말단 중간 대뇌 동맥 분기 (MCAO)의 수술 폐색 실험 뇌졸중 연구에서 자주 사용하는 모델입니다. 이 논문은 마우스에서 생체 내에 길이 현미경을위한 기회를 제공하는 측의 두개 창에 삽입, 결합 영구 MCAO의 기본적인 기술을 설명한다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
초점 대뇌 허혈 (즉, 허혈성 뇌졸중)은 신경 기능의 심각한 손실을 결과적으로 모터 및인지 장애의 호스트로 이어지는 주요 뇌 손상의 원인이 될 수 있습니다. 스트로크 1 전 세계적으로 장기 장애와 사망의 주요 원인 중 하나입니다으로 높은 유병률은, 심각한 건강 부담을 포즈. 신경 기능의 회복은, 대부분의 경우, 단지 부분이다. 지금까지 치료 옵션은 매우 인해 혈전 용해 2,3의 좁은 시간 창에 특히 제한됩니다. 뇌졸중에서 회복을 가속화하는 방법을 결정하는 주요 의료 목표 남아있다; 그러나, 이는 복구 프로세스에 충분한 기계적 통계에 의해 방해되어왔다. 실험 행정 연구원은 자주 국소 뇌허혈의 설치류 모델을 사용한다. 급성기를 넘어, 뇌졸중 연구는 점점 뇌허혈 다음 서브 급성 및 만성 단계에 초점을 맞추고 있습니다. 대부분의 행정 연구원이 적용 영구 또는 트란마우스 또는 쥐의 MCA의 지어서 transient 폐색. 환자에서 MCA 폐색의 허혈성 뇌졸중 (4)의 가장 흔한 원인들이다. 필라멘트 모델을 사용하여, MCA 폐색의 근위 외에 원위 MCA 폐색 수술 실험 스트로크 연구 5에서 가장 자주 사용되는 모델은 아마도. MCA 분기합니다 (lenticulo - 선조체 동맥의 분지에) 원위의 폐색은 일반적으로 선조체 여분 주로 신피질에 영향을 미친다. 혈관 폐색은 영구적 또는 일시적 일 수있다. 장기적인 결과에 대해 병소 용적과 매우 낮은 사망률의 재현성이 모델의 주요 이점이다. 여기, 우리는 시상 동에 만성 두개골 창 (CW) 준비 측면을 수행하고, 이후에 어떻게 개두술 방법을 사용하여 창 아래에 말단 행정을 유도 외과 적 방법을 보여줍니다. 이러한 접근법을 통해 허혈성 급성 및 만성 변화 순차 촬상 적용될 수있다, 공 초점 레이저 스캐닝 및 이광자 현미경 생체 내에 에피 - 조명.
서론
뇌졸중은 전 세계적으로 장기 장애 및 사망의 주요 원인 중 하나이며1 관상 동맥 심장 질환에 이어 두 번째입니다. 또한 뇌졸중은 장기 장애의 주요 원인이며, 이는 뇌졸중이 엄청난 사회경제적 영향을 미친다는 점을 강조한다6-8. 급성 치료를 넘어 뇌졸중 후 회복을 가속화하고 향상시키기 위한 새로운 접근법과 메커니즘을 연구하는 것이 여전히 주요 의학적 목표이다7.
지난 수십 년 동안 뇌졸중 실험 연구의 데이터는 허혈에 의해 유발되는 복잡한 병태생리학적 연쇄 반응을 이해하는 데 크게 기여했습니다9,10. 발치 독성(Excitotoxicity), 세포사멸(apoptosis), 경색 주위 탈분극(peri-infarct depolarization) 및 염증(inflammation)은 국소 뇌허혈 후 세포 사멸의 가장 관련성이 높은 매개체로 확인되었습니다. 또한, 뇌허혈의 동물 모델을 사용하여 중요한 개념, 진단 방식 및 치료 접근법이 개발되고 검증되었습니다(예: "반음" 및 혈전용해술)11.
비침습적 영상 기법(예: 자기공명영상(MRI), 컴퓨터 단층 촬영 또는 레이저 스페클 대비 분석)과 결합된 실험적 뇌졸중 모델의 가용성으로 인해 연구자는 허혈성 모욕에 의해 유발된 초급성 및 만성 병태생리학적 변화를 종단적으로 조사할 수 있다12. 진화하는 병변의 시공간 프로파일을 연구하는 것과 함께 신경 가소성과 유사한 변화를 조사하고 기능적 결과 및 조직학적 발견과 상관시킬 수 있습니다. 지난 몇 년 동안 뇌허혈 모델과 두개골 창13을 통한 생체 내 현미경의 조합을 사용하여 추가적인 방법론적 발전이 이루어졌습니다. 이러한 새로운 기술을 통해 연구자는 국소 뇌허혈 후 급성, 아급성 및 만성 단계에서 뛰어난 분석력으로 세포 및 분자 수준에서 신경혈관 단위를 분석할 수 있습니다14. 또한, 미세순환 역학의 생체 내 현미경 이미징은 대뇌 미세혈관 구조 기능 및 혈관 건축의 새로운 측면을 밝혀냈으며, 이는 유의미한 병태생리학적 관련성을 가지고 있습니다15-17.
이 프로토콜에서는 시상동 측면에 만성 CW 준비를 수행하는 방법과 창 아래에서 원위 뇌졸중을 외과적으로 유도하는 방법을 제시합니다. 이 마우스 모델은 epi-illuminating, confocal laser scanning 및 two-photon intravital microscopy를 통해 국소 뇌허혈 후 급성, 아급성 및 만성 변화의 순차 이미징에 적용할 수 있습니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
윤리 선언문 : 동물 과목을 포함하는 실험은 적용 가능한 Landesamt FUER 아퍼 싶게 Soziales, 베를린, 독일 (G0298 / 13) 및 도착 도착 기준에 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다. 12 주령의 수컷 C57BL / 6J 마우스에 대한 연구, 10을 사용 하였다.
1. 측면 만성 두개골 창 준비
- 케타민 (90 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (/ kg 10 mg)의 피하 주사로 마취를 수행합니다. 통증 자극에 적절한 진정 작용에 대한 시험.
- 70 % 에탄올로 수술 도구와 수술 부위를 소독.
- 설치류 면도기를 사용하여 눈에 목 두피 머리를 제거합니다.
- 정위 프레임에 머리를 고정합니다.
- 탈수를 방지하기 위해 두 눈에 dexpanthenol 눈 연고를 사용합니다.
- 모든 머리카락을 제거하고 74.1 %의 에탄올의 3 층과 10 % 2 프로프라놀롤로 소독 할 수있는 외과 영역을 청소합니다.
- 중간 선을 수행합니다메스를 사용하여 눈 목 절개.
- 4 텐팅 (tenting) 봉합으로 피부 플랩에 걸쳐.
- 시간적 근육이 시작되는 지점에 메스를 긁어하여 왼쪽 반구에 조심스럽게 골막을 제거합니다.
주 :이 제제는 상기 커버 유리를 해결 치과 용 접착제에 대한 양호한 접착 성 영역을 생성하는 역할을한다. - microdrill를 사용하여 뼈 플랩의 가장자리에 두개골을 얇게하여 4mm의 직경 전두 - 두정엽의 개두술을 수행합니다. 열 손상을 방지하기 위해 시추하는 동안 생리 식염수를 적용합니다.
- 캐 뉼러에 뼈 플랩을 올리고 microforceps를 사용하여 제거합니다.
- 식염수로 조심스럽게 광범위하게 관개.
- 이 적절한 농도를 갖는 유체 아니다까지 치과 용 접착제를 혼합 (즉, 접착제가 더 이상 스레드를 생성 안된다). 개두술 주위의 뼈에 놓습니다.
- 제조 된 접착제에 6 mm 직경 커버 글라스를 놓고 번째로 해결치과 용 접착제의 전자 휴식. 이 방수 있는지 확인합니다. 접착제가 집게로 검사하여 하드 건조하고 될 때까지 기다립니다.
주 : 추가 관개는 경화 과정을 가속화합니다. - 텐팅 (tenting)의 봉합사를 제거하고 피부 봉합에 상처를 닫습니다.
- 마우스의 측면의 피부를 당겨. 바늘 피하에 삽입하고 부드럽게 유체 균형을 멸균 생리 식염수를 피하 0.5 ml를 대체합니다.
- 수술 후, 90 분 동안 가열 복구 케이지에 동물을 유지합니다. 동물 무인을 떠나기 전에 완전히 깨어 때까지 기다립니다. 동물이 완전히 다른 동물 케이지에게 반환하기 전에 복구 될 때까지 기다립니다.
- 단계 1.16에 기술 된 바와 같이, 약 12 시간 후에 피하 식염수 볼륨 교체 반복한다.
- 항상 수술 (예를 들어, 파라세타몰 (10 ㎎ / ㎖), 또는 다른 비 스테로이드 성 항염증제) 후 구강으로 삽입 위관을 통해 직접 진통제를 적용한다.
- 확인 매일 수술 후 동물의 상태, 항상은 페트리 접시 간단한 식사를 만들 및 수술 후 중요한 체중 감소를 방지하기 위해 바닥에 동물 음식을 으깬 제공합니다.
주 : 생체 내에 현미경 두개 창이 제조 후 첫 날에 수행 될 수있다. - 이소 플루 란 마취를 적용하고 헤드 홀더에 동물을 고정합니다. 피부 봉합을 열고 면봉과 멸균 식염수 창을 청소합니다. 24 시간 후, 두개골 창이 영상을 가능하게 그 시점에 의해 뇌척수액으로 가득해야합니다. 설립 현미경 프로토콜 18을 사용하여 이미지를 수행합니다.
2. 말초 MCAO
참고 : MCAO 절차는 CW 준비 후 약 5 D를 수행해야합니다. 이는 뇌졸중 유도 면역 반응과 CW 제제에 의한 면역 반응의 간섭을 최소화한다.
"SRC ="/ 파일 / ftp_upload / 54701 / 54701fig1.jpg "/>
원위 MCAO 1. 개요도. A.이 연산 전에 선박에 대한 좋은 개요입니다. 첫 번째 바이폴라 접촉 후 B에 선박. 두 번째 바이폴라 접촉 후 C를 혈관. D. 완전히 지금은 폐쇄 된 선박에 대한 개요. 낮은 배율 E. 최종 개요. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 수의학 직원 (과 협의에 마취 마스크와 적절한 마취 정권을 사용하여 마우스를 마취 예를 들어, 1.5 유도 - 2/3 N 2 O 1/3 O 2 1.5 % 이소 플루 란을 통해 - 2 % 이소 플루 란과 1.0 유지 보수 기화기).
- (면도하고 머리를 제거하고 적절한 에이전트로 피부와 주변 모피 소독예를 들면, 70 % 에틸 알코올), 그 후이를 건조.
- 36.5 ℃에서 쥐의 체온을 유지 수술 중에 0.5 ° C, ±. 마우스의 직장 온도에 따라 가열 피드백 제어 가열 패드는 매우 좋습니다.
- 측면 위치에 동물을 배치합니다. 마취 마스크의 코를 수정하고 1.0에 이소 플루 란 농도를 조정 - 1.5 %.
- 두 눈에 젖은 연고 (dexpanthenol)를 적용합니다.
- CW 준비를 위해 만든 피부 절개를 사용합니다.
- 부드럽게 피부를 분리하고 아래 시간 근육을 식별합니다.
- 고주파 발전기의 에너지 조절 (5-7 W)를 바이폴라 모드를 사용한다.
- electrocoagulation 집게를 사용하여 조심스럽게 완전히 근육을 제거하지 않고, 근육 플랩을 만드는 두개골에서 시간적 근육을 제거합니다.
- , 시간 영역의 주동이의 부분에 투명 두개골 아래 MCA를 확인 레트로 ORBITA에 지느러미리터의 동. MCA 분기점을 식별 할 수없는 경우, 용기가 가장 입쪽 식별하려고.
- 지속적으로 열 손상을 방지하기 위해 관개 동안 microdrill와 MCA 분기 위에 얇은 두개골.
- 캐 뉼러에 뼈를 들어 올려 microforceps으로 제거합니다.
- W. 5 - (3)에 고주파 발전기의 에너지를 감소
- 위에서 동맥에 접근 조심스럽게 용기를 해제하지 않고 양쪽에 바이폴라 집게으로 만지지.
- 용기 분기점에 근위 및 원위 혈관 응고.
- 30 초 동안 기다린 후 혈액의 흐름이 영구적으로 중단되도록 부드럽게 동맥을 터치합니다. 개통이 관찰되는 경우 electrocoagulation를 반복합니다.
- 가능하면, 뼈의 결함을 커버하는 근육에 삽입 한 2 바늘 시간적 근육 수정.
- 상처를 봉합하고, 가열 회수 상자에 동물을 배치합니다. 빨리 휘발성 ANEST 후 일반적으로, 동물 복구hesia.
- 단계 1.16의 설명에 따라 볼륨 대체를 들어, 멸균 생리 식염수를 피하 0.5 ml에 적용됩니다.
- 수술 후, 동물은 90 분 동안 가열 복구 케이지에 체류 할 수 있습니다. 동물 무인을 떠나기 전에 의식이 될 때까지 기다립니다. 그들이 완전히 회복되는 경우에만 다른 동물과 케이지로 돌아갑니다.
- 12 시간 후, 단계 1.16에 설명 된대로 볼륨 대체를 반복합니다.
- 마시는 물 (예를 들어, 파라세타몰 (10 ㎎ / ㎖), 또는 다른 비 스테로이드 성 항염증제)를 통해 수술 후 통증을 적용한다.
- 수술 후 매일 동물의 건강 상태를 확인합니다. 식사를 단순화하고 수술 후 체중 감소를 최소화하기 위해 바닥에 페트리 접시에 으깬 동물 음식을 제공합니다.
3. 위장 치료
- 위 포함한 CW가 노출 된 중간 대뇌 아칸소 응고하지 않는 준비을 제외한 설명 된 1 단계와 2 단계로 동일하게 모든 절차를 수행tery.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
타임 라인 대표적인 결과는도 2 및도 3에 도시되어있다. 우수한 시상 동 (도 2 B, C, D) 숙련 된 의사에 의해 수행되는 매우 낮은 사망률과 질병률 레이트 결과 작은 두개 창 폭과 뇌 창 제제. 10 동물 모두 생존, 모든 만성 CW도 이십팔일 수술 후 고품질의 화상을 위해 사용될 수있다. 상처 감염 또는 다른 합병증 문제는 없었다.
때문에 휘발성 마취 만 작은 뇌 손상, 약 10 짧은 노출 - (15) 원위 MCAO 후 분, 가열 복구 케이지로 전송, 모든 동물은 자유롭게 복구 케이지 이동하고, 한배 새끼와 상호 작용, 깨어 있었다. 일반적으로, 말단 MCAO 모델의 치사율은 5 % 이하이며, 주로 혈관 I의 결과로서 발생njury 및 MCAO 수술시 이후의 출...
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
스트로크 1 전 세계적으로 장기 장애와 사망의 주요 원인 중 하나입니다. 급성 치료, 가속 및 뇌졸중 후 회복을 향상시키기 위해 새로운 접근 방식과 메커니즘을 조사 외에도 주요 의료 목표 7 남아있다. 실험 행정 연구원은 자주 국소 뇌허혈의 설치류 모델을 사용한다. 사실, 일시적 또는 영구적 유도 MCAO 모델은 환자 4 국소 뇌허혈의 가장 흔한 유형 중 하나를 모방. MCA 폐색의 근위 외에 원위 MCAO 수술 폐색 필라멘트 모델 실험 스트로크 연구 5,19에서 가장 자주 사용되는 모델은 아마도. 여기서는 영구 원위 MCAO의 기본 기술은 마우스에서 생체 내에 길이 현미경을위한 기회를 제공하고, 횡 CW와 함께 설명한다. 장기 연구 결과에 대하여 특히 병변 부피의 재현성뿐만 아니라 매우 낮은 사망률 아칸소이 쥐 모델의 주요 장점을 전자. 이 피질 뇌졸중 모델에서, 스트로크 영역 경색 주변 영역에서 혈관 만성 CW를 통해 가시화 될 수있다. 다중 표...
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
VP는 Charité - Universitätsmedizin Berlin과 Berlin Institute of Health에서 자금을 지원하는 Charité Clinical Scientist Program의 참가자입니다. TB는 SNSF PostDoc Mobility 펠로우입니다. 저자는 EinsteinStiftung/A-2012-153에서 PV에 이르기까지 보조금 지원을 받습니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 양안 수술 현미경 | Zeiss | Stemi 2000 C | |
| 현미경 용 광원 | Zeiss | CL 6000 LED | |
| 직장 프로브가있는 가열 패드 | FST | 21061-10 | |
| 정위 프레임 | Kopf | 모델 930 | |
| 이소 플루란 용 Anaethesia 시스템 | Draeger | ||
| Isoflurane | Abott | ||
| Dumont 펜치 #5 | FST | 11251-10 | |
| Dumont 펜치 #7 | FST | 11271-30 | |
| 바이폴라 펜치 | 에르베 | 20195-501 | |
| 바이폴라 펜치 | 에르베 20195-022 | ||
| 마이크로드릴 | FST 18000-17년 | ||
| 바늘 홀더 | FST | 12010-14 | |
| 5-0 실크 봉합 | Feuerstein, Suprama | ||
| 7-0 실크 봉합 | Feuerstein, Suprama | ||
| 8-0 실크 봉합사 | Feuerstein, Suprama | ||
| 수의학 회복 챔버 | Peco Services | V1200 |
참고문헌
- Mukherjee, D., Patil, C. G. Epidemiology and the global burden of stroke. World Neurosurg. 76 (6), Suppl 85-90 (2011).
- Ebinger, M., Prüss, H., et al. Effect of the use of ambulance-based thrombolysis on time to thrombolysis in acute ischemic stroke: a randomized clinical trial. JAMA. 311 (16), 1622-1631 (2014).
- Ebinger, M., Lindenlaub, S., et al. Prehospital thrombolysis: a manual from Berlin. J vis Exp. (81), e50534(2013).
- Bogousslavsky, J., Van Melle, G., Regli, F. The Lausanne Stroke Registry: analysis of 1,000 consecutive patients with first stroke. Stroke. 19 (9), 1083-1092 (1988).
- Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. J Vis Exp. (47), (2011).
- Donnan, G. A., Fisher, M., Macleod, M., Davis, S. M. Stroke. Lancet. 371 (9624), 1612-1623 (2008).
- Meairs, S., Wahlgren, N., et al. Stroke research priorities for the next decade--A representative view of the European scientific community. Cerebrovasc Dis. 22 (2-3), 75-82 (2006).
- Rosamond, W., Flegal, K., et al. Heart disease and stroke statistics--2007 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 115 (5), 69-171 (2007).
- Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. The science of stroke: mechanisms in search of treatments. Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).
- Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A. Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends Neurosci. 22 (9), 391-397 (1999).
- Dirnagl, U., Endres, M. Found in Translation: Preclinical Stroke Research Predicts Human Pathophysiology, Clinical Phenotypes, and Therapeutic Outcomes. Stroke. , (2014).
- Prinz, V., Hetzer, A. -M., et al. MRI heralds secondary nigral lesion after brain ischemia in mice: a secondary time window for neuroprotection. J Cereb Blood Flow Metab. , (2015).
- Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J Vis Exp. (61), (2012).
- Holtmaat, A., Bonhoeffer, T., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Iadecola, C., Dirnagl, U. The microcircualtion--fantastic voyage: introduction. Stroke. 44 (6), Suppl 1 83(2013).
- Blinder, P., Tsai, P. S., Kaufhold, J. P., Knutsen, P. M., Suhl, H., Kleinfeld, D. The cortical angiome: an interconnected vascular network with noncolumnar patterns of blood flow. Nat Neurosc. 16 (7), 889-897 (2013).
- Shih, A. Y., Driscoll, J. D., Drew, P. J., Nishimura, N., Schaffer, C. B., Kleinfeld, D. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1277-1309 (2012).
- Cabrales, P., Carvalho, L. J. M. Intravital microscopy of the mouse brain microcirculation using a closed cranial window. J Vis Exp. (45), (2010).
- Rosell, A., Agin, V., et al. Distal occlusion of the middle cerebral artery in mice: are we ready to assess long-term functional outcome. Transl Stroke Res. 4 (3), 297-307 (2013).
- Dorand, R. D., Barkauskas, D. S., Evans, T. A., Petrosiute, A., Huang, A. Y. Comparison of intravital thinned skull and cranial window approaches to study CNS immunobiology in the mouse cortex. Intravital. 3 (2), (2014).
- Balkaya, M., et al. Assessing post-stroke behavior in mouse models of focal ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (3), 330-338 (2013).
- Balkaya, M., Kröber, J., Gertz, K., Peruzzaro, S., Endres, M. Characterization of long-term functional outcome in a murine model of mild brain ischemia. J Neurosci Methods. 213 (2), 179-187 (2013).
- Freret, T., Bouet, V., et al. Behavioral deficits after distal focal cerebral ischemia in mice: Usefulness of adhesive removal test. Beh Neurosci. 123 (1), 224-230 (2009).
- Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. RODENT STROKE MODEL GUIDELINES FOR PRECLINICAL STROKE TRIALS (1ST EDITION). J Exp Stroke Trans Med. 2 (2), 2-27 (2009).
- Florian, B., Vintilescu, R., et al. Long-term hypothermia reduces infarct volume in aged rats after focal ischemia. Neurosci Lett. 438 (2), 180-185 (2008).
- Noor, R., Wang, C. X., Shuaib, A. Effects of hyperthermia on infarct volume in focal embolic model of cerebral ischemia in rats. Neurosci Lett. 349 (2), 130-132 (2003).
- Barber, P. A., Hoyte, L., Colbourne, F., Buchan, A. M. Temperature-regulated model of focal ischemia in the mouse: a study with histopathological and behavioral outcomes. Stroke. 35 (7), 1720-1725 (2004).
- Shin, H. K., Nishimura, M., et al. Mild induced hypertension improves blood flow and oxygen metabolism in transient focal cerebral ischemia. Stroke. 39 (5), 1548-1555 (2008).
- Kapinya, K. J., Prass, K., Dirnagl, U. Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism. Neuroreport. 13 (11), 1431-1435 (2002).
- Gertz, K., Priller, J., et al. Physical activity improves long-term stroke outcome via endothelial nitric oxide synthase-dependent augmentation of neovascularization and cerebral blood flow. Circ Res. 99 (10), 1132-1140 (2006).
- Dirnagl, U. Bench to bedside: the quest for quality in experimental stroke research. J Cereb Blood Flow Metab. 26 (12), 1465-1478 (2006).
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
태그
