지질은 세포 기능에 중요한 역할을하는 것으로 알려져있다. 여기, 우리는 호중구 세포 트랩 형성의 기본 메커니즘의 더 나은 이해를 얻기 위해 HPTLC 및 HPLC를 모두 사용하여, 콜레스테롤 수준에 중점을두고, 호중구의 지질 구성을 결정하는 방법을 설명합니다.
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방법 논문
방법은 지질 호중구의 변경 및 호중구 세포 외 트랩의 후속 형성을 연구하기 위해
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
고성능 박층 크로마토 그래피 (HPTLC)에 의해 수행 지질 지질 분석은 다양한 분석을 비교적 간단하고 비용 효율적인 방법이다. (호스트 병원체 상호 작용 또는 호스트 항목에서 예를 들면) 지질의 기능은 세포 과정에 중요한 역할을하는 것으로보고되고있다. 여기서, 우리는 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC)와 비교하여 기본 HPTLC 혈액 유래 호중구의 콜레스테롤 수준에 초점 지질 조성의 결정 방법을 도시한다. 목표는 호중구 세포 트랩 (그물)의 형성에 지질 / 콜레스테롤 변화의 역할을 알아보고자 하였다. NET 해제는 호스트 내에 병원균 확산을 방지하기 위해 호스트 방어 메커니즘으로 알려져있다. 따라서, 혈액 유래의 인간 호중구 세포 지질 변형을 유도 메틸 β - 시클로 덱스트린 (MβCD)으로 처리 하였다. HPTLC 및 HPLC를 사용하여, 우리는 세포의 MβCD 처리가 지질에 이르게하는 것으로 나타났습니다셀의 콜레스테롤 함량의 상당한 감소와 관련된 변경. 면역 형광 현미경 같이 동시에, 호중구의 MβCD 처리, 그물의 형성되었다. 요약하면, 우리가 지질 호중구의 변경 및 그물의 형성을 연구하는 구체적인 방법을 제시한다.
서론
지질은 세포의 항상성, 세포 사멸, 호스트 병원체 상호 작용 및 사이토 카인 릴리스 1에 중요한 역할을하는 것으로 나타났다. 시간이 지남에 따라, 호스트 병원체 상호 작용이나 염증 지질의 영향에 대한 관심과 지식이 증가하고, 여러 출판물 세포 반응의 특정 지질의 중심 역할, 특히 스테로이드 콜레스테롤을 확인합니다. 3- 히드 록시 -3- 메틸 - 조효소-A 환원을 차단하여 콜레스테롤 생합성 억제제로 사용되는 스타틴과 약리 치료 (HMG-CoA를 환원)은 인터류킨의 혈중 농도를 낮춤으로써 같은 항염증제를 작동 할 도 6 및 C 반응성 단백질 2. 및 콜레스테롤 - 글리 풍부한 구조는 호스트 (3), (4), (5)에 대한 게이트웨이로서, 세균 및 바이러스와 같은 여러 병원체에 의해 사용될 수있다클래스 = "외부 참조"> 6. (예를 들어, 스 핑고 마이 엘린)가 도시되어 스핑 고리 피드는 병원성 7을 촉진하는 병원균에 의해 사용된다. 대 식세포에서 마이코....
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프로토콜
이 프로토콜의 말초 혈액의 수집은 지역의 인간 연구 윤리위원회에 의해 승인되었다. 모든 사람을 대상으로 자신의 동의서를 제공했다.
밀도 구배 원심 분리에 의해 인간 혈액 유래 호중구 1 격리
- 인간의 혈액 유래 호중구의 분리
- 층 ~ 불꽃 근처 혼합없이 나트륨 diatrizoate / 덱스 트란 용액의 20 mL의 혈액 상을 20㎖.
- 브레이크없이 470 XG에서 30 분 동안 원심 분리기.
- 단핵 세포와 황색 플라즈마 층을 제거한다. (;도 1 및 2 셀을 집적하여 두 번째 단계) 새로운 50ml의 튜브 및 1X 인산 완충 식염수 (PBS)로 50 ㎖로 채워 다형 핵 세포 (PMN)의 위상을 옮긴다.
- 브레이크 (470) XG에서 10 분 동안 원심 분리기.
- 상등액을 제거하고 멸균 5 ㎖ FO에 펠렛을 재현 탁R 5 초는 적혈구를 용균합니다.
- 즉시 470 X g에서 10 분 동안 50 ㎖의 1X PBS와 원심 분리기까지 채운다.
- 상층 액을 제거합니다. 펠렛은 흰색이어야한다. 여전히 빨간색이면 반복 1.1.5와 1.1....
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결과
인간 혈액 유래 호중구는 밀도 구배 원심 분리 (도 2)에 의해 단리 하였다. 호중구 지질 변화의 영향을 조사하기 위해, 세포를 세포로부터 콜레스테롤을 고갈 된 10 mM MβCD로 처리 하였다. Brogden 등에 의해 기술 된 바와 같이 계속해서, 지질, 및 후 Bligh 다이어 (도 1, 왼쪽 패널)에 의해 샘플로부터 분리 하였다. (23). 준비된 지질 시료를 분리하여 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르, 스 핑고 미엘린, 인지질 및 triacylglycerides, 유리 지방산을 포함한 리피드의 넓은 범위를 시각화하기 위해 최적화 된 세 용액 프로토콜을 사용하여 실리카 겔 HPTLC 플레이트 및 실행에로드 된 , 모노 아실 글리세롤, 포스파티딜 에탄올 아민, 카디오 리핀, 포스파티딜 세린, 및 포스파티딜콜린 (도 3.......
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토론
여기에 설명 된 방법은 HPTLC 또는 HPLC에 의해 콜레스테롤과 같은 특정 지질을 분석하고, 네트의 형성에 약리 지질 변화의 영향을 조사하는데 사용될 수있다 (노이만 등. 15 참조).
HPTLC 샘플의 다수의 지질의 광범위한 분석을 비교적 비용 효과적인 간단한 방법이다. 이 방법은 항생제 정량화 25, 리소좀 저장 질환 26 지질 저장소 및 상피 세포에서 콜레스테롤 및 27 cholesterylglucoside 수준의 결정을 포함하여 많은 연구 분야에서 사용되고있다. 여기에 설명 된 방법은 수정 및 정제 호중구 모집단 지질을 분리하기 위해 최적화시켰다 그러나, 약간 수정 된 버전은 또한 조직 샘플에서 지질 (Brogden 외. 23 참조).......
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공개 사항
저자는 공개 아무것도 없어.
감사의 글
이 작품은 아리안 뉴만에게 제공 수의학, 하노버, 독일의 대학의 "동물 및 인수 공통 감염의"아카데미에 대 한 Tiergesundheit (AFT) 및 박사 과정에서 친교의 친교에 의해 지원되었다.
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재료
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| HPTLC 실리카겔, 60 | Merck | 105553 | |
| Vacufuge plus, 기본 장치 | Eppendorf | 22820001 | |
| Corning, Costar 세포 배양 48웰 플레이트, 평평한 바닥 | , Sigma | CLS3548 | |
| Coverslip | , Thermo Fisher Scientific | 1198882 | |
| 유리 슬라이드 | Carl Roth | 1879 | |
| BD 투베르쿨린 주사기 1mL | BD Bioscience | 309659 |
참고문헌
- Riethmuller, J., Riehle, A., Grassme, H., Gulbins, E. Membrane rafts in host-pathogen interactions. Biochim Biophys Acta. 1758 (12), 2139-2147 (2006).
- Shahbazian, H., Atrian, A., Yazdanpanah, L., Lashkarara, G. R., Zafar Mohtashami, A. Anti-inflammatory effect of simvastatin in hemodialysis patients. Jundishapur J Nat Pharm Prod. 10, e17962(2015).
- Bavari, S., et al.<....
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