초파리 애벌레 수지상 arborization (다) 신경 세포를 사용하여 신경 세포의 형태 형성의 연구는 면역에 의해 신경 세포와 표피 단백질의 현장 시각화 혜택을 누릴 수 있습니다. 우리는 애벌레 몸 벽에서 근육 조직을 제거하여 다 신경 세포와 주변 표피 세포의 면역 형광 분석을 개선하는 절차를 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
초파리 애벌레 수지상 arborization (다) 신경 세포는 신경 세포의 형태 형성의 메커니즘을 조사하는 인기 모델입니다. 다 신경 따라서 표피가 신경을 분포시키다 세포와 면역에 의해 모두 neuronally 및 epidermally 발현 된 단백질의 현장 시각화에서 자신의 분석 혜택과 통신 개발한다. 면역 실험 애벌레 필렛을 준비하는 전통적인 방법은 신경 세포와 표피 단백질 이미징 몇 가지 과제를 제시, 신체 벽의 대부분을 덮고있는 근육 조직을 그대로 둡니다. 여기에서 우리는 초파리 애벌레 필레에서 근육 조직을 제거하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은, 달리 근육 조직에 의해 가려 단백질의 촬상을 가능하게 신호 대 잡음 비를 향상시키고, DA 신경 발달을 연구 초해 현미경의 사용을 용이하게한다.
서론
초파리 애벌레 수지상 arborization (다) 신경 세포는 그들의 유전자 조작에 복종 할 의무 그들이 이미지화 할 수있는 용이성에 신경 발달을 연구하기위한 귀중한 모델을 제공합니다. 이 감각 뉴런은 수상 돌기의 형태 형성 1-3을 제어하는 다양한 경로의 식별 수단이되고있다.
다 뉴런의 네 가지 클래스 (클래스 I - IV) 애벌레 표피 신경을 분포시키다. 이러한 신경 세포는 수상 돌기는 주로 2 차원 배열을 형성 4,5-으로 기저막와 표피 사이에 놓여. 네 개의 클래스, 클래스 IV 다 신경 세포는 다른 동물의 감각 뉴런과 같은 가장 높은 분기 아버과를 가지고,이 아버의 동화는 개발 6-9에 대한 주변 조직에서 고유 요소뿐만 아니라 큐, 특히 표피가 필요합니다 .
연구 방법 등의 연결 및 추가-신경 사실을 확인하는 방법ORS 면역 형광에 의해 반응계 내에서 단백질 발현을 검출하는 능력에서 수지상 형태 형성 이득을 제어한다. 유충의 외부 표피는 항체에 꿰 뚫을 수없는, 그러나이 장애는 쉽게 잘 확립 된 해부 방법 10, 11을 통해 애벌레 필렛의 준비에 의해 극복된다. 그러나, 기저막 단지 내부 놓여 체벽 근육 조직 DA 신경 세포 및 상피 세포의 가시화를 향해 여러 과제를 제공한다. 우선, 근육 조직, 체벽 대부분 라인은 크게 신경 또는 표피 조직에서 나오는 형광 신호를 가린다. 이것은 실질적으로 샘플 신호 대 잡음비를 감소시킨다. 둘째, 많은 관련 단백질은 근육 조직에서뿐만 아니라 신경 세포 또는 표피에서 발현 될 수있다. 이 근육 유래 형광 신호는 신경 세포 또는 표피에서 형광 신호의 상기 모호한 검출 쉽다. 마지막으로, 아니 현미경 기술의 발전서브 회절 해상도에서 샘플 w 허가 이미징 및 상피 세포 (12, 13)를 신경 세포에서 발현되는 단백질의 현지화 안목과 주변에 특히 도움이 될 수 있습니다. 그러나 잡음비 및 커버 슬립을 시료의 근접에 강한 신호로부터 초해 현미경 이점 통해 촬상. 신호 대 잡음 비를 감소 이외에 유생 체벽 근육 거리시켜 초 해상 현미경 방법으로 달성 될 수있는 개선 된 이미지 해상도를 한정 커버 슬립에서 DA 뉴런. 면역 형광 분석을위한 과제 외에도, 근육 조직은 애벌레 몸 벽에 감각 뉴런에서 전기 생리 기록에 대한 장벽을 제공합니다. 그것의 제거는 따라서 감각 뉴런 (14)의 신경 생리 학적 조작 도움이됩니다.
여기 초파리 유충 근조직의 수동 제거하는 방법이 기재되어있다. 우리는 우리의 프로토콜 페이지 입증그렇지 근조직 의해 가려 단백질 ermits 면역 촬상 클래스 IV 다 뉴런의 시각화를위한 신호 대 노이즈 비율을 개선하고, 더 나은 DA 신경 단백질 및 세포 구조의 공간적 관계를 식별하기 위해 초해 현미경의 사용을 가능하게하며 표피.
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프로토콜
주 : 근육을 제거 (도 1)에 대한 절차는 유충 필렛을 제조하는 전술 한 방법의 변형이다. 선행 근육 제거를 수행하는 단계는 간단하게 설명하고 리더 상세한 설명은 이전 연구 10, 11로 지칭된다.
차가운 식염수 1. 해부 애벌레
- 차가운 HL3.1 식염수 15 차가운 칼슘 2 + - 무료 HL3.1 식염수 (11) (표 1)의 작동 희석을 준비합니다. 접시의 바닥을 충당하기 위해 충분한 차가운 생리 식염수와 실리콘 엘라스토머 접시에 애벌레를 놓습니다.
참고 : 식염수의 선택에 관한 토론을 참조하십시오.
| 1 배 HL3.1 식염수 (PH 7.2) |
| 5 mM의 HEPES |
| 70 mM의 염화나트륨 |
| 5 밀리미터의 KCl |
| 1.5 mM의 염화칼슘 2 (칼슘 - 무료 식염수를 위해 생략) |
| 4 밀리미터의 MgCl 2 |
| 10 밀리미터의 NaHCO3 |
| 5mM의 트레 |
| 115 MM의 자당 |
| 4 ° C에서 필터 소독 및 저장 |
| 참고 : 체액 곤충 구성을 모방 |
차가운 식염수 표 1. 구성.
- 복부면을 위로 유충을 배치합니다. 유충의 복부 표면은 전방에서 후방으로 실행하는 기본 애벌레 기관 튜브에 의해 복부 dentical 벨트와 지느러미 측에서 식별 할 수 있습니다. 전방 - 후방 방향으로 유충을 스트레칭과에 머리와 꼬리를 핀곤충 핀을 사용 접시 해부 실리콘 엘라스토머. 한쪽 끝에서 시작하여 다른 방향으로 진행, 복부 정중선을 따라 잘라 미세 해부 가위를 사용합니다.
참고 :이 방향은 다 신경 세포의 일반적 연구 등의 클러스터를 유지합니다. - 유충이 절개 된 후, 책을 여는 것처럼 해부 접시 네 모서리를 고정. 중추 신경계, 창자 및 기관을 포함한 내부 장기를 잡아 제거하는 집게를 사용합니다. 필렛이 팽팽하지만 최대한 뻗어있다 그래서 곤충 핀을 조정합니다.
참고 : 근육은 분절 경계에서 몸 벽에 고정된다. 근육이 몸 벽의 대부분을 커버하지만, 그들은 지느러미 중간 선 부근의 좁은 영역에 존재하지 않는다.
2. 근육 제거
- 근육 조직이 존재하지 유충의 지느러미 중간 선을 찾습니다. 이 평평한 가능한 방향으로 근육 조직 아래에 삽입 될 수있는 하나의 셉 단자를 배치합니다.
- 에서 시작지느러미 중간 선은 세그먼트의 전방 경계 근처에 조심스럽게 집게와 표피 사이의 접촉을 최소화하기 위해주의하면서 근육과 표피 사이의 겸자 단자를 밀어 넣습니다.
- 하나의 고정 점에서 몸 벽 근육의 부착을 깰 위로 집게를 잡아 당깁니다. 관심의 나머지 헤미 세그먼트 (들)에 대해이 과정을 반복합니다.
참고 :이 프로토콜은 각각 다 신경 세포의 수상 돌기 필드의 후방의 보존을 최적화합니다. 수지상 필드의 앞쪽 부분을 유지하려면, 각 세그먼트의 후방 끝 부분에 집게의 단자를 삽입하는 것이 가장 좋습니다. - 애벌레 필렛이 최대로 모든 방향으로 뻗어되도록 곤충 핀을 다시 조정합니다.
- 그것은 아직도 25 분 동안 PBS에서 감기, 새로 제조 한 4 % 포름 알데히드를 사용하여 해부 접시에 고정되어있는 동안 필렛을 수정합니다.
- PBS에 5 번 씻어.
- 접점을 최소화하기 위해주의하면서 조심스럽게 나머지 고정 점에서 근육 조직을 멀리 당겨 집게를 사용하여표피와 CT.
- 고정 해제 및 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 해부 접시에서 필렛을 제거합니다. 이전 11 설명 된 바와 같이, 모든 후속 세척, 차단 및 면역 형광 염색 단계를 수행합니다.
3. 마운트 애벌레 필렛
- 우선 가능한 샘플이 평평하게하기 위해 미세 해부 가위를 사용하여 머리와 꼬리를 제거합니다. 커버 슬립에 직면 필렛의 내면 antifade mountant에 커버 슬립에 필렛을 탑재합니다.
- 커버 슬립에 현미경 슬라이드를 삽입하고 설치 매체를 분산 부드럽게 누르십시오. 위에 현미경 슬라이드 플립과 매니큐어를 사용하여 슬라이드에 커버 슬립을 밀봉. 프레젠테이션은 적어도 한 달 동안 -20 ℃에서 저장 될 수있다.
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결과
우리는 함께 막 마커로 표지 클래스 IV 다 신경과 중격 접합 단백질 Coracle (코라) 및 디스크 대형 (통해 Dlg)를 공동 시각화 면역 실험에서 신호 대 잡음 비를 향상시키기 위해 근육 제거의 유용성을 입증 CD4- tdTomato.
코라 이전 DA 신경 돌기는 상피 세포에 의해 둘러싼 다 신경 세포의 형태 형성 및 기능과 관련하여 연구를 4,6-9,16 돌기 한 많은 식별 표피 인자의 하나이다되는 책자를 식별하는 데 사용되어왔다. 항을 DsRed와 면역 염색하면 신경 세포 (적색) 및 안티 코라 항체 (녹색)가 근육을 제거 (근육 오프)와 애벌레 필레에 수행 된 감지하고 그대로 근육과 (근육)에 있습니다. 각 조건에 대해, 클래스 IV 다 신경의 후방 수지상 필드는 레이저 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하여 영상화 하였다. 이미지 ID를 사용하여 얻을 수 있었다두 조건에 대한 entical...
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토론
여기 프로토콜 초파리 유충 필렛의 근조직의 수동 제거를 위해 설명된다. 이 프로토콜은 이전에 애벌레 해부 기술 10, 11 설명 수정합니다. 유충은 실리콘 엘라스토머 접시에 해부 한 후, 지느러미 중간 선이 있습니다. 단일 셉 가닥은, 그 평탄한 가능한 방향으로 조심스럽게 지느러미 중간 선 근처의 근육 조직과 표피 사이에 삽입됩니다. 포셉 부드럽게 관심의 각 애벌레 세그먼트에서 하나의 앵커 포인트에서 별도의 근육 조직을 위쪽으로 당겨진다. 애벌레 필렛은 집게 나머지 고정 점에서 근육을 멀리 당겨 다시 사용 후 차가운 포름 알데히드에 고정되어있다.
이 근육 제거 절차 후 고정의 전체를 수행하도록 유혹하는 동안, 우리는 신장 근육, 한 번 고정, 렌더링, 평탄화를 유지하고 밀접하게, 심지어 앵커 지점에서 분리 한 후 표피에 나란히 놓이는 것을 발견그것은 어려운 하부 조직에 손상을주지 않고 조작하기. 또한, 우리의 경험에서 고정 근조직 취성이고 ...
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공개 사항
저자는 공개 아무것도 없어.
감사의 글
우리는 현미경에 도움이 토론 게리 Laevsky 감사합니다. NIH에 의해 투자 된이 작품은 ERG에 R01GM061107 및 R01GM067758을 부여
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Dumont #5 핀셋 | 전자 현미경 과학 | 72701-D | |
| 마이크로 가위, 8cm, 직선, 5mm 블레이드, 0.1mm 팁 | World Precision Instruments | 14003 | |
| Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트 | Dow Corning | 3097358-1004 | 플레이트 해부용 |
| Austerlitz 곤충 핀, 0.1mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Fostec 8375 광원 | Artisan Technology Group | 62792-4 | |
| Zeiss Stemi 2000 | Carl Zeiss 현미경 Vectashield | ||
| 퇴색 방지 장착 매체 | Vector Laboratories | H-1000 | 컨포칼 현미경 |
| Prolong Diamond antifade mountant | Life Technologies | P36970 | 구조화 조명 현미경 마이크로 |
| 커버 유리, 22 x 22 mm, No. 1.5 | VWR | 48366-227 | |
| Superfrost Plus 현미경 슬라이드, 25 x 75 x 1.0 mm | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| 마우스 항 코랄 항체 | 발달 연구 Hybridoma Bank | C615.16 | 상등액, 희석 1:50 |
| 마우스 항 디스크 대형 항체 | 발달 연구 Hybridoma Bank | 4F3 | 상층액, 희석 1:50 |
| 토끼 anti-dsRed 항체 | Clontech | 632496 | 희석 1:1,000 |
| 염소 항토끼 항체, Alexa Fluor 568 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11011 | 희석 1:1,000 |
| 염소 항마우스 항체, Alexa Fluor 488 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11001 | 희석 1:500 |
참고문헌
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