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방법 논문

소형 동물 모델에서의 동정맥 (AV) 루프는 혈관 신생과 혈관을 조성한 조직 공학을 공부하기

12.2K 조회수

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DOI:

10.3791/54676

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2016년 11월 2일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plastic and Hand Surgery and Laboratory for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, University Hospital of Erlangen, Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nürnberg (FAU), 2Genetic Engineering and Biotechnology Institute for Postgraduate Studies, Baghdad University, 3Department of Plastic, Hand and Microsurgery, Sana Klinikum Hof GmbH

이 논문에서

요약

우리는 고립과 잘 특성화 된 환경에서 생체 내에서 혈관을 분석하기위한 모델로서 동정맥 (AV) 루프의 생성을위한 미세 수술 방법을 설명합니다. 이 모델은뿐만 아니라 혈관 신생의 조사에 유용 할뿐만 아니라 최적의 엔지니어링 축 방향으로 혈관 및 이식 가능한 조직에 적합합니다.

초록

기능적 혈관 네트워크는 인체의 거의 모든 조직과 기관의 생존과 성장을 위한 전제 조건입니다. 더욱이, 암과 같은 병리학적 상황에서는 혈관형성이 질병 진행에 주도적인 역할을 합니다. 결과적으로, 신생혈관화의 메커니즘을 규명하고 조직 공학 및 재생 의학을 위한 다양한 혈관화 접근법을 개발하기 위해 표준화되고 잘 특성화된 생체 내 모델에 대한 강한 필요성이 있습니다.

우리는 동정맥(AV) 루프로 문합된 정맥과 동맥으로 구성된 혈관 축의 유도를 위한 작은 동물 모델에 대한 미세 수술 접근 방식을 설명합니다. AV 루프는 밀폐된 이식실로 전달되어 생체 내에서 격리된 미세환경을 생성하며, 이는 혈관 축을 통해서만 살아있는 유기체에 연결됩니다. 3D 이미징(MRI, 마이크로 CT) 및 면역조직학을 사용하여 시간이 지남에 따라 성장하는 혈관 구조를 시각화할 수 있습니다. 다양한 세포, 성장 인자 및 매트릭스를 이식함으로써 잘 제어 가능한 환경에서 주변 환경의 방해 영향 없이 혈관 네트워크 형성에 대한 기능을 분석할 수 있습니다.

혈관 신생 및 항혈관 신생 연구 외에도 AV 루프 모델은 혈관 조직 엔지니어링에도 완벽하게 적합합니다. 특정 혈관전 형성 시간이 지나면 생성된 조직을 결손 부위에 이식하고 국소 혈관에 미세수술로 연결하여 즉각적인 혈액 공급과 공학적 조직의 통합을 보장할 수 있습니다. 매트릭스, 세포, 성장 인자 및 챔버 구조를 다양화함으로써 다양한 조직을 생성할 수 있으며, 이는 개별 환자의 필요에 맞게 조정될 수 있습니다.

서론

인체의 대부분 조직 및 기관은 영양소를 공급하는 가스 교환 및 노폐물을 제거하는 기능 혈관 네트워크에 의존한다. 로컬 또는 전신 혈관의 문제로 인해이 시스템의 고장은 심각한 질병의 무리로 이어질 수 있습니다. 또한, 이러한 조직 공학 또는 재생 의료 등의 연구 분야에서 인위적으로 생성 된 이식 조직 또는 기관 내에서 기능적 혈관 네트워크가 성공적으로 임상 응용에 필수적이다.

수십 년간 연구가 신규 치료 개입을 찾아 혈관 장애의 예방을 더 제공하기 위해 병리학 적 상황에 대한 깊은 통찰력을 얻을 혈관 성장에 관여하는 정확한 메커니즘을 조사 하였다. 첫 번째 단계에서는, 예컨대 세포 - 세포 상호 작용 또는 혈관계의 세포에 대한 분자의 효과의 기본 프로세스는 일반적으로 시험관 2D 또는 3D에 의해 조사되고실험. 전통적인 2D 모델은 잘 확립되어 쉽게 실행할 수 있으며이 과정에 대한 이해에 크게 기여 하였다. 1980 년 처음으로, 문헌 [Folkman 등. 젤라틴 코팅 된 플레이트 1 모세 혈관 내피 세포의 생체 외 혈관 신생 시드에보고했다. 이것은 바로 더 2D 혈관 내피 세포 관 형성 분석 (2), 마이그레이션 분석 (3) 다른 세포 유형 4의 공동 배양 실험뿐만 아니라 다른 사람의 다수의 출판물에 방법을 주었다. 이러한 분석은 오늘날 사용되는 체외 방법에서 표준으로 인정된다.

대부분의 세포 유형이 중요한 생리 조직 구조 (5)를 형성하는 3 차원 환경을 요구하기 때문에,이 실험 장치는 항상 생체 내에서 세포 거동의 연구에 적합하지 않다. 3D 매트릭스의 아키텍처는 모세관 morphogenesi에 대한 결정적인 것으로 표시 될 수있다(S) (6)과 그 셀 세포 외 기질 (ECM)의 상호 작용 및 3D 배양 조건은 종양 혈관 신생에 관여 7 중요한 요소를 조절한다. 3 차원 행렬은 이펙터 단백질을 결합하고 조직 규모의 용질 농도 구배를 설정할 수 있습니다, 복잡한 기계 입력을 제공한다. 또한,이 복합 조직 (5)에 생체 형태 형성 및 리모델링 단계 모방하기 위하여 필요하다고 생각된다. 이러한 시스템에있어서, 혈관 신생 및 혈관 형성을 모두 연구 할 수있다. 혈관 신생은 혈관 (8) 기존의 모세 혈관 발아를 설명하지만, 혈관 형성은 내피 세포 또는 전구 세포 9,10- 통해 혈관 새로이 형성을 의미한다. 혈관의 성숙 평활근 세포 (11)의 채용을 통해 '동맥'이라는 과정을 설명한다. 시험 관내 모델에서 일반적인 혈관 신생은 기존의 단층에서 내피 세포의 발아이고s는 젤에 내장 된 마이크로 스피어의 표면에 겔 표면에 단일 층, 또는 내피 세포 타원체 (12)을 구축하여 시드. 혈관 신생 모델에서 하나의 내피 세포는 3D 겔 포획된다. 이들은지지 셀 (12)과 일반적으로 조합하여, 혈관의 구조와 새로이 네트워크를 형성하도록 인접하는 내피 세포와 상호 작용한다.

그러나, 생체 설정에서 모방 할 수없는 체외 모델에서 복잡한 3D는 완전히 세포 - 세포의 무리를 주어 세포 ECM 13의 상호 작용을. 높은 시험 관내 활성 물질은 자동으로 그 반대의 경우도 마찬가지 (14)와 동일한 생체 내에서 효과를 표시하지 않습니다. 혈관의 포괄적 인 분석에 더 신체 상황을 시뮬레이션하는 생체 모델의 개발이 절실히 필요가 처리한다. 생체 내 혈관 신생 어 세이의 큰 범위가 포함 문헌에 기재되어있다병아리 융모 막 분석 (CAM), 제브라 피쉬 모델, 각막 신생 혈관 분석, 지느러미 공기 주머니 모델, 지느러미 피부 집계 실, 피하 종양 모델 14. 그러나 이러한 분석은 종종 빠른 형태 변화는 CAM 검정, 또는 각막 혈관 신생 어 세이 (15) 내의 제한된 공간에서 기존의 것과는 구별되는 새로운 모세 혈관의 문제와 같은 제한과 연관된다. 또한, 비 - 포유 동물 시스템이 사용된다 (예., 제브라 피쉬 모델 (16))의 이종 이식 (17)에 문제를 초래. 인접 조직이 크게 혈관 신생 과정에 기여 때문에 피하 종양 모델에서 종양 자체에서만 발생 혈관을 분석 할 수 없다. 또한, 주변 조직의 종양 미세 환경 (18)을 형성하는 데 결정적인 역할을 할 수있다.

뿐만 아니라 혈관 신생 또는 혈관 생성을 공부에 대한 강한 북동가있다에디션에 대한 표준화 및 생체 내 모델에서뿐만 아니라 조직 공학 및 재생 의학에 다른 혈관 전략을 공부 잘 특징. 현재 복합 인공 장기 나 조직의 생성은 시험관 내 및 생체 내 모두에서 가능하다. 차원 bioprinting 복잡한 3D 기능 살아있는 조직 (19)를 발생시키기위한 주문형 제조 기술을 제공한다. 또한, 바이오 리액터는 조직 (20) 또는 자기 체 생성에 사용될 수는 바이오 리액터 (21)로서 사용될 수있다. 그러나, 인위적으로 생성되는 조직의 성공적인 적용의 주요 장벽은 설계 구조 내의 혈관의 부족이다. 이식 후 숙주의 혈관에 직접 연결은 특히 대규모 인공 조직 또는 기관의 경우에 생존의 주요 조건이다.

시험 관내 또는 생체 내 prevascularization 전략에 다른이 (STABLE)했다oped 전에 주입 (22) 구조의 기능성 미세 혈관을 설정합니다. 쥐의 등 피부에 시험 관내 예비 성형 설계 모세 혈관과 골격의 주입은 하루에 23에서 쥐의 혈관의 급속한 문합되었다. 대조적으로, 입체 prevascular 네트워크로 조립 인간 중간 엽 줄기 세포 및 인간 제대 정맥 내피 세포로 구성된 구형 공동 배양은 생체 내 이식 후 더 발전시켰다. 그러나, 호스트와 혈관 문합 (24)를 한정한다. 무엇보다도, 이러한 괴사 또는 조사 지역으로 저조한 혈관 결함,에,이 소위 외부 혈관 - 발판으로 주변 지역에서 혈관의 증식은 - 실패 자주. 내장 혈관이, 다른 한편으로는, 지지체 (25)에 돋 새로운 모세 혈관의 소스로 혈관성 축선에 기초한다. 축 혈관 접근 방식을 사용상기 설계 조직은 혈관 축 이식 수신자 사이트에서 로컬 용기에 연결될 수있다. 즉시 이식 후 조직을 적절하게 최적의 통합을위한 적절한 조건을 생성 산소 및 영양분에 의해지지된다.

때문에 생체 내 혈관 신생을 조사하는 축 방향 혈관 조직을 생성하는 중요성의 인식에서 모델의 제한된 가용성, 우리는 동물 모델 (26)의 동정맥 (AV) 루프를 생성하기 위해 더 에롤과 스피라의 미세 수술 방법을 개발했다. 완전히 폐쇄 된 주입 챔버의 사용은이 방법이 잘 아니라 생체 내 환경에있어서, "제어"(도 1)에 따라, 혈관 형성을 연구하기 위해 적합하다. 이 모델은하지 혈관 신생의 조사에만 유용뿐만 아니라 최적의 조직 지점을 인식하기위한 발판의 축 혈관에 적합eering 목적.

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프로토콜

에를 랑겐 - 뉘른베르크의 프리드리히 - 알렉산더 대학의 동물 관리위원회 (FAU) 및 중동 프랑켄 정부, 독일, 모든 실험을 승인했다. 실험을 위해, (300)의 체중을 가진 수컷 루이스 래트 - 350g 사용 하였다.

1. 쥐의 동정맥 루프 모델

  1. 주입 절차 (그림 2)
    1. 마취를 들어 뚜껑에 의해 이소 플루 란 기화기에 튜브를 통해 연결 및 폐쇄되는 특수 플라스틱 상자를 사용합니다. 공급 가스의 전원을 켜고 0.8 사이 유량계 - 1.5 L / 분.
    2. 유도 플라스틱 상자에 쥐를 놓고 상단을 밀봉. 5 % 이소 플루 란 기화기를 켭니다.
    3. 조심스럽게 마취 유도시 쥐를 관찰합니다. 3 후 - 4 분, 쥐가 마취됩니다.
    4. 적절한 마취 확인 : 바로 잡고 반사, 눈꺼풀 반사 손실, 철수 반사, 긍정적 인 각막 반사 손실.
    5. 상자에서 쥐를 제거하고 확인의약물의 계산에 무게. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다.
    6. 진통제와 항생제 투여 (예. 7.5 ㎎ / ㎏ enrofloxacin 피하 (SC), 12.5 ㎎ / ㎏ 트라마돌 및 / kg 설피 린 100 mg을 모두 정맥 주사 (IV)). 운전 중에 체중 적응 결정질를 관리 (예. 30 ㎖ / kg 사우스 캐롤라이나).
    7. 마스크를 통해 투여 2 % 이소 플루 란 흡입 - 1 마취하에 37 ° C에서 온난화 접시에 그 뒷면에있는 쥐를 놓습니다.
    8. 적절 마취 모니터 마취 레벨이 너무 낮 으면 (래트의 운동 통증 반응 턱 톤의 반사 손실 (1.1.4 참조). 심박수 증가)을 이소 플루 란을 증가시킨다. 이소 플루 란 (각막 반사, 높은 심박수, 산소 포화도의 감소의 손실)을 과잉 섭취하지 않도록주의하십시오. (- 100 % 95)과 심장 박동 - 쥐 (250 450 / 분)의 산소 포화도를 확인하기위한 작은 동물을위한 특별한 맥박 산소 측정기를 사용합니다. operati 중쥐의 온도 모니터링에 - 필요한 경우 (36 ~ 40 °의 C) 온난화 판의 온도를 조정합니다.
    9. 전기 면도기와 뒷다리의 내측을 면도 소독제로 소독 영역. 뒷다리 사지를 확산하고 접착 테이프로 고정합니다.
    10. 수술 현미경 쥐를 놓고 멸균 입체 재단으로 쥐를 다룹니다. 전체 작업 절차는 무균 조건 하에서 수행되어 있는지 확인합니다.
    11. 메스 (10 호)를 사용하여 사타구니에 상부 무릎에서 세로 절개와 왼쪽 허벅지의 중간에 피부를 엽니 다.
    12. 대퇴 혈관 번들이 무릎 대퇴 동맥의 분기점에 사타구니의 골반 동맥에서 노출 될 때까지 해부 가위와 microforceps를 사용하여 길이가 약 3cm의 층의 피하 조직 및 근막을 잘라.
    13. 혈관을 분리하고 외막 위 및 microforceps를 사용하여 외막을 제거합니다.
    14. B면 응고전기 응고를 사용하여 목장. 젖은 압축과 조작 필드를 커버.
    15. 1.1.14 - 왼쪽위한 1.1.11 바와 같이 우측의 피부를 연다.
    16. 1.5 cm - 정맥 이식편이 수확, 하나의 거리에 근위 및 원위 단부에서 전기 응집하여 우측 대퇴부 정맥을 결찰.
    17. microforceps와 정맥 이식편을 제거하고 관개 캐 뉼러를 사용하여 헤파린 용액 (0.9 % 염화나트륨 수용액 50 IU / mL)로 정맥 이식편 플러시 왼쪽 허벅지에 옮긴다. 축축한 압축과 오른쪽에있는 작업 영역을 커버.
    18. 근위 미세 혈관 클램프와 서혜부의 좌측 대퇴부 정맥을 결찰. 약 2 ㎝의 거리에서, 분기 전 상부 무릎 전기 응고 원위 대퇴 정맥 응고.
    19. 문합위한 11-0 sutur 함께 종단 간 문합술에 의해 정맥의 기단부와 정맥 이식편의 기단부에 연결이자형. 약 8 중단 봉합사를 사용합니다. 12시와 6시 위치에 처음 두 봉합을 배치하여 시작합니다. 이어서, 전면에 이러한 점 간의 3 개의 봉합사 2에 넣고 배면에 3 개의 봉합사 2을 넣어.
    20. 대퇴 정맥에 대해 기술 된 것과 동일한 방식으로 대퇴부 동맥 결찰 (1.1.18한다.). 루프 혈관이 꼬여 있지 않은지 확인합니다. 대퇴 정맥에 상술 한 동맥의 기단부와 정맥 이식편의 말단부 문합 (단계 1.1.19.).
    21. 정맥 25 IU의 헤파린을 관리 할 수 ​​있습니다. 루프 용기가 트위스트되지 않습니다 다시 확인 클램프를 제거하고 약 5 분 동안 누설 루프의 개통을 확인합니다.
    22. 용기에 드리블 파파 베린 (예를 들어, 4 ㎎ / ㎖)는 혈관 경련을 방지 할 수있다. 개방성이있는 경우, 루프는 팽창 동맥의 펄스가 관찰 될 수있다.
    23. (매트릭스의 첫번째 절반 (약 500 μL)을 주입 챔버를 미리 기입 예 </ EM>, 하이드로 겔 또는 세포 유무에 관계없이 뼈 매트릭스). 주입 챔버로 루프를 포함.
    24. 1000 ㎕의 총 부피로 행렬의 후반부로 주입 챔버를 채운다. 챔버 뚜껑 챔버를 밀봉합니다.
    25. 비 흡수성 6-0 봉합사와 허벅지에 주입 챔버를 수정합니다. 비 흡수성 봉합사 6-0와 챔버 리드를 고정. 전기 응고와 가능한 출혈을 중지합니다.
    26. 흡수성 4-0 봉합사로 피부를 닫습니다. 알루미늄 스프레이와 함께 상처를 커버.
    27. 항생제와 진통제를 관리 (예를 들면, 7.5 ㎎ / ㎏ enrofloxacin 사우스 캐롤라이나, 마시는 물을 통해 운영 체제 (포 당 트라마돌 12.5 ㎎ / ㎏) () 3 - 쥐의 행동에 따라 오일 및 이후).
    28. 오프 기화기를 켜고 그것을 자각하기 시작 때까지 쥐가 공급 가스를 흡입 할 수 있습니다.
    29. 열 지원하는 상자에 쥐를 놓고 완전히 회복 될 때까지주의 깊게 관찰한다.
    30. 쥐 취소를 두지 마십시오이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 참석했다.
    31. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 쥐를 반환하지 않습니다.
  2. 외식 절차
    1. 짧은 시간 또는 긴 시간 주입 후 외식를 수행 (연구 설계에 따라, 예제 참조 27-32 참조). 단계 1.1.1.-1.1.9에 따라 쥐를 마취.
    2. 메스 (10 번)와 복부의 피부를 열고 압축 제쳐두고 창자를 이동합니다. 복부 대동맥과 대정맥 caudalis 사용 면봉을 노출.
    3. 복부 대동맥 (예., 24 게이지 플라스틱 캐 뉼러를) Cannulate 및 해부 가위로 대정맥 caudalis를 잘라.
    4. 누출 유체가 깨끗해질 때까지 100 IU / ㎖의 헤파린을 함유하는 0.9 % 식염수로 복부 대동맥 플러시. (30 ml의 관류 솔루션 대동맥을 관류 예.에 에이전트 또는 인도를 대조케이).
    5. 깊은 마취에서 - (0.2 ㎖ / kg 0.1) embutramide, mebezonium, 요오드화 tetracaine에 염산염 주사 용액의 치사량을 주입하여 쥐를 안락사.
    6. 비 흡수성 봉합사 4-0으로 대정맥 caudalis 복부 대동맥을 결찰하고.
    7. 2 클램프 - 1 오픈 상처 영역을 닫습니다. 4 ° C (관류 액의 경화)에서 24 시간 동안 쥐를 저장합니다.
    8. 그 뒷면에있는 쥐를 놓습니다. 뒷다리 사지를 확산하고 접착 테이프로 고정합니다.
    9. 메스 (10 번)와 세로 절개와 챔버 위의 피부를 엽니 다.
    10. 챔버의 결합 조직 및 해부 가위와 microforceps를 사용하여 루프 척추 경을 제거합니다. 해부 가위로 실 입구에서 1cm의 거리에서 루프 척추 경을 잘라 챔버를 제거합니다.
    11. 챔버의 뚜껑을 열고 조심스럽게 집게와 챔버에서 구조를 제거하고 방에서 24 시간 동안 4 % 포르말린 용액에 고정온도. 이후 3D 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 또는 파라핀 조직 학적 분석 (30)의 구조를 사용합니다.

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결과

조직 공학
골조직 공학을 위해, 다른 뼈 대체 물질의 수는 작은 동물 쥐 AV 루프 27,28,33,34 모델에 이식 하였다. 혈관은 (는) 도심에 3D 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (마이크로 CT) (그림 3A)에 의해 설명 될 수있다. 처리 된 소 해면골 (PBCB) 행렬의 혈관은 혈관이없는 그룹에 비해 루프 군에서 유의하게 높았다. 끊임없이 성장 maturating 혈관 네트워크를 8 주 동안 주입 챔버 내에서 개발 하였다. 더 증가는 비 혈관 기 (33)에서 검출되지 않은 반면, 4 주와 8 주 사이의 구조의 중심을 향해 혈관 조직의 지속적인 성장이 관찰되었다. 된 AV 루프 모델 6 주간 PBCB 행렬 Prevascularization는 제어 골아 세포에 비해 주입 된 조골 세포의 생존율이 우수 주도. 대조군과는 대조적으로, 뼈 특정 유전자의 발현은 ...

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토론

10 년 이상, 우리는 성공적으로 작은 동물 모델에서 생체 내 동정맥 (AV) 조직 공학의 목적을 위해 루프 공부 혈관 신생을 사용하고 있습니다. 우리는이 미세 수술 모델이 다른 조직 엔지니어링 및 그것은 또한 혈관 신생 또는 혈관 신생 연구에 사용할 수있는 매우 적합 함을 입증 할 수있다.

기존 / 대체 방법에 대하여 기술의 중요성
엔지니어링 조직 또는 기관은 결함 사이트 (41)에 이식 후 생존 성공적인 통합에 필요한 영양분과 산소를 공급하는 작용 혈관 네트워크를 필요로한다. 다른 prevascularization 전략의 숫자는 체외 대 생체 내 및 외부 대 고유의 접근 방식에 따라 차별화 될 수있는 과거 수십 년에 걸쳐 개발되었다.

비계는 FABRICA 될 수 있습니다테드 관 형상 구조 및

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

우리는 우리의 AV 루프 연구를 지원하기 위해 다음과 같은 기관을 감사드립니다 : STAEDTLER 재단, 박사 프리츠 Erler 퐁, 그렇지 크로네 Fesenius 재단, 박스터 헬스 케어 GmbH의, DFG, 성별에 대한 IZKF / ELAN / EFI / 사무실 및 다양성의 Forschungsstiftung Medizin을 , 에어 랑엔 - 뉘른베르크 (FAU), AO 재단, 프레드 로스 재단, 슈 홍콩, 한스 게오르그 GEIS 재단, 독일 Akademischer Austauschdienst (DAAD), 독일, 고등 교육부와 과학 연구, 이라크의 프리드리히 - 알렉산더 대학. 우리는 우수한 기술 지원 스테판 플라이셔, 마리나 MILDE, 카트린 콘과 일제 아놀드-Herberth에게 감사의 말씀을 전합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.9% 염화나트륨Berlin-Chemie AG34592508
11-0 Ethilon / 폴리아미드 6/6EthiconEH7438G
4-0 Vicryl / polygalactin 910EthiconV392H
6-0 Prolene / polypropyleneEthicon8695H
알루미늄 스프레이Pharma Partner Vertriebs-GmbH1020
방부제 보드 케미 GmbH 
카테터 B Braun Meslungen AG4251612-02
조영제Flowtech  MV-122
엠부트라마이드, 메베조늄 요오드화물, 테트라카인 하이드로클로라이드 주사 용액 Intervet International GmbH
encre de chine 강렬한 인도 잉크Lefranc & Bourgeois
EnrofloxacinBayer AG
눈 연고Bayer AG
포르말린 4%Carl Roth GmbH & Co. KGP087.4
HeparinRatiopharm GmbH
isoflurane Abbott Laboratories6055482
Lewis rat, 수컷Charles River Laboratories
Metamizol-Natrium Ratiopharm GmbH
파파베린 / Paveron NLinden Arzneimittel-Vertrieb-GmbH
트라마돌 / 트라말Grü 넨탈 GmbH

참고문헌

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