그룹 B의 쥐 모델 연쇄상 구균 질 식민

요약

이 프로토콜의 목적은 쥐 모델에서 인간의 B 군 연쇄상 구균 (GBS) 질 식민지를 모방하는 것입니다. 이 방법은 숙주의 면역 반응 및 GBS 질 지속성에 기여 박테리아 인자를 조사 할뿐 아니라 치료 전략을 시험하기 위해 사용될 수있다.

초록

성인의 30 % - 연쇄상 구균 agalactiae (그룹 B 연쇄상 구균, GBS)는 인간의 위장관 10의 질 기관의 그람 양성, 증상이 식민지 개척자이다. 면역 손상 개인을 포함한 신생아, 임산부, 노인에서는 GBS 패혈증, 관절염, 폐렴과 뇌막염을 일으키는 원인이 침입 병원체로 전환 할 수 있습니다. GBS가 신생아의 선도적 인 세균성 병원체이기 때문에, 현재의 예방은 GBS 질 식민지와 GBS 양성 어머니의 후속 산기 항생제 치료를 위해 임신 후기 검사로 구성되어 있습니다. 무거운 GBS 질 부담은 신생아 질환과 식민지 모두의 위험 요인이다. 불행하게도, 거의 호스트 및 홍보 또는 질 식민지 GBS을 허용 박테리아 요인에 대한 알려져있다. 이 프로토콜은 세균 LOA를 결정하는 하나의 β-에스트라 전처리 매일 샘플링을 이용한 영구 GBS 질 집락을 설정하기위한 기술을 설명디. 그것은 더 자세한 방법은 추가 치료 또는 관심의 시약을 관리하고 질 세척 유체 및 생식 기관의 조직을 수집 할 수 있습니다. 이 마우스 모델 임신 중 모체의 질 집락을 제어하고 취약한 신생아로의 전송을 방지하기 위해 잠재적 인 치료 표적으로 이어질 질 환경 내 GBS 호스트 상호 작용의 이해를 촉진한다. 또한 여성의 질 기관에서 일반 세균 - 호스트 상호 작용에 대한 우리의 이해를 높이기 위해 관심이 될 것입니다.

서론

연쇄상 구균 agalactiae, B 군 연쇄상 구균 (GBS)는 자주 장과 건강한 성인의 비뇨 기관에서 분리 된 캡슐, 그람 양성 세균이다. 1970 년대에, GBS는 매년 신생아 질환의 7,000의 경우 ^1, 감염성 신생아 사망의 주요 에이전트로 나타났다. 조기 발병 GBS 질환 (EOD)는 폐렴이나 호흡 곤란으로 발생하는 첫 번째 시간, 삶의 일에 발생하고, 종종 후기 발병 질환 (LOD) 반면, 패혈증으로 발전 몇 달 후에 계속된다 자주 균혈증과 선물 ² 뇌막염으로 진행한다. 2002 년 질병 통제 예방 센터 (CDC)는 GBS 양성 산모 ¹ 늦은 임신과 분만 예방 적 항생제 (IAP)에서 GBS 질 식민지에 대한 보편적 인 검사를 권장합니다. 매년 IAP로 인해 미국에서 약 1,000가지 경우에 조기 발병 질환의 감소에도 불구하고,GBS는 조기 발병 신생아 패혈증의 주요 원인 남아 있고, 후기 발병 발생 ¹ 영향을받지 남아있다. 자궁의 여부, 노동 동안, 또는 후기 발병의 경우, GBS에 신생아 노출 수막염, 높은 규제 혈액 -의 교차의 경우, 호스트 환경과 장벽, 면역 회피의 숫자를 통해 생존, 횡단이 필요하며, 뇌 ^장벽이. 신생아 내에서 이러한 악성 상호 작용의 상류는 산모의 질 기관의 초기 식민지입니다. GBS 질 식민지 비율이 12.7 ^{%, 4의} 추정 평균 속도, 선진국과 개발 도상국에서 8-18% 범위 임산부. 임신 중 질 기관의 GBS의 식민지 개별 여성 ⁵ 중 자연, 상수 간헐적 또는 일시적 일 수있다. 흥미롭게도, 모성 연령> 삼십육년은 지속적 식민지 ^(6)와 연결되어 있습니다. GBS 질 식민지에 대한 다양한 생물학적 및 사회 경제적 위험 요인확인되었습니다. 생물학적 요인 위장 GBS의 식민지와 장 내 유산균의 부재를 포함한다. 그러나, 인종, 비만, 위생, 성적 활동은 GBS 질 캐리지 ^(7)과 관련되어있다.

신생아 감염을 일으키는 악명이 있지만, GBS는 산모의 감염 모두 주 산기 및 산후의 다양한됩니다. GBS 캐리지도 질병 엔티티 ⁹ 일 수 있고, 어떤 경우에는 질염 ⁸ 제시 여성에서 증가된다. 또한, 임신 중 생식 기관의 GBS 적경은 내 양수 감염이나 융 모양 막염 ^(10)가 발생할 수 있습니다. 또한, 임신의 3.5 %까지로, GBS는 요로 감염이나 무증상 세균 ^(11)을 유발하는 방광에 배포한다. 임신 중 GBS의 세균이 분만 발열, 융 모양 막염, 조산 및 prematur의 위험 증가와 관련이막 ^(12)의 전자 파열. 함께 찍은, 질 기관 내에서 GBS의 존재는 여러 호스트 조직의 감염에 연결하고,이 틈새 시장에서 GBS를 제거 할 수있는 기능을 모두 산모와 신생아의 건강을 위해 필수적이다.

최근까지 자궁 경부 기관과 상호 작용 GBS 검사 작업의 대부분은 체외 세포 모델 ^13-15로 한정 하였다. 이러한 시험 관내 실험은 표면 단백질을 포함한 부착에 중요한 요인 세균을 밝혀냈다 같은 필리 세린 풍부 반복 ^{(17, 18),뿐만} 아니라 이성 조절 시스템 ^{(15, 19)과의} 질 상피 글로벌 전사 반응 GBS ^19. 그러나, 완전히 질 관 내의 호스트 미생물 작용을 해명하기 위해 강력한 동물 모델이 필요하다. 초기 작품은 GBS가 접종 된 마우스 ^{(20, 21)와} 쥐의 질 기관에서 복구 할 수 있다는 것을 보여 ^{모두 임신과 비 임신 상태에서 22. 2005 년 단기 GBS 질 집락은 24 시간 기간에 걸쳐 23 질 GBS 치료에 파지 용균 효소의 효능을 조사 생쥐에서 만들어졌다. 몇 년 후, 장기 GBS 질 식민지 마우스 모델은 GBS 지속성을 관리하는 호스트와 세균 요인을 연구하기 위해 개발되었다. 이 모델은 표면 부속 (17, 18)과 GBS 두 구성 요소 시스템 19,24 포함 정착에 기여 수많은 GBS 요인을 확인했다. 이 모델은 호스트 응답 메커니즘 19,25의 식별에 기여하고 면역 펩티드 26, 프로바이오틱스 (27) 등 여러 가지 치료 전략을 시험하기 위해 사용되었다. 이 프로토콜은 마우스 질 관 GBS로 접종하고이어서 정착을 추적하고 추가적인 분석을 위해 샘플을 수집하기 위해 필요한 지침을 제공한다.}

프로토콜

모든 동물의 작업은 샌디에고 주립 대학의 실험실 동물 관리 사무소의 승인을 받아 수의학 기준에 따라 실시 하였다. 암컷 마우스 연령 8-16주이 방법의 개발에 사용 하였다.

β-에스트라 디올의 1. 준비 및 복강 내 주사

1. 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용하고있는 동안 종이의 무게에 β-에스트라 디올 (0.5 밀리그램 / 마우스)를 밖으로 측정한다. 주의 :-β 에스트라 디올은 피부 및 점막 표면을 통해 흡수 될 수있다.
2. 모든 덩어리를 제거하고, β-에스트라 디올이 미세 분말 될 때까지 15 ML 원뿔 튜브와 소용돌이에 β-에스트라 디올을 전송합니다. 10 ML의 주사기에 참기름 (100 μL / 마우스)를 그립니다. 0.45 μm의 필터를 사용하여 β-에스트라 디올을 함유하는 15 ml의 원추형 튜브에 주사기 필터 참기름. β-에스트라 디올은 참기름에 균일 한 현탁액이 될 때까지 15 ML 원뿔 튜브를 소용돌이.
3. β-ES를 그리기새로운 10 ML의 주사기에 tradiol 서스펜션. 18 G, 1 인으로. 바늘, 나누어지는 1 ㎖의 투베르쿨린 주사기로 현탁액을 100 ㎕. 각 마우스에 대해 하나의 주사기를 준비합니다. 새로운 멸균 26 G, ½ 인을 배치합니다. 각 투베르쿨린 주사기 바늘.
4. 이전 세균 접종에 각 마우스 24 시간에 참기름 (5 ㎎ / ㎖) 100 ㎕에 현탁 β-에스트라 디올의 0.5 밀리그램을 관리 할 수 ​​있습니다. 바로 오른쪽에 하복부 사분면에서는 복강 내의 각 마우스를 주입하거나 이전 ²⁸ 바와 같이, 중간 선 왼쪽.
   주 : 주사 부위의 어떠한 청소 또는 클리핑이 필요하지 않습니다.

GBS 2. 질 접종

1. 어느 날 이전에 접종을, 37 ° C에서 토드 휴이트 국물 (THB)에서, 같은 A909 (혈청 형 IA)와 같은 관심의 GBS 균주의 5 ml의 하룻밤 액체 문화를 성장.
2. 신선한 THB로 1:10 볼륨에서 GBS 하룻밤 문화를 배양하고 37 ° C에서 품어. 성장미드 로그 상에 박테리아 (= 0.4-0.5 OD _600). 참고 : - GBS의 변형에 따라, 3 시간이 보통이 소요됩니다.
3. 5 분 동안 3,000 × g에서 멸균 15 ML 원뿔 튜브와 펠렛 박테리아에 하위 문화를 전송합니다. 뜨는을 대기음. 멸균 인산 완충 식염수 (PBS) 200 μL의 세균 펠렛을 재현 탁.
4. 새로운 5 ㎖의 배양 관에서 PBS 5 ㎖ (10 마우스 당 1 mL) 중 정확히 OD ₆₀₀ = 0.4 - 재현 탁 된 펠릿을 이용하여, 3을 가져온다. 이것은 ~ 1 × 10 ⁸ 콜로니 형성 단위 (CFU) / ml의 농도 될 것입니다. 새로운 15 ML 원뿔 튜브로 전송 5 분 동안 3,000 × g에서 박테리아를 재 - 펠렛. 뜨는을 대기음.
5. 1/10 원래 볼륨에서 PBS의 펠렛을 재현 탁. 예를 들어, OD = 0.4 _(600)의 3 ml의 펠릿 되었다면, PBS 300 μL 그것을 재현 탁. 주 :이 동물 접종에 사용되는 최종 세균 현탁액 (~ 1 × ¹⁰⁹ CFU / ㎖)이다.
6. 아르 자형직렬 희석 현탁액의 50 μl를 eserve과 THB 한천에 도금하는 것은 정확한 접종을 결정합니다.
7. 그 1 × ¹⁰⁷ CFU 각 마우스에 투여되도록 최종 세균 현탁액의 10 μl를 각 마우스를 접종한다.
   1. , 이전에 접종 ²⁸ 바와 같이, 핸들러의 엄지와 검지 후 꼬리를 고정화 사이 목 목덜미에서 느슨한 피부를 보호하여 수동으로 마우스를 억제.
   2. 200 ㎕를 겔로드 피펫 팁으로 단계 2.6에서 제조 된 GBS의 10 μL를 그립니다. 팁을 질 루멘에 5 ~ 10 mm를 삽입하고 접종의 10 μl를 분배.
      주 : 겔 로딩 팁 특히 어린이나 작은 마우스에서 장기 외상 또는 손상의 위험을 최소화하기 위해 표준 200 μL 팁 위에 바람직하다.
   3. 즉시 접종을 다음과 같은 꼬리와 w로 마우스를 올려, 목의 목덜미를 해제하고 마우스의 뒷다리 끝을 상승~ 1 분 동안 딱딱한 표면에 전면 발 alking.
   4. 시각 접종의 역류에 대한 질 입구를 검사합니다. 역류가 관찰되는 경우, 새로운 피펫 팁은 루멘 내로 역류의 흡수를 용이하게 조작하거나 질구를 확대하기 위해 사용될 수있다. 또한, 역류는 피펫을 통해 흡입 될 수 있으며, 재 접종.
      참고 : 국소 에이전트, 프로 바이오 틱 미생물, 또는 관심의 단백질을 투여하는 경우에는 생리적 버퍼 20 μl의 최대 볼륨은 질 기관에 제공 될 수있다.

3. GBS 부하를 정량화하기 위해 질 루멘을 보라고

1. PBS 100 ㎕를 첨가하여, 마우스 당 1.5 ㎖의 마이크로 원심 분리 튜브를 준비한다. 그냥 보라고하기 전에, PBS에서 면봉을 사전에 젖은.
2. 단계 2.7.1에서 설명한대로 마우스를 억제하고 질 루멘에 면봉을 10mm를 삽입합니다. 부드럽게 4 배를 시계 방향으로 면봉을 회전하고 4 시간은 질 벽에 약간의 압력을 적용, 시계 방향으로 대응.
3. PBS 100 ㎕로 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 면봉을 전송합니다. 도금에 앞서, 소용돌이 면봉에서 박테리아를 해제하기 15 초 ~에 대한 microcentrifuge 관. 직렬 1시 10분 1을 통해 각 PBS에서 샘플 판 희석 20 μl를 희석 : 10,000 제조업체의 지침에 따라 준비 차동 매체 아가 플레이트에. 24 시간 동안 37 ° C에서 접시를 품어. GBS 식민지 색상에 밝은 분홍색 또는 자주색를 나타납니다. 다른 내생 식물을 억제 할 것, 또는 파란색, 흰색, 회색 식민지로 표시됩니다.

4. 수집 질 세척 유체

1. 단계 2.7.1에서 설명한대로 마우스를 억제. 200 ㎕를 겔로드 피펫 팁, 피펫 질 루멘에 PBS의 20 μl를 사용. 부드럽게 루멘 내에서 전체 볼륨 위아래로 4 회 피펫, 다음 같은 피펫 팁의 전체 볼륨을 철회. 주 : 세척액이 점액 두꺼운 경우 표준 200 μL 피펫 팁최종 세정액을 수집하는데 사용될 수있다.
2. 사이토킨 분석 CFU 또는 정량 용 세정액을 저장하는 경우에 0.7 ml의 마이크로 원심 관에 분주. 발정기의 단계를 결정하는 경우, 유리 슬라이드 상에 세정액의 적어도 5 μL를 분배하고 광학 현미경에서 100 배의 배율 하에서 세포를 관찰한다. 참고 : 발정 단계의 예를 들어, 그림 1을 참조하십시오.

5. 조직의 해부 및 균질화

1. 각 마우스의 경우, 세 개의 2-ML 스크류 캡 튜브 (: 질, 자궁 경부, 자궁 각 조직에 대해 하나)을 준비합니다. 튜브의 원뿔 모양의 바닥을 커버 - (0.5 g 0.4) 1.0 mm 지르코니아 비드 충분한 각 튜브를 입력합니다.
2. 세균 부하를 정량화 특히 121 ° C에서 30 분 동안 조직을 수집하기 전에 준비된 튜브 압력솥. 각 튜브에 멸균 PBS 500 μl를 추가합니다. 복구 조직의 무게를 계산하기 위해 나중에 참조 할 수 있도록 고압 증기 멸균 기록 후 각 튜브의 무게.
3. 이러한 CO ₂ 질식 및 경추 탈구으로 승인 기관 방법을 사용하여 마우스를 희생한다. 70 % EtOH로 복부 복부를 스프레이. 멸균 가위,의 복부 캐비티를 열고 다시 피부와 복부 근육을 들어 올린 생식 기관이 노출되도록 내장을 대체.
4. 70 % EtOH로 가위를 소독 필요한 경우 깨끗이 닦아, 두 자궁 뿔 자궁 몸과 난소 사이의 중간 길이를 잘라. 가위와 집게, 별도의 내장 지방, 멤브레인, 멀리 생식 기관에서 방광을 사용하여, 꼬리 쪽 이동.
5. 단계 5.4에 설명 된대로 가위를 소독. 횡 방향으로 몸에서 생식 기관을 분리 가능한 외음부에 가깝게 질을 잘라. 들어 올려 그대로 생식 기관을 제거하고 멸균 페트리 접시에 넣습니다.
6. 새 면도날을 사용하여, 하나의 가로 절단에 자궁 경부에서 자궁을 분리합니다. 70 %로 면도날 소독다음의 EtOH, 그리고 하나의 가로 컷의 질에서 자궁 경부를 구분합니다. 참고 : 아직 자궁 경부에 연결된 자궁 조직의 최소한있을 것이다. 아직 자궁 경부에 부착 된 질 조직의 최소한있을 것이다.
7. 무균 핀셋을 사용하여, 각각의 2 ㎖의 튜브를 함유하는 PBS와 구슬 균질화로 각 조직 옮긴다. 각 조직을 처리하는 사이에 70 % EtOH로 집게를 청소합니다.
8. 각각 2 ㎖의 스크류 캡 튜브의 무게를 측정하고, 조직의 무게를 결정하기 위해 관의 원래 중량을 뺀다. 100 mg의 - 조직의 무게는 일반적으로 20 사이를 다릅니다. 단단히 스크류 캡 튜브를 밀봉하고 조직 균질 기에서 최대 속도에서 1 분 동안 조직을 균질화.
9. 10,000 차동 매체 아가 플레이트에 : 세균 부하를 정량화하기 위해 직렬로 조직 균질 및 플레이트 희석 1시 10분 1을 통해 25 μl를 희석. 단계 3.3에 설명 된대로 번호판을 품어. 에서 조직 균질 동결, 사이토 카인의 정량 샘플을 저장하려면 -20 ° C.

결과

이 모델의 개발 과정에서 여러 관찰 GBS 질 정착 기간에 영향을주는 요인에 관한 하였다. 접종에 미치는 영향 GBS 세균의 지속성에 얼마나 발정 단계를 결정하려면, 마우스는 질 세척 유체를 통해 접종의 날에 개최되었다. 도 1에 의해 결정된대로 마우스 발정주기의 네 단계를 도시 습식 마운트 질 세정액, 잘 확립 된 방법 ^(29). 마우스는 초기 단계에 기초하여 그룹으로 분할하고, GBS 지속성 질 보라고 통해 시간 동안 모니터링 하였다. 발정 단계에서 접종 한 마우스는 발정의 다른 단계, 접종 시간 (그림 2)에서 diestrus에서 특히보다 더 GBS와 식민지가되었다. 이러한 결과에 기초하여, 현재의 모델에서, 마우스는 발정 단계로 동기화하기 전날 GBS로 접종-β 에스트라 디올로 처리된다.

생식 요로 감염의 다른 쥐 모델은 마우스가 외생 에스트라 디올 처리 ^{(30, ...}

토론

호스트의 컨텍스트 내의 호스트 및 다른 미생물 모두 GBS 상호 작용의 이해의 발전을 촉진하기 위해 동물 모델이 요구된다. 이 작품은 생쥐에서 GBS 질 식민지를 확립의 기술적 측면에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 박테리아를 접종하거나 접종을 두껍게, 질 미리 세척, 또는 첨가제 식민지 수 있도록 면봉 샘플, 면역 억제제를 수집하기 위해 마취제를 사용하지 않고 마우스의> 90 % 식민지를 달성한다. 또한,이 모델은 GBS 지속성의 길이와 세균 부담이 모두 겸손 간 실험적인 변화와 강력한 재현성을 보여줍니다. 이 연구에서 입증 대표 결과는 독립적 인 실험의 컴파일하고 미래의 실험 설계에 대한 참조해야한다; 그러나 GBS 균주 및 마우스 선에 걸쳐 직접 비교주의해야한다.

이 모델은 인간의 colonizati을 모방쥐의 점막 질 GBS의 식민지에서의 생식 기관에 제한 될 것으로 보인다. 자궁 경부와 자궁에 승천 여러 GBS ²⁵ 균주 관찰되었지만, 마우스...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
참기름	시그마 알드리치	S3547-250ML
&베타;-에스트라디올	시그마 알드리치	E8875-1G	주의: 적절한 개인보호구를 착용하십시오. &베타;-에스트라디올은 피부와 점막 표면을 통해 흡수될 수 있습니다.
200 &뮤; L 젤 로딩 피펫 팁	USA Scientific	1252-0610
요도 생식기, 멸균, 칼슘 알긴산 면봉	Puritan	25-801 A 50
CHROMagar StrepB	DRG International	SB282
Todd Hewitt Broth	Hardy Diagnostics	7161C
18 G, 1.5 인치 바늘	BD	305199
26 G, 0.5 인치 바늘	BD	305111
10 ml 주사기	BD	309604
1 ml 주사기	BD	309659
0.45 μ m PVDF 주사기 필터	Whatman	6900-2504
Dulbecco의 인산염 완충 염 용액 1x	Corning	21-031-CV