러 단계를 공부하는 방법을보고합니다. 우리는 시각화하고 바인딩, 식세포 컵 형성을 정량화 할 수있는 현미경 기반의 접근 방식, 그리고 식세포에 의해 입자의 국제화에 대해 설명합니다. 식세포에 타고난 수용체가 더 큰 0.5 μm의, 우리는 여기에 제시 분석은 병원성 곰팡이 칸디다 알비 칸스 및 자이 모산과의 IgG 코팅 구슬과 같은 다른 입자의 사용을 포함하는 대상 입자에 리간드가 발생할 때 식균 작용이 발생있다.
서론
박테리아, 바이러스, 곰팡이 등 병원균에 지속적으로 노출에도 불구하고, 우리 몸에 잘 감염에 대한 보호를 제공하는 면역 메커니즘을 갖추고있다. 선천성 면역 시스템은 침입하는 병원체에 대한 방어의 첫 번째 줄과 인식 및 외국 목표를 내면화 식세포에 주로 의존한다.
식균 작용은 0.5 μm의보다 큰 원치 않는 미립자의 말림을 포함 진화론 보존 세포 과정이다. 대 식세포는 말림 3 종래 병원균에 존재하는 병원체 - 관련 분자 패턴 (PAMPs가)를 인식 할 수 있도록 세포 표면에서 (또한 패턴 인식 수용체 PRRS라고도 함) 면역 수용체의 넓은 범위를 표현한다. 병원체가 세포 표면 수용체 클러스터링 다음과 식세포 컵의 형성을 유발 바인딩. 이 주위에 돌출 굴지 중심의 막 리모델링 결과타겟은, 결국 감싸는와 핀치 오프하면 이산 phagosomal 액포 2,5-을 형성한다. phagosome는 성숙하고 phagolysosome (6)을 형성 후기 엔도 좀과 리소좀과 이후의 융합에 의해 산성화.
식균 작용은 수....
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프로토콜
DC2.4 및 RAW 264.7 세포주 1. 준비
주 : 마크로파지 형 세포주 RAW 264.7 및 수지상 세포주 DC2.4 모두 뮤린 기원이며, 다음의 조건은 세포 성장을 위해 사용되었다.
- 보충 된 DMEM에서 RAW 264.7 세포 (둘 베코 최소 이글 배지) 철 10 %, 5 % CO 2 인큐베이터에서 가습 37 ℃에서 비활성화 된 태아 소 혈청 (FBS).
- L 글루타민 대신 DMEM 보충 사용 RPMI (로스웰 파크 메모리얼 연구소) 매체를 제외하고, RAW 264.7 세포의 그것과 유사한 조건에서 DC2.4 세포를 성장.
2. 형광 공액 미립자의 제조 : C. albicans에, 자이 모산, IgG의 코팅 비즈
- 칸디다 알비 칸스 성장
- 열린 우리당 (2 % 박토 - 펩톤, 1 %로 보충 YPD 25 ml의 냉동 글리세롤 재고에서 C. albicans에 스트레인 SC5314 접종효모 추출물, 2 % 글루코스 밤새 30 ° C에서 80 μg의 / ㎖의 우리 딘).
참고 : OD (12)의
- 열린 우리당 (2 % 박토 - 펩톤, 1 %로 보충 YPD 25 ml의 냉동 글리세롤 재고에서 C. albicans에 스트레인 SC5314 접종효모 추출물, 2 % 글루코스 밤새 30 ° C에서 80 μg의 / ㎖의 우리 딘).
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결과
식균 작용의 다른 단계를 모니터링하는 현미경 기반 방법이 제공된다. DC2.4 세포에 의해 다양한 형광 입자의 식균 작용 동안 다른 이벤트가 표시됩니다. 여기에 설명 된 기술을 사용하여, 우리는 식세포 작용의 초기 단계에서 스핑 고리 피드의 역할을 조사 하였다. 이를 위해 Sptlc2는 스핑 고지 생합성 경로에서 제 속도 - 제한 단계를 촉매하는 효소의 유전자가 결핍 DC2.4 수지상 세포를 사용 하였다. 야생형 세포에 비해 Sptlc2는 - / - 세포 DC2.4 크게 세라마이드, 스 핑고 미엘린 및 글루코 8 포함한 스핑 고리 피드의 수준을 감소시켰다. Sptlc2 - / - DC2.4 세포뿐만 아니라, C. 알비 칸스, 모산 및 IgG의 라텍스 비드 (8)의 흡수에 결합 불량하다. 도 1에서, DC2.4 셀 내의 결합 형광 접합-모산 입자가 도시된다 (.......
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토론
대 식세포 및 수지상 세포와 같은 전문 식세포, 삼켜 때문에 병원균이 침입 숙주 방어 시스템의 중요한 요소 식균 작용을 제거한다. 이 과정에서 식세포는 세포 표면 8, 19, 20에서 광범위한 막 조직 개편과 세포 골격 재 배열을 받다. 더 나은이 역동적 인 과정을 이해하기 위해, 식균 작용의 다른 단계의 시각화는 필수적이다. 여기서 우리는 식세포의 다양한 단계를 모니터링하는 데 사용 된 현미경 기반 방법을 설명했다.
라이브 영상 법의 주요 의미는 분자 수준에서 호스트 병원체 인터페이스를 모니터링하는 놀라운 능력을 제공한다는 것이다. 미생물 감염의 주요 단계의 시각화를 허용함으로써, 라이브 영상의 면역 반응의 기본적인 특성에 대한 통찰력을 제공 임계병원균 8,.......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
감사의 글
우리는 이미징을위한 MIT의 화이트 헤드 연구소의 웬디 연어와 중사 님 시설의 니키 왓슨 감사합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| β-Mercaptoethanol | AppliChem | A1108 | |
| 소 혈청 알부민(BSA) | 세포 신호 기술 | 9998 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | ThermoFisher | D3571 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | ThermoFisher | BP-231-1 | |
| DMEM (Dulbecco' s 미니멀 이글' s medium) | Gibco | 11965 | |
| PBS, 1x (Phosphate- Buffered Saline) | Corning cellgro | 21-031-CV | |
| Fetal Bovine serum | Sigma Aldrich | 12003C | |
| FITC-coupled IgG-coated latex beads | Cayman | 500290 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | ThermoFisher | 25030081 | |
| Paraformaldehyde Solution (PBS 중 4%)) | Affymetrix | 19943 1 LT | |
| 페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/ml) | ThermoFisher | 15-140-122 | |
| Phalloidin-Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A12379 | |
| RAW 264.7 cells | ATCC | TIB-71 | |
| RPMI (Roswell Park Memorial Institute) | Gibco | 61870 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | S7900 | |
| Trypan blue solution (PBS에서 0.4% (w/v)) | Corning cellgro | MT25900CI | |
| Trypsin-EDTA (1x) (0.05%) | ThermoFisher | 25300054 | |
| Tween 20 Surfact-Amps 세제 솔루션 | ThermoFisher | 85114 | |
| Zymosan-Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | Z23374 | |
| 챔버 1.0 붕규산 커버글라스 시스템(챔버 8개) | ThermoFisher | 155361 | |
| Glasstic slide 10 with grids | Hycor | 87144 |
참고문헌
- Janeway, C. A. Jr, Medzhitov, R. Innate immune recognition. Annu. Rev. Immunol. 20, 197-216 (2002).
- Underhill, D. M., Goodridge, H. S. Information processing during phagocytosis. Nat. Rev. Immunol. 12, 492-502 (2012).
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S.
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재인쇄 및 허가
