방법 논문

센다이 바이러스 원심 분리를 이용하여 혈액 세포로부터 유도 만능 줄기 세포의 생성

DOI:

10.3791/54650

⸱

2016년 12월 21일

 ,  , 
1CiSTEM Laboratory, Convergent Research Consortium for Immunologic Disease, Seoul St. Mary's Hospital, College of Medicine, The Catholic University of Korea, 2Division of Rheumatology, Department of Internal Medicine, Seoul St. Marys Hospital, Institute of Medical Science, College of Medicine, The Catholic University of Korea

이 논문에서

요약

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우리는 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 유도만능줄기세포(iPSC)로 재프로그래밍하는 프로토콜을 제안합니다. 원심분리를 통해 형질도입된 혈액 세포를 매트릭스 코팅된 플레이트에 도금함으로써 부유 세포에서 iPSC를 성공적으로 유도할 수 있습니다. 이 기술은 PBMC 및 CBMC와 같은 셀에 대한 간단하고 효과적인 재프로그래밍 프로토콜을 제안합니다.

초록

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인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)의 최근의 발전은 성숙한 체세포는 미분화, 만능 상태로 돌아갈 수 있음을 증명했다. 초기 실험은 일반적으로 피부 섬유 아세포로 행해졌 등 각질 세포, 소변 세포, 섬유 아세포, : 지금, 프로그래밍 다양한 성인 체세포의 종류 이루어집니다. 그러나 이는 환자의 섬유 아세포를 수득 침습 수술이 필요했다. 따라서, 혈액 및 소변 세포와 같은 세포 현탁액이 때문에 일차 세포를 얻는 편리함 프로그래밍 이상적으로 간주 하였다. 여기서, 우리는 말초 혈 단핵 세포 (PBMC)에서 IPSC 생성하는 효율적인 프로토콜을보고한다. 새로운 매트릭스 도장 판하여 원심 직렬로 형질 도입 된 PBMC를 도금함으로써,이 프로토콜은 쉽게 IPSC 콜로니를 제공 할 수있다. 이 방법은 또한 제대혈 단핵구 (CBMCs)에 적용 가능하다. 본 연구는 간단하고 효율적인 PROT를 제시PBMC를하고 CBMCs의 재 프로그래밍에 대한 ocol.

서론

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줄기 세포는 최근 몇 년간 한 임상 치료에서 가장 매력적인 물질 중 하나이었다. 줄기 세포의 분화능 매력적인 특성과 자기 갱신 할 수있는 기능이다. 1981 년, 제 배아 줄기 세포 (는 ESC)는 마우스 배아 (2)로부터 분리 하였다. 이 기술은 인간 배아에 적용된 때, 그것은 여러 윤리적 문제에 직면했다.

박사 야마나카와 그의 팀이 마우스 체세포에서 첫 번째 만능 세포를 재 프로그램 할 때 2006 년, 줄기 세포 분야는 가능성을 회복하고 관심은 3 재연했다. 여러 정의 요소를 제공함으로써, 다 능성 줄기 세포가 성공적으로 성숙한 체세포에서 "유도"이었고, 따라서 지명되었다 "(iPSCs)를 유도 만능 줄기 세포." 2007 년,이 기술은는 ESC의 정확한 특성을 가진 세포를 산출, 인간 세포 4에 적용되었지만 윤리적 논쟁 없음. 이론적으로 유도 만능 줄기CS는 개인 또는 환자로부터 얻은 세포 유형에서 생성 될 수있다. 환자 별 iPSCs는 질병 표현형 및 각 개별 환자의 후생 유전 학적 조건을 시뮬레이션 할 수있는 잠재적 인 도구로 상승하고있다. 유전자 편집 또는 병원성 상태를 반전 할 수있는 다른 방법을 사용하여 환자 별 iPSCs 또한 개인화 된 약 5에서 사용될 수있다. 그들은 6 자동 이식을 더욱 가능하게, 도너와 같은 면역 ID를 가지고 있기 때문에 또한 iPSCs 덜 면역 거부 반응과 연관된다. 따라서, iPSCs 질병 모델링, 약물 검사, 및 재생 치료에서 가장 유망한 플랫폼이되었다. 이러한 혜택, 지속적으로 개발 중에있는 작은 셀 소스에서 시간의 최소 금액에서 순수하고 높은 수율을 줄 수있는 개선 된 프로토콜을 감안할 때. 미래의 애플리케이션에 가장 효율적인 프로토콜을 찾는 하나의 중요한 고려 사항은 일차 전지 유형이다. 초기 IPSC 생성 프로토 대부분의COLS은 원래 IPSC 라인은 피부 섬유 아세포 (4)로부터 유도 된 이후 부착 세포에 최적화되어 있습니다. 그러나, 이들 세포의 분리 및 제조는 노동 집약적이다. 또한, 피부 섬유 아세포의 분리는 광범위한 응용 프로그램의 주요 단점이 될 수 침습 수술 절차가 포함되어 있습니다.

따라서, iPSCs의 추가 사용, 편리한 수집과 셀 소스가 필요합니다. 그것은 오히려 최소 침습 절차 7-9 통해 획득하기 때문에 혈액 이상적인 셀 소스로서 간주된다. 본 연구는 말초 혈 단핵 세포 (PBMC)에서 hiPSCs 발생 프로토콜에 대한 간단한 수정을 개발 하였다. 예컨대 CD34 + 세포와 같은 특정 세포 유형의 어려운 팽창 과정없이 전혈 세포 또는 PBMC를 직렬 야마나카 인자 함유 센다이 바이러스 형질 도입 한 후 원심 분리하여 매트릭스 - 코팅 된 플레이트 상에 플레이 팅 하였다. 이 방법은 요구되는 시간을 단축형질 도입 부유 세포의 부착과 자신에 부착 할 수 없었다 재 프로그래밍 셀의 손실을 감소시켰다.

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프로토콜

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윤리 진술 : 본 연구 프로토콜 가톨릭 대학교 (KC12TISI0861)의 기관 검토위원회에 의해 승인되었다.

혈액에서 단핵구 세포의 분리 (1)

  1. 단핵구 세포의 분리 (일 -5)
    1. 셀 준비 튜브 (CPT)에서 혈액 추첨에서 신선한 혈액의 10 ml의를 얻습니다.
    2. 새로운 50ml의 원뿔형 튜브에 혈액을 전송하고 하나의 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)로 희석 : 4 비율.
      주 : 희석 높은 비율은 더 높은 순도를 위해 사용될 수있다.
    3. 새로운 50ml의 원뿔형 튜브에 밀도 구배 배지 10 ㎖를 첨가하고 신중 밀도 구배 매체 위에 희석 혈액 층을 포함한다. 원심 브레이크없이, 실온 (RT)에서 30 분 동안 750 × g으로 원심 분리기.
    4. 조심스럽게 새로운 50ml의 원뿔형 튜브에 버피 층 전송 튜브를 PBS 30 mL를 넣고 세포를 세척 하였다.
    5. RT에서 5 분 동안 515 XG에 세포를 원심 분리기.
    6. PBS를 폐기하고 혈액 세포 배지 0.5 ml의 세포를 재현 탁.
    7. 세포를 카운트하고, 24 웰 플레이트의 웰 당 1 × 10 6 세포를 접시. 증발을 방지하기 위해 주변의 우물에 PBS를 추가합니다.
    8. 전달 전에 5 %에서 37 ° C에서 CO 2 5 일 동안 세포를 안정화. 세포를 방해하지 않고 일 3-4에 신선한 혈액 세포 미디어의 추가 0.5 ML을 추가합니다.

센다이 바이러스 2. 형질

  1. 전달 (0 일)
    1. 모아서 15 ml의 원추형 튜브에 혈액 세포를 전송하여 혈구를 사용하여 계산.
    2. 전달 당 3 × 10 5 세포를 준비하고 실온에서 5 분 동안 515 XG에서 세포를 원심 분리기.
    3. 흡인함으로써 상층 액을 제거하고 혈액 세포 배지 0.5 ml의 세포를 재현 탁.
    4. 비 코팅 24- 웰 플레이트의 웰에 세포를 옮긴다.
    5. 얼음 센다이 바이러스 액을 해동하고, SU에 추가spended 세포. 제조업체의 권장 사항에 따라 세포에 센다이 바이러스를 추가합니다.
    6. 밀봉 막 접시를 밀봉하고 30 ℃에서 30 분 동안 1150 × g으로 원심 분리하여 그것을.
    7. 원심 분리 후, 5 % CO 2 밤새 (O / N)으로 37 ℃에서 세포를 배양한다.
  2. 공급 매트릭스 셀 전송 (1 일)
    1. 다음 날, 코트 비트로 넥틴과 24 웰 플레이트. 최종 5 μg의 / ㎖ 농도에 대한 PBS의 비트로 넥틴 솔루션을 희석. 24- 웰 플레이트의 웰에 비트로 넥틴 1 ㎖를 첨가하고, 적어도 1 시간 동안 RT에서이를 부화. 사용 전에, 코팅 용액을 제거한다. 코팅 된 플레이트 3 일 동안 실온에서 저장 될 수있다.
    2. 잘 코팅에 세포와 바이러스를 포함하는 모든 미디어를 전송합니다.
    3. 신선한 혈액 세포 미디어의 추가 0.5 ㎖의 나머지 세포를 수집하고 세포를 함유 웰에 추가한다.
    4. 35 ° C에서 10 분 동안 1,150 XG에서 접시를 원심 분리기.
    5. 센트 후rifugation, 상층 액을 제거 IPSC 미디어 1 ㎖를 추가하고, 5 % CO 2 O / N 37 ° C에서 세포를 유지한다.
  3. 제 2 셀 트랜스퍼 (주 2)
    1. 코팅 단계 2.2.1에 기술 된 바와 같이 5 μg의 / ㎖ 비트로 넥틴과 새로운 24- 웰 플레이트의 웰. 각 형질에 대한 플레이트 잘 하나를 사용합니다.
    2. 새롭게 코팅 된 비트로 넥틴 플레이트에 상기 제 1 플레이트로부터 세포 현탁액을 전송.
      주의 : 필요하지 않으면, 현탁 세포는 폐기 될 수있다. 단계 2.3에서 설명한 절차는 현탁 세포를 2-3 회 반복 할 수있다. 단계가 반복 될 경우, 세포를 수확.
    3. 한편, 5 % CO 2 O / N에서 37 ℃를 유지 관리를 위해, 제 1 플레이트의 웰에 IPSC 배지 1 mL를 넣어 배양한다.
    4. 37 ° C에 부착 된 세포를 유지하고 5 % CO 2와 신선한 IPSC 미디어와 함께 매일 미디어 변경을 수행합니다. 식민지는 전달 후 일에 14-21 나타납니다.
    5. CentrifugE 1150 XG 10 분간 35 ℃에서 현탁 세포를 포함하는 새로 도장 판.
    6. 원심 분리 후, CO 2 O / N이 5 %에서 37 ℃에서 세포를 배양한다.
    7. 다음날, 상층 액을 제거하고 신선한 IPSC의 용지로 교체합니다.
      주의 : 단계 2.3에서 설명한 절차는 현탁 세포를 2-3 회 반복 할 수있다. 단계가 반복 될 경우, 상층 액에 세포를 수확 단계 2.3를 반복합니다.
    8. 80 % 포화 상태에 도달 할 때까지 매일 미디어 변화에 부착 된 세포를 유지한다.

3. 재 프로그래밍 셀 유지 보수

  1. 24 웰 플레이트 배양 후 조기 유지 보수
    1. 세포가 합류 일단 7-10일 전달 후하는 비트로 넥틴 코팅, 60-mm 요리를 준비합니다. 최종 5 μg의 / ㎖ 농도에 대한 PBS에서 비트로 넥틴 솔루션을 희석. 접시에 비트로 넥틴의 1 ML을 추가하고 적어도 1 시간 동안 실온에서 그것을 품어.
    2. 씻어PBS로 세포와 세포를 분리 PBS / 1 mM의 EDTA 1 ㎖를 추가합니다.
    3. 2 분 동안 CO 2, 37 ℃에서 인큐베이션을 5 %.
    4. 세포를 수확하고 2 분 동안 250 XG와 RT에서 그들을 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 신선한 IPSC 미디어의 3 ml의 세포를 재현 탁.
    5. 새로 코팅 된 60 mm 접시에 모든 재현 탁 세포를 플레이트.
    6. 세포가 80 % 컨 플루 언트 될 때까지 5 % CO 2에서 37 ° C에서 그들 세포에 10 mM의 Rho 키나아제 억제제를 추가하고 유지한다.
  2. 식민지 모양에 대한 분할 (서브 클로닝 준비)
    1. 단계 3.1.2에 설명 된대로 비트로 넥틴 코팅, 100-mm 요리를 준비합니다.
    2. PBS로 세포를 세척하고 세포를 분리 PBS / 1 mM의 EDTA 1 ㎖를 추가합니다.
    3. 2 분 동안 CO 2, 37 ℃에서 인큐베이션을 5 %.
    4. 세포를 수확하고 2 분 동안 250 XG와 RT에서 그들을 원심 분리기.
    5. 혈구를 사용하여 세포를 세어 접시 당 1 × 104 세포를 준비합니다.
    6. 250 XG에서 세포를 원심 분리기 및 RT 2 분.
    7. IPSC 배지 6 ㎖, 재현 탁에 1 × 104 세포가 도포 100 mm 접시에 입혀, 미디어에 10mM의 Rho 키나아제 억제제를 추가한다.
    8. 큰 식민지가 나타날 때까지 일주일 동안 5 %에서 37 ° C에서 CO 2 세포를 품어.
      참고 : 유지 및 서브 클로닝을 위해 식민지를 확장합니다. 서브 클로닝은 일반적으로 5 구절 아래에 이루어집니다.
  3. 식민지 용액을 분리 IPSC 식민지를 사용하여 따기
    1. 식민지 따기, 씨앗 단계 3.2.7에서 언급 한 바와 같이 비트로 넥틴 코팅, 100 mm 접시에 1 × 104 세포, 전에 일주일.
    2. 비트로 넥틴 용액 2 ㎖를 추가하고 적어도 1 시간 동안 실온에서 배양하여 비트로 넥틴 코팅, 60-mm 요리를 준비합니다.
    3. 현미경 (40X 또는 100X 배율)을 통해 관찰함으로써, 마커 펜을 사용하여 명확한 경계와 식민지를 표시합니다. 단계 3.3.2에서 만든 새로운 판에서 비트로 넥틴 솔루션을 제거하고 6 ml에 추가IPSC의 매체는 10 mM의 Rho 키나아제 보충.
    4. 세포에서 배양 배지를 제거하고 PBS 3 ㎖로 씻는다.
    5. IPSC 식민지 분리 액 1ml를 추가하고 RT에서 30 초 동안 그들을 품어.
    6. 플레이트에서 솔루션을 제거하고 추가로 30 초 동안 RT에서 그것을 품어.
    7. P200 피펫을 사용하여 판에서 미디어 200 μl를 그리는 피펫 팅하여 대상 식민지를 분리합니다. 새로운 100 mm 접시에 흩어져있는 식민지를 전송합니다.
    8. 부화 및 5 % CO 2에서 37 ℃에서 세포를 유지한다.
      참고 : 그들이 10 특성이 적어도 10 구절 이후에 이루어졌다 통로에 도착할 때까지 순수한 IPSC 식민지를 획득 한 후, 세포를 유지 하였다. 항체 희석 및 프라이머 정보는 표 1 및 표 2에 나타낸다.

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결과

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이 프로토콜은 혈액에서 분리 된 PBMC를 재 프로그램 할 수있는 간단한 방법을 제시한다. 직렬 원심 도금의 조합을 사용 iPSCs 성공적으로 생성되었다. 이 방법은 iPSCs 단리 또는 특정 세포 유형을 확장하지 않고 전체 혈액 세포의 적은 양으로 생성 될 수있다. 우리는 성공적으로 작은 세포 배양 접시 만 1 × 104 세포에서 iPSCs를 생성합니다.

프로그래밍 전에, 혈액 세포를 밀도 구배 매체를 사용하여 분리 하였다. 혈액 세포는 오일 분리 한 후 형질 도입 하였다. 도 1a는 현탁 세포 리 프로그래밍 방법의 방식을 도시한다. 분리 후, PBMC를 센다이 바이러스가 비 코팅 웰 야마나카 인자를 함유하는 형질 도입 하였다. 다음날, 세포 현탁액을 원심 분리를 이용하여 비트로 넥틴 코팅 된 플레이트 상에 ...

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토론

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배아 줄기 세포 (는 ESC)는 여러 단점을 보였다 때문에, 다른 도구의 필요성이 요구되었다. 따라서 야마나카에 의해 유도 된 다 능성 줄기 세포의 발달 (iPSCs)은 국제 주목 받게되었다. 야마나카는 만능 성인이 체세포에 네 개의 유전자를 추가로 유도 될 수 있다는 것을 발견한지 거의 10이었다. iPSCs 성숙한 체세포에서 "유도"된다 때문에, 한번는 ESC 관련된 문제이었던 윤리적 문제를 회피 할 수있다. 는 ESC 달리 iPSCs 개개인으로부터 생성 될 수있다. 따라서, 이들은 개인 의료 연구 및 약물 스크리닝, 질병 모델링 또는 다른 재생 의학 연구에 사용될 수있다.

첫 번째 인간의 IPSC 성공적으로이 셀 유형을 재 프로그래밍 2007 년 다양한 그룹에서 피부 섬유 아세포에서 생성되었지만, 침습적 수술이 일차 전지를 얻기 위해 필요했다. 따라서, 아이디어 아니었다다양한 질병 iPSCs를 생성하거나 재생 의학을 설계 리터 소스. 대안 쉽게 얻어진 ...

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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본 연구는 미래창조과학부 연구지원(2013R1A1A1076125)으로

진행되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Plasticware
100 mm 접시TPP 93100
6웰 플레이트TPP92006
50ml 코니컬 튜브SPL50050
15ml 코니컬 튜브SPL50015
10ml 일회용 피펫Falcon7551
5ml 일회용 피펫Falcon7543
12웰 플레이트TPP92012
24웰 플레이트TPP92024
PBMC Isolation Materials
DPBSLife Technologies14190-144
FicollGE Healthcare17-1440-03
StemSpan STEMCELL Technologies9805혈액 세포 매체
CC110STEMCELL Technologies8697혈액 세포 배지 보충제 (100x)
< 강력>iPSC 생성 및 배양 재료 < / strong>
CytoTune-iPSC 센다이 재 프로그래밍 키트Life TechnologiesA16518
TeSR-E8매체 STEMCELL Technologies5940iPSC 매체
VitronectinLife TechnologiesA14700
ROCK 억제제Sigma AldrichY0503
TrypLE express (TrypLE)Life Technologies12604-039
ReleSRSTEMCELL Technologies12604-039Colony detaching solution
Quality Control Materials
18 mm Cover GlassSuperiorHSU-0111580
4% 파라포름알디히드Tech & InnovationBPP-9004
Triton X-100BIOSESANG9002-93-1
소 혈청 알부민 벡터랩SP-5050 
Anti-SSEA4 항체MilliporeMAB4304
Anti-Oct4 항체Santa CruzSC9081
Anti-TRA-1-60 항체MilliporeMAB4360
Anti-Sox2 항체Biolegend630801
Anti-TRA-1-81 항체MilliporeMAB4381
Anti-Klf4 항체Abcamab151733
Alexa Fluor 488 염소 안티-마우스 IgG (H+L) 항체분자 프로브A11029
Alexa Fluor 594 염소 안티-토끼 IgG (H+L) 항체분자 프로브A11037
DAPI분자 프로브D1306
Prolong gold antifade reagentInvitrogenP36934
슬라이드 유리, 코팅 현일 Lab-MateHMA-S9914
TrizolInvitrogen15596-018
클로로포름시그마 알드리치366919
이소프리필알코올밀리포어109634
에탄올덕산64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kitThermo ScientficK1622
i-Taq DNA 중합효소iNtRON BIOTECH25021
UltraPure 10X TBE Buffer Life Technologies15581-044
로딩 스타Dyne BioA750
AgaroseSigma-Aldrich9012-36-6
1kb (+) DNA 사다리 마커효소DM003
알칼리성 인산가수분해효소MilliporeSCR004
트리스 베이스Fisher ScientificBP152-1린스 버퍼
염화나트륨Duchefa BiochemieS0520.1000린스 버퍼
Tween-20BIOSESANGT1027린스 버퍼
염산Duksan1129린스 버퍼

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Serra, M., Brito, C., Correia, C., Alves, P. M. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends Biotechnol. 30 (6), 350-359 (2012).
  2. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).
  3. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  4. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  5. Chun, Y. S., Byun, K., Lee, B. Induced pluripotent stem cells and personalized medicine: current progress and future perspectives. Anat Cell Biol. 44 (4), 245-255 (2011).
  6. Seki, T., Fukuda, K. Methods of induced pluripotent stem cells for clinical application. World J Stem Cells. 7 (1), 116-125 (2015).
  7. Churko, J. M., Burridge, P. W., Wu, J. C. Generation of human iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells using non-integrative Sendai virus in chemically defined conditions. Methods Mol Biol. 1036, 81-88 (2013).
  8. Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7 (1), 15-19 (2010).
  9. Ohmine, S., et al. Induced pluripotent stem cells from GMP-grade hematopoietic progenitor cells and mononuclear myeloid cells. Stem Cell Res Ther. 2 (6), (2011).
  10. Mae, S., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nat Commun. 4, 1367(2013).

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