방법 논문

과민성 대장 증후군에서의 miRNAs 순환의 교란은 멀티 플렉스 높은 처리량 유전자 발현 플랫폼을 사용하여 감지

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DOI:

10.3791/54693

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2016년 11월 30일

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1Digestive Disorders Unit, National Institute of Nursing Research, National Institutes of Health, DHHS, 2National Institutes of Health Research Scholar, Howard Hughes Medical Institute, 3Internal Medicine, Medical School, University of Michigan

이 논문에서

요약

우리는 증폭 없이 생물학적 기질에서 분자를 바코딩하고 계수하여 유전자 발현을 정량화하는 multiplexed high-throughput 유전자 발현 플랫폼의 사용을 설명합니다. 우리는 이 플랫폼을 사용하여 과민성 대장 증후군이 있거나 없는 피험자의 전혈에서 microRNA(miRNA) 발현을 정량화했습니다.

초록

유전자 발현 분석 플랫폼은 단일 반응에서 최대 800 사체 (mRNA의 또는의 miRNAs)의 발현을 강력하고 재현성 정량을 허용한다. miRNA의 분석은 직접 이미징 및 디지털 색으로 구분 형광 바코드 프로브 세트 (기자 프로브 및 포획 프로브)으로 표시되는 miRNA의 분자를 계산하여 성적 증명서를 계산합니다. 바코드는 3 '말단에 고유 올리고 뉴클레오티드 태그 (miRtag)을 결찰에 의해 연장 된 miRNA가 성숙 직접 하이브리드된다. 역전사 및 성적 증명서의 증폭이 필요하지 않습니다. 리포터 프로브는 네 개의 형광 색의 조합을 사용하여 채워 6 색 위치의 시퀀스를 포함한다. 여섯 자리 위에 4 색은 유전자 특이 컬러 바코드 시퀀스를 구성하는데 사용된다. 후 하이브리드 처리 로봇 준비 스테이션에서 자동으로 진행됩니다. 하이브리드, 여분의 프로브는, 멀리 세척하고 노사정 구조 (캡처 프로 후피의 miRNA-리포터 프로브)을 비오틴 표지 된 포획 프로브를 통하여 스트렙 타비 딘 코팅 된 슬라이드에 고정된다. 이미징 및 바코드 계수는 디지털 분석기를 사용하여 수행됩니다. 고정 된 바코드의 miRNAs는 시각과 현미경과 카메라를 사용하여 몇 군데, 그리고 고유 바코드를 디코딩 및 집계된다. 데이터 품질 제어 (QC), 정규화 및 분석은 분석 소프트웨어를 수반 맞춤 디자인 데이터 처리 및 분석 소프트웨어에 의해 촉진된다. 분석 표현의 폭 넓은 범위에서 높은 선형성 및 고 감도를 보여준다. 샘플 및 분석 준비 효소 반응, 역전사, 또는 증폭을 포함하지 않는다; 몇 가지 단계가 있습니다; 크게 탐정 효과를 줄이고 높은 일관성 및 기술 재현성의 결과로, 자동화된다. 여기서, 우리는 과민성 대장 증후군에서 순환 miRNA의 섭동을 식별하는이 기술의 적용을 설명한다.

서론

일반 인구의 15 %와 의료 서비스에 큰 부담을 나타내는 - 과민성 대장 증후군 (IBS)은 10을 괴롭히는, 소화기에서 가장 일반적인 외래 환자의 진단이다. IBS에 대한 현재, 일반적으로이 허용되지 않습니다 진단 바이오 마커 (즉, 진단은 임상 증상에 따라 이러한 위장관 악성 종양, 염증성 장 질환, 위장관 (GI) 감염과 같은 다른 유기 질환을 배제한다). 이러한 IBS, 높은 감도 및 정확도 (재현성) 등 무증상 병리 일반 조건에서의 유전자 발현 양상을 연구 할 때 유전자 발현 프로필의 섭동은 종종 1-3 미묘한로서 필요하다. 의 miRNAs는 IBS 4,5 모두 진단 및 기능 대상으로 확인 된, 우리는 IBS 관련 생물 교란의 -10- 메의 바이오 마커를 순환 등의 사용을 평가에 특히 관심이 있습니다. circula의 임상 활용팅 바이오 마커 인해 용이성과 환자의 바이오 마커 '소스 (예를 들어, 말초 혈액)의 컬렉션의 최소 침습 자연에 현재의 관심이다.

유전자 발현 플랫폼 분석은, 그들의 독특한 화학 및 간소화, 대부분 자동화 된 워크 플로우의 타겟 발견에 대한 사체의 폭 사용자 지정 범위 (하나의 반응 800 목표)를 제공하는 마이크로 어레이 플랫폼을 제공합니다. 또한 transcriptomic 대상의 정량화에 발현의 광범위에 걸쳐 고정밀 선형성을 얻었다. 상기 분석은 RNA의 역전사 cDNA를, 또는 다른 효소 반응 결과의 증폭을 필요로하지 않는다. 따라서, 낮은 풍부 또는 희귀 스플 라이스 변종 RNA 종으로부터 증폭 높은 사이클 번호에 의해 도입 된 전위의 디지털 오차 계산의 방법에 의해 감소된다. 이는 정제 총량 샘플 타입의 다양한 수단(즉, mRNA의 miRNA의 +) RNA는 RNA은 포르말린 고정 파라핀 포매 (FFPE) 시편뿐만 아니라 조 조직 및 세포 용 해물에서의 분석에 이용 될 수있다.

관심 RNA를 각각 타겟 RNA에 상응하는 영역을 인식 표적 특이 서열을 포함하는 프로브 (캡처 및 리포터 프로브)의 쌍을 이용하여 검출된다. 짧은 RNA를 (즉,의 miRNAs)의 검출을 보장하기 위하여, 성숙 된 miRNA 서열은 분자의 3 '말단에 독특한 뉴클레오티드 태그 (miRtag)를 어닐링함으로써 연장된다. 성숙한 타겟의 miRNA와 miRNA에 특이 miRtag 모두의 일부분에 상보 가교 올리고 뉴클레오티드, 서열 특이성을 확인하기 위해 사용된다. 캡쳐 리포터 프로브는 각각의 miRNA-성숙한 miRtag 착체 끝 3 '및 5'에 결찰. 포획 프로브들을 스트렙 타비 딘 - 코팅 슬라이드 글라스의 표면에 부착 할 수 있도록, 3 '말단에 바이오틴 라벨을 갖고, fixi슬라이드에 캡처 프로브의 miRNA-miRtag-기자 프로브 복잡한 ng를. 전류는 5 '말단에 기자 프로브에 의해지지 형광 바코드 현미경 및 전하 결합 소자 (CCD) 카메라를 이용하여 가시화 될 수 있도록 슬라이드 표면에 복잡한 방향을 위해 사용된다. 바코드는 특정 대상의 miRNAs의 수를 산출, 계산 및 디코딩된다. 형광 바코드 위에 4000 컬러 바코드의 조합, 특정 RNA 각 부호화를 구축하는데 사용될 수있는 네 개의 형광 색 중 하나에 의해 점유 될 수있는 6 위치, 구성된다.

샘플 제제 (즉, RNA 정제 또는 세포 / 조직 파쇄 조제)뿐만 아니라 리포터 캡쳐 프로브의 혼성화는 벤치에서 수행된다. 십이 시험편 단일 슬라이드에 다중화 될 수있다. 밤새 혼성화 한 후, 상기 모든 시료 제제 로봇 준비 스테이션에 의해 수행된다. 로드 된 슬라이드는 다음 광고로 전송됩니다이미징 계수, 복호 및 데이터 처리 igital 분석기. 얻어진 데이터는 이들이 상기 사용자 제어의 고도 처리 첨부 소프트웨어에 반입된다. 독특한 화학, 간단한 제조 자동화 사이트, 단순한 데이터 유형 (카운트)이고, 분석의 전체 유선형 흐름은 고정밀 유전자 발현의 정량을 용이 같은 기능적 상태에서 순환의 miRNA 발현 양상 및 서명 공부에서에게 유용한 도구를 만들기 IBS.

프로토콜

여기에 설명 된 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 임상 시험 심사위원회 (Clinicaltrial.gov # NCT00824941)에 의해 승인되었다.

전체 혈액 샘플 1. 컬렉션

  1. (장기 저장을 허용)는 RNA 안정화 용액을 포함하는 혈액 수집 튜브 정맥 천자를 통해 피험자로부터 전체 혈액 시료 (2.5 ml)에 수집 및 RNA 정제 할 때까지 -80 ℃에서 보관.

2. 총 RNA 정제

  1. g 해동하고 2 시간 동안 혈액 튜브 부화 후 X 5000에서 10 분 동안 스윙 아웃 로터를 사용하여 원심 분리. 조심스럽게 쏟아져 또는 펠렛을 방해하지 않도록주의, 폐 튜브로를 피펫으로 상층 액을 제거합니다.
  2. 펠릿 가시적 용해 될 때까지의 RNase가없는 물 4 ml에 첨가하여 침전물을 씻어 안전하게 캡을 교체 한 소용돌이. 원심 분리기 10 분 다시 5,000 XG에서 스윙 버킷 로터를 사용하여단계 2.1에 기술 된 바와 같이, 상층 액을 이동합니다.
  3. 펠렛에 (제공) BM1 버퍼의 350 μl를 추가합니다. 소용돌이 그것까지 펠릿을 가시적으로 용해시키고, 전체 RNA 추출을위한 2 mL로 처리 튜브로 전송된다.
  4. 로봇 RNA 추출 시스템에서 자동화 될 수있는 시판되는 RNA 추출 키트를 이용하여 전혈로부터 miRNA를 포함한 세포 내 RNA의 자동화 된 정제를 수행한다.
    우리가 사용하는 자동화 된 로봇 시스템은 한 번에 열두 샘플을 처리 할 수 ​​있고,이 RNA 정화 프로토콜이 완료 될 때까지 3 시간 소요 : 주.
    1. 로봇 RNA 추출 시스템에 RNA 정제 키트에서 제공하는 사전로드 된 피펫 팁, 원심 분리기 튜브, 버퍼 및 시약을 넣습니다.
    2. 프로토콜 선택 메뉴에서 "혈액의 miRNA 파트 A"프로토콜을 선택하고 실행을 시작합니다.
      참고 : 자동화 된 절차에 대한 설명은 보충 자료를 참조하십시오.
    3. 로봇은 공동되면자동 miRNA의 정화 프로토콜의 mpleted 파트 A, 폐기물 용기를 비우고 로봇 시스템에서 사용되는 플라스틱과 시약 용기를 제거합니다.
    4. 용출 RNA를 포함하는 모든 마이크로 원심 분리기 튜브의 뚜껑을 닫고 통 어댑터에 배치합니다. 5 분 동안 65 ℃로 샘플을 배양 프로토콜 선택 메뉴에서 "혈액의 miRNA 파트 B"를 선택합니다.
    5. 로봇이 miRNA를 정제 프로토콜의 파트 B를 실행 완료되면 즉시 샘플을 제거하고 얼음을 진정.
  5. 정량 및 광도계를 사용하여 정제 된 RNA의 품질을 평가한다.
    주 : miRNA의 분석 33 NG의 최소 농도의 프로토콜 권장 사항에 따라 AS / μL가 필요하며, 모든 샘플은 충족 또는 부재를 확인하기 위해 1.9 260분의 280 비율 1.8의 최소 230분의 260의 비율을 초과해야 중요한 유기 오염, 분석 성능에 영향을 미칠 수있는 ((17) 참조 참조).
  6. C. O를 -80에서 샘플을 보관

3. miRNA의 샘플 준비

  1. 33 NG 12 RNA 샘플을 정상화 / 뉴 클레아없는 물을 사용 μL.
  2. 클레아없는 물을 사용하여 분석 키트에서 제공하는 miRNA의 컨트롤 500 희석 : 1을 준비합니다. 얼음에 보관하십시오.
  3. 어닐링 마스터 믹스를 준비 : 10 및 20 μl의 피펫을 사용하여 (제공) 어닐링 버퍼의 13 μL, miRtag 시약 (제공) 26 μL, 그리고 (단계 3.2에서 준비) miRNA의 컨트롤의 6.5 μl를 결합한다.
  4. 10 μL 피펫을 사용하여 어닐링 마스터 믹스 3.5 μL 열두 0.2 ㎖의 튜브 스트립의 각각의 RNA 시료 (즉, 100 NG) 3 μl를 추가한다. 톡이, 믹스 열 순환기에서 벤치 탑 미니의 microcentrifuge (2,000 XG)과 장소를 사용하여 스핀 다운 (2 분 1 분, 65 O를 C 94 O C, 10 분 동안 45 O를 C 48 ℃로 유지) .
  5. 3 μ를 조합하여 결찰 마스터 믹스를 준비20 μL 피펫을 사용하여 (제공 PEG)을 결찰 완충액 L (제공) 및 폴리에틸렌 글리콜을 19.5 μL. 10 μL 피펫을 사용하여 단계 3.4에서 스트립 튜브에 각각 결찰 마스터 믹스의 2.5 μl를 추가합니다.
    1. 부드럽게 믹스 벤치 탑 미니 마이크로 원심 (2,000 XG)를 사용하여 스핀 다운, 5 분 동안 48 O를 C에서 열 순환기로 돌아갑니다. 5 분 후, 10 μL 피펫을 사용하여, 3 분 동안 3 분, 46 O를 C에 대해 3 분, 47 O를 C 48 ℃로 그들을를 열 순환기에 직접 각각의 튜브에 리가 1 μl를 추가하고 부화 45 오 5 분, 65 입출력 C를 10 분 동안 C; 4 O C.에서 개최
  6. , 부드럽게 믹스의 열 순환기에서 튜브를 제거 벤치 탑 미니의 microcentrifuge (2,000 XG)를 사용하여 스핀 다운 및 결찰 청소 효소 1 μl를 추가 (제공). 열 순환기 (1 시간 10 분 70 O를 C 37 O C에서 튜브를 품어 4 오에서 개최 입니다. 10 μL 피펫을 사용합니다.
  7. 튜브를 제거하고, 100 μL 피펫을 사용하여, 클레아없는 물 40 μl를 추가, 혼합 및 벤치 탑 미니 마이크로 원심 (2,000 XG)를 사용하여 스핀 다운.

4. miRNA의 하이브리드

  1. 얼음에 기자와 (제공) 포획 프로브 세트를 해동 및 벤치 탑 미니 마이크로 원심 (2,000 XG)를 사용하여 스핀 다운.
  2. 200 μL 피펫을 사용하여 혼성화 마스터 믹스를 생성하기 위해 리포터 코드 세트 튜브 (130 μL)를 혼성화 버퍼 130 μL를 추가한다. 혼합 및 벤치 탑 미니 마이크로 원심 (2,000 XG)를 사용하여 스핀 다운.
    참고 : 기자 및 캡처 프로브는 패널에 포함 된 각 miRNA의 특정 표준이다. 사용자 패널과 사용자 설계 포획 프로브 세트를 설계 할 수있다.
  3. 12 새로운 0.2 ml의 스트립 관에서 20 μL 피펫을 사용하여 하이브리드 마스터 믹스 20 μl를 추가합니다.
  4. 85 O C FO에서 단계 3.7에서 miRNA의 샘플을 변성R 5 분, 얼음을 냉각. 10 μL 피펫을 사용하여 단계 4.3에서 튜브에 각각 5 μl를 추가합니다.
  5. 프로그램에서 65 O를 C의 열 순환기 30 μL 볼륨 계산 (실행의 끝에서 4 O를 C까지 진입로를 프로그래밍하지 않음) 설정 영원히 시간에 온도 가열 뚜껑을.
  6. 10 μL 피펫을 사용하여, 혼합 벤치 탑 미니의 microcentrifuge (2,000 XG)를 사용하여 스핀 다운, 즉시 65 오 C.에 열 순환기에 배치, 각 튜브로 설정 캡처 프로브의 5 μl를 추가 더 이상 12 시간없이 30 시간 동안 품어.

5. 준비 역 및 디지털 분석기

  1. 프렙 역을로드합니다.
    1. 역 문을 열고 시약 플레이트로드 (제공), 카트리지 (제공), 피펫 팁 (제공), 십이 0.2 ml의 스트립 튜브, 열두 빈 0.2 ml의 스트립 튜브 제조 된 샘플 (제공). 스트립 튜브 캡 및 시약 판 커버를 제거합니다. 프렙 역을 닫습니다문 제어판에서 적절한 분석을 실행합니다.
      주 : 혼성화 후 처리없이 분석되는 런 동일하다. 모든 시약 및 플라스틱 실력 프리 패키징하고 실온으로 데리고 2 분 동안 2,000 XG에서 시약 함유 96- 웰 플레이트를 회전 이외의 준비를 필요로하지 않는다. 모든 구성 요소가 준비 역에서 명확하게 정의 된 위치에로드됩니다. 자동화 된 절차에 대한 설명은 보충 자료를 참조하십시오.
  2. 시각화 및 고정화 중심의 노사정 단지의 바코드를 계산합니다.
    1. 의 준비 스테이션에서 카트리지를 제거 제공되는 커버 전표로 밀봉하고, 카메라 광학 위의 슬롯에 디지털 분석기에 넣습니다.
    2. 분석 키트에 표시된 적절한 분석 (miRNA의 패널 분석) 및 분석 버전을 선택하고 프로그램을 실행합니다.
      참고 : 디지털 분석기는 각 샘플의 위치 A에 대한보기 이미지 필드 소요형광 바코드를 허용 t 네 여기 파장이 판독되어 디코딩된다. 특정 miRNA의에 해당하는 특정 바코드는 계산됩니다.
    3. 인터넷 연결을 통해 서버에 직접 USB로 데이터 파일을 내보내거나.

6. 데이터 처리 및 분석

  1. 은 "원시 데이터"탭을 클릭하고 "가져 오기 RCC 파일"을 선택합니다. 의 USB에서 RCC 파일 (원시 데이터 파일)이 들어있는 폴더를 선택합니다.
  2. "다음"을 클릭 모든 QC 상자를 선택하고 "가져 오기"를 클릭합니다.
  3. "새로운 연구"탭을 클릭합니다. 이름을 지정하고 연구를 설명하고 저장합니다.
  4. 새로운 연구에서, "새 실험"탭 이름을 선택하고 새로운 실험을 설명합니다. "다음"을 클릭하고 업로드 된 관련 원시 데이터 파일이 들어있는 왼쪽 창에서 RLF 폴더를 선택합니다. 이 선택되면, "선택하십시오"를 클릭 한 후 "다음"을 클릭합니다.
  5. 더하다주석 경우 원하는하고 "다음"을 클릭합니다.
  6. 배경 빼기 방법을 선택합니다; 대조군 빈 레인 감산 또는 사용자 정의 감산 중 하나가 선택 될 수있다. 선택한 후, "다음"을 클릭합니다.
    참고 : 기술적 인 매개 변수 및 연구의 생물학적 상황에 따라 가장 적절한 배경 보정 방법을 결정합니다.
    참고 : 카운트가 미량 대상 덜 정확. 우리는 여기에 설명하는 연구의 목적을 위해, 데이터는 먼저 QC 파라미터를 검사 기술 복제 걸쳐 상이한 존재비의 miRNA에 대한 계수의 변화를 조사하기 위해 배경 보정없이 처리 하였다. 데이터는 25 카운트 배경 임계 값을 사용하여 재 처리 하였다.
  7. "다음"을 클릭 한 다음 '톱 100'정상화를 선택합니다.
  8. 비율 데이터를 얻으려면, "다음"을 클릭 한 다음 비 매개 변수를 선택합니다.
  9. 클릭 "완료".
  10. 명명 된 예를 클릭왼쪽 창에서 periment은 "정상화"는 "그룹화", "비율 데이터"및 "분석 데이터", "원시"를 포함하는 드롭 다운 메뉴를 공개합니다.
  11. "원시 데이터"를 클릭하고 오른쪽 창에서 QC 보고서를 관찰합니다. 기본 품질 관리 매개 변수를 전달하지 샘플 옆에 플래그를 관찰한다. 신고 된 견본과 "QC / 정규화 플래그에 의해 샘플을 제외"를 선택하여 데이터 분석 단계에서 신고 된 QC 샘플을 제외 간단하게 설명 된 바와 같이 재 처리, 또는하지 않는 새로운 "연구"를 구축 할 수 있습니다.
    1. 수출 "원시", "정규화"또는 CVS에서 "그룹화"데이터 파일 또는 다른 통계 또는 마이크로 어레이 소프트웨어의 분석을위한 또 다른 호환되는 파일 형식입니다.
  12. 왼쪽 창에서 "표준화 된 데이터"를 선택하고 샘플 오른쪽 창에서 분석에 포함 할 선택합니다.
  13. "분석"을 클릭하고 (예를 들어, "열지도 & #을 원하는 분석 유형을 선택34 ;, "바이올린 플롯", "박스 플롯", "산포도"또는 "히스토그램 플롯"). 원하는 제외 기준 박스를 선택 (예를 들어, 아웃 라이어 샘플 또는 유전자 배제 QC 플래그에 의해 샘플을 제외 제어 유전자 배제 및 / 또는 데이터 분석 정규화 프로브를 제외).
  14. 원하는대로 각각의 샘플을 선택 분석에서 제외한다.
  15. 각각의 유전자로부터 배제하거나 원하는 분석에 포함되는 선택.
  16. 선택한 통계 또는 데이터 시각화 조작에 대한 매개 변수를 선택하고 "마침"을 클릭합니다.

결과

기능 장애 Transcriptomic 섭동은 미묘 할 수 있으며, 안정적으로 발현 이러한 미묘한 변화를 검출하기 위해, 유전자 발현의 정량화는 정확해야한다. 유전자 발현 분석 플랫폼 시스템은 고도로 자동화 기술을 통해 자연 잡음을 감소 시키며, 그 사용하는 독특한 화학 고정밀 유전자 발현 데이터를 생성한다. 이 방법을 사용하여 가능하다 발현 정량, 기술 1은 모두 내인성 (파란색 점)에서 높은 재현성과 바이러스의 miRNA (하우스 키핑 유전자가 노란색 점으로 표시됩니다 오렌지 도트)을 보여 그림에 표시된 복제합니다. 이 방법은, 바이러스 성 (도 2a) 및 내인성 (도 2b) 건강한 피험자에 의해 정의 된대로 예상 식에서 편차 표시의 miRNAs를 이용하여 IBS 관심 대상으로 식별 될 수있다. 불분명 주목해야한다 바이러스의 miRNAs 여부여기 검출 된 인간 게놈에 또는 바이러스 부하에서 통합 된 바이러스 유전자에서 파생. 분석은 단일 염기 특이 성숙의 miRNAs를 계산으로, 유사한 내인성 인간의 miRNAs 크로스 하이브리드 않을 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 이들 분자의 차동 정상 수준의 바이오 마커로서 관심이다. 낮은 발현 타겟 사이 섭동 검출 할 수 있도록 이러한 증명서의 정확한 검출이 더 풍부 사체에 의해 압도되지 않는 한에있어서의 정밀도가 허용한다. 미묘한 동요도 확실. 관찰도 할 수있다 3, 4는 IBS와 건강한 대조군에 비해 IBS-서브 타입에서의 miRNAs 순환의 이러한 교란의 일부를, 그리고도 5, 6 (모두 3에서 적응) 두 개의 가장 중요한 차별적 상승의 miRNAs를 표시 (그림 5 : miRNA의 342-3p, 그림 6의 miRNA 150). IBS 참가자 6도 관련 소프트웨어에 의해 생성 된 결과의 그래픽 출력의 일례이다.

figure-results-1
. 그림 1 :이 기술 복제합니다에서 표준화 카운트 기술은 두 개의 카트리지에서 실행 복제합니다 높은 선형 상관 관계를 보여 (R 2 = 0.90, y는 1.03x = - 0.4) 정규화의 범위에서의 miRNA (상위 100로 표준화가의 miRNAs 표현) 카운트 (LOG2의 X 축에서 카운트 및 Y 축). 스 캐터 플롯은 노란색 (8 유전자) 블루 (654의 miRNAs)의 내생 인간의 miRNAs 데이터, 오렌지 (80의 miRNAs)에서 내인성 바이러스의 miRNAs, 하우스 키핑 유전자를 포함한다. 내인성 바이러스의 miRNAs는 분석의 이전 버전 (버전 1.4가 여기에 사용 된) 볼 수 없었다, 그러나 사용자 정의 추가로 사용할 수 있지만 더 이상 표준 분석에 포함되어 있습니다./54693fig1large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2 :. 건강한 컨트롤 대 IBS-변비 (IBS- C)에서 바이러스 및 내인성 인간의 miRNAs의 정규화 카운트 섭동 (a)에서 바이러스 (오렌지)와 (b) 내생 인간의 miRNAs (파란색)이 예에서 알 수있다 IBS-C 참가자 (y 축)의 (LOG2 변환) miRNA의 수는 정상 대조군 (x 축)의 miRNA의 카운트 (LOG2이 변형)에 대해 회귀한다. 의 miRNAs의 대부분은 두 집단에서 매우 유사하게 표현하지만, 일부는 특히 상관 관계를 일탈. 이러한 편차는 모두 희귀하고 풍부하게 표현 된 대상 중 분명하다. 하십시오이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3 :.의 miRNAs는 크게 균일하게 된 유의 건강한 대조군에 비해 IBS으로 표현되는이 된 유의은 IBS에서의 miRNAs 범주 내에서 일관성 검사와 통계적 유의성의 테스트를 결합 선형 판별 분석의 효과 크기의 방법을 사용하여 공개하는 표현. 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

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그림 4 :.의 miRNAs는 크게 균일하게 된 유의 건강한 대조군에 비해 IBS 서브 타입으로 표현하는 miRNA가 디 있었다(: 설사, -C : -D 변비) fferentially IBS-서브 타입으로 표현. 카테고리 내에서 일관성 검사와 통계적 유의성의 테스트를 결합 선형 판별 분석의 효과 크기의 방법을 사용하여 정상 대조군에 비해 더 큰 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 버전입니다.

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그림 5 :. miRNA의-342-3p의 차등 발현 원인 불명의 만성 복통은 IBS의 주요 증상입니다. 박스 플롯은 miR-342-3p (y 축에 정규화 계수), 원인 불명의 만성 방광 통증과 관련된 miRNA의이, 건강한 대조군에 비해 모든 IBS 서브 타입에서 높은 카운트에서 순환에 존재하는 것으로 밝혀졌다 것을 알 수있다. 바가 비 특이 범위를 나타내는 박스간 분위 범위와 파란색 사각형 중간 카운트 말이지. 3에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 6 :의 miRNA-150의 차동 식 IBS 참가자는 건강 대조군 (y 축에 LOG2 변환 계수)에 비해은 miR-150 카운트를 순환 상당히 높은 것으로 보여 바이올린 플롯.. 곡선이 카테고리의 카운트의 주파수를 표시, 수직 막대는 1 차 및 3 차 분위수를 나타내고, 붉은 광장 중간 수를 나타냅니다. 3에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

프로토콜 내에서 중요한 단계

특히 miRNA의 분석을 위해, 시약 용 해물에 사용하기 위해 최적화되지 않은 같은 (이들의 mRNA 및 단백질 분석에 사용될 수있다) 정제 된 용 해물을 사용하지 않는 것이 중요하고, 시료 전처리 반응을 억제 할 것으로 보인다. 또한, 오염 물질은 결찰 샘플 정제 반응을 억제 할 수있다 (예를 들면, 구 아니 디늄 화합물, 에탄올, 페놀)의 용해 및 RNA 정제 단계 이월. 좋은 품질의 RNA는 miRNA의 분석의 감도와 정확도에 따라서 중요합니다.

가열 뚜껑 열 순환기를 사용하면 모든 반응 단계의 성능을 최적화하기 위해 적절한 온도 조절을 위해 중요하다. 3.5.1 단계 동안, 상기 리가 아제를 첨가하는 동안 온도를 유지하기 위해 열 순환기에서 스트립을 제거하지 않는 것이 중요하다. 스트립을 제거하면 리가 아제를 추가하려면반응을 손상됩니다. 하이브리드 화 단계를 수행 할 때, 튜브의 시약을 혼합하는 경우가 리포터 프로브 전단 있으므로, 격렬히 진탕 피펫 또는 긋기을 방지하는 것이 중요하다. 최적의 성능과 일관성을 보장하기 위해서는 철저하게 부드러운 긋기에 의해 튜브의 시약을 혼합하는 것이 중요하다. 항상 혼합 한 후 반응을 스핀 다운, 새로운 펫이 시약은 정확한 피펫을 보장하고 실수로 교차 오염을 방지하기 위해 분배 될 때마다 팁을 사용합니다.

수정 및 문제 해결

코드 세트는 관심의 대상을 포함하도록 사용자 정의 할 수 있습니다. 이러한 방식으로, 비용은 추가로 조사 또는 생체 서명을 검증 할 때 큰 샘플 세트의 테스트를 균형있게 할 수있다. 사용자 정의 프로브는 일품 요리 메뉴에서 사용할 수있는 유전자 또는 대상 있지을 위해 설계 될 수있다. 덜 풍부 대상 또는 저농도 RNA 감도가 될 수및 / 또는 고해상도 디지털 계수를 이용하여보다 긴 시간 혼성화시킴으로써 조작.

우리의 연구에서 우리는 전체 혈액에서 총 RNA와 미리 정의 된 800 대상 miRNA의 패널을 사용; 그러나, 분석은 더 타겟 접근 방식이 필요한 경우 적은 수의 miRNAs을 포함하도록 사용자 정의 할 수 있습니다. 두 개의 카트리지 편안 로봇 준비 스테이션 후 혼성화 처리 통과 다음날 디지털 분석기에 묘화 될 수 있기 때문에 24 샘플의 총 12 두 세트에 엇갈리게 한 날을 제조 할 수있다. (12)의 배치에서의 샘플의 시차를 처리 혼성화 시간을 표준화하는 것이 중요하다. 이미지화 된 카트리지 저장 및 데이터 분석은 높은 해상도 스캔 희소의 miRNAs의 검출을 향상시킬 수 있음을 시사하는 경우 다시 스캔 4 ℃로 저장 될 수있다. 희소 분자의 검출은 또한 이상 샘플을 혼성화함으로써 개선 될 수있다; 그러나, 연장 하이브리드 있습니다 END_STRONG_1 수 있습니다과포화에서 t과 시작 RNA 농도는 (세포 외 소포 유래 RNA에서와 같이) 낮은 경우에만 결과를 향상시킬 수 있습니다. 플랫폼의 감도와 정밀도가 상대적으로 미량의 miRNAs 안정적으로 계산 할 수 있습니다.

기술의 한계

상술 한 유전자 발현 분석 플랫폼은 단지 어레이 당 800 대상을 수용. 그것은 따라서 전체의 miRNA-전 사체 / 전체 사체 연구에 적합하지 않습니다. 단지 공지 된 바와 지정된 타겟 플랫폼을 이용하여 검출 할 수 있으므로, 새로운 분자 종의 발견에 적합하지 않다. 이러한 RNASeq 또는 다른 기존의 마이크로 어레이 방법 등의 다른 방법으로는, 전 사체 탐색 연구에 더 적합하다.

기존 / 대체 방법에 대하여 기술의 중요성

IBS 증상의 요구에 맞는 우수한 서비스를 제공, 인쇄용cipally 복통 등; 내장 과민 반응; 이러한 빈번한 설사, 변비 또는 둘 9,10-의 조합으로서 대장 습관의 변화. IBS의 증상은 알려진 유기 원인이없고, 환자는 임상 적으로 유의 한 염증, 위장 조직, 또는 전신 마커 9-12의 조직 병리학 적 섭동에 존재하지 않습니다. 연구 IBS의 생물학적 조절 곤란이 공통 테마 염증과 면역 기능 (10)의 주위에 신흥로, 미묘한 무증상, 이기종 있음을 시사한다. 따라서 실험 도입 된 변형을 제어하고 안정적으로 유전자 발현의 미묘한 섭동을 검출 할 수 있었던 플랫폼을 사용할 필요가 있었다. 분석 시스템의 독특한 특성은 시료 처리를 표준화 및 재현성 높은 데이터를 생성하는 기술의 분산을 감소 자동화를 통해 처리 실험을 감소시킨다. 이러한 기능은 집중 조사를 허용하고 매우 정확하고 연구 생산eplicable 데이터. 세기 - 또는 증폭 - 기반 방법을 사용할 때 더 풍부 대상의 신호에 의해 간과하거나 압도 될 수 저 발현 타겟 간의 미묘한 섭동 및 교란의 검출을 허용한다. PCR 기반의 마이크로 어레이 및 RNAseq 방법은 기술 플랫폼을 사용하여 실행 가능한 대안과 높은 처리량이 요구 될 때 또는 다른 매력이 될 수있는 목표는 전체 사체의 특성을하거나 새로운 분자를 찾을 때. 그러나 대안이 정확하고 민감하게 감지하고 희귀 한 목표와 미묘한 동요를 정량으로도 수행 할 수 있습니다.

이 기술을 마스터 한 후 미래의 응용 프로그램 또는 방향

IBS 참가자 순환 miRNA의 발현은 유의과 범주 내에서 일관 둘 것으로 나타났다 섭동들을 보였다. 식별의 miRNAs는 관련 pathwa과 관련이YS와 기능 통증 조건 (은 miR-342-3p : 만성 방광 통증)을 포함한 병리학 적 조건, 8, 염증 (은 miR-150) 13. 예제 연구 목표와 관심의 시스템을 정의하는 데 사용되는 탐색 적 코호트 기반으로했다. 보다 구체적으로 타겟팅 miRNA의 작은 어레이는 샘플 당 비용 절감과 검증하고 서명과 바이오 마커를 수정하기 위해 비용 효율적인 방법으로 분석 할 더 큰 집단을 허용 제조 하였다. 유전자 발현 플랫폼 분석 시스템은 마이크로 어레이의 전통 탐구 자연과 수정 및 분자 서명 및 바이오 마커 14-16을 테스트하기 위해 더 많은 대상, 가설 기반 데이터 수집 사이의 균형을 친다. 이 방법은 상술 한 타겟 miRNAs의 발현을 통해 또는 억제 실험적 어디에 생체 내 및 시험 관내 모델에서 분자와 단백질 섭동을 검사하는 데 사용된다. 새로운 분석은의 mRNA 및 P의 동시 정량 허용직접 세포 및 조직 해물에서 roteins. 또한, 말초 혈액과 배설물 (예컨대, 소변)의 특정 분획의 정제를 최적화 및 사용자 특정 분석 파라미터 분자 프로파일 및 저분자 농축 분획 (예 exosomal 분획)의 서명을 최적화함으로써 조사한다.

공개 사항

W.A.H., S.K.A., N.H.F. 및 RMP는 미국 특허(no. PCT/US14/38638)에 대한 항구에 대한 본원에 기재된 연구로부터 발생하는 IBS의 순환 miRNA 시그니처에 대해.

감사의 글

저자는 미국 보건복지부(Department of Health and Human Services), 국립보건원(National Institutes of Health), 국립간호연구소(National Institute of Nursing Research), 교내 연구부(Division of Interramural Research)로부터 Wendy A. Henderson, 1ZIANR000018-01-06, Nicolaas H. Fourie, Ralph M. Peace, Sarah K. Abey, Leeanne B. Sherwin에게 교내 연구 교육상(Intramural Research Training Awards), Howard Hughes-NIH Research Scholar Ralph M. Peace에게 Burroughs Wellcome Fund의 특별 지원을 인정한다.

여기에 표현된 의견과 이러한 데이터의 해석 및 보고는 저자의 책임이며 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 또는 미국 정부의 공식 권장 사항, 해석 또는 정책으로 간주되어서는 안 됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
nCounter Prep-StationNanostringN/AEssential
nCounter 디지털 분석기N/A필수
분광 광도계NanoDropND-1000사용 가능 적절한 등가
원심분리기AnyN/ACan
equivalent MiniMicroCentrifugeAnyN/ACan use the same N/A 적절한 등가
피펫(1,000, 100, 20, 10 µ l)모든N / A적절한 등가물을 사용할 수 있습니다
QiacellQiagen9001292적절한 등가물을 사용할 수 있습니다
PAXgene Blood miRNA KitQiagen763134적절한 등가물을 사용할 수 있습니다
PAXgene Blood TubesVWR77776-026적절한 등가를 사용할 수 있습니다
nCounter Human miRNA Assay KitNanostring150625essential
nCounter 마스터 키트나노 스트링100050에센셜
nSolver나노 스트링N/A에센셜
use suitable 는

참고문헌

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  17. nCountermiRNA Expression Assay User Manual (MAN-C0009-05). , NanoString Technologies, Inc. Available from: http://www.nanostring.com/media/pdf/MAN_nCounter_miRNA_Expression_Assay.pdf (2013).

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과민성 대장 증후군에서의 miRNAs 순환의 교란은 멀티 플렉스 높은 처리량 유전자 발현 플랫폼을 사용하여 감지
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