자가 면역 대해 줄기 세포 유래의 항원 특이 적 조절 T 세포의 발달

요약

여기서는 쥐 모델에서 자가면역 관절염의 면역 요법을 위해 유도 만능 줄기 세포(iPSC)에서 기능적 항원(Ag) 특이적 조절 T 세포(Tregs)를 개발하는 방법을 제시합니다.

초록

자가 면역 질환으로 인해 면역 자기 관용의 손실이 발생한다. 규제 T 세포 (Tregs)는 면역 자기 관용의 중요한 매개체이다. 말초 혈액 순환 그 Tregs 2 % - 1과, 마우스 및 인간 성숙 CD4 ⁺ T 세포 개체군의 10 % - 약 5 Tregs를 나타낸다. 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)은 전위가자가 면역 질환의 세포 기반 치료에 사용할 수있는 기능 Tregs로 분화 될 수있다. 여기서는 iPSCs에서 항원은 (Ag) 특이 Tregs (즉, IPSC-Tregs)를 개발하기위한 방법을 제시한다. 상기 방법은 iPSCs으로 전사 인자 Foxp3의 및 AG-특정한 T 세포 수용체 (TCR)를 포함하고 노치 발현 OP9 간질 세포 분화에 기초하여 델타 형 (DL) 1 DL4 리간드. 체외 분화 후, IPSC-Tregs는 CD4, CD8, CD3, CD25, Foxp3를하고, AG-특정 TCR을 표현하고의 Ag 자극에 응답 할 수 있습니다.이 방법은 성공적 뮤린 모델에서자가 면역 관절염 세포 기반 치료에 적용되고있다. AG-유도 관절염 (AIA) -bearing 마우스로 이러한 AG-특정 IPSC - Tregs의 입양 전송은 관절 염증을 감소하고 붓기와 뼈 손실을 방지 할 수있는 능력을 가지고 있습니다.

서론

자가면역 관절염은 활막 조직의 증식과 관절 연골, 뼈 및 인대의 점진적인 파괴를 특징으로 하는 전신 질환입니다¹. 자가면역 관절염에서 Tregs의 결함 생성 또는 기능은 Tregs가 자가 반응성 면역 세포의 발달을 예방하는 데 중요한 역할을 하기 때문에 만성 염증 및 조직 손상에 기여합니다.

Tregs의 조작은 Ag 의존적 방식으로 염증을 억제하는 치료법 개발에 이상적인 전략입니다. Treg 기반 면역요법의 경우, 전달된 Tregs의 특이성은 진행 중인 자가면역²의 치료에 중요합니다. 억제 활성을 나타내기 위해, Tregs는 영향을 받은 부위에서 이동하고 유지되어야 하며, 이는 해당 위치에서 Ag에 대한 TCR의 특이성에 의해 지시될 수 있습니다³. 다클론 Treg는 TCR에서 이러한 Ag 특이성을 포함하는 작은 집단을 포함할 수 있지만 이러한 Ag 특이적 Tregs의 수는 일반적으로 낮습니다. 결과적으로, 자가면역 질환에 대한 다클론 Tregs를 사용하는 세포 기반 치료법은 많은 수의 Treg의 채택 전달을 필요로 합니다^4,5. 만능줄기세포(PSC)는 모든 유형의 세포로 발달할 수 있는 능력이 있기 때문에 Ag 특이적 PSC-Tregs는 Treg 기반 면역요법에....

프로토콜

모든 동물 실험은 의학 동물 관리위원회의 펜실베니아 주립 대학 (IACUC 프로토콜 # 45470)에 의해 승인 및 실험 동물 관리의 평가 및 인증을위한 협회의 가이드 라인을 준수하여 실시하고 있습니다.

1. 줄기 세포 배양

1. 코트하기 위해서는 37 ° C (인큐베이터)에서 최소 30 분 동안 0.1 % 젤라틴 10 ml의 플레이트와 10cm 접시를 품어.
2. 접시와 접시 3 × ^106에서 젤라틴 제거는 SNL76 / 7 세포를 조사, 10 % DMEM 배지 (10 % FBS와 1 % 페니실린 스트렙토 마이신)를 사용하여 37 ° C (인큐베이터)에서 하루 동안 배양한다.
3. IPSC 매체를 사용 SNL76 / 7 세포 공급기 층 위에 접시와 배양 해동 iPSCs에서 용지를 제거 (15 % 소 태아 혈청, 0.1 밀리몰 / L 비 필수 아미노산, 1 밀리몰 / L L- 글루타민을 함유하는 DMEM 배지 및 0.1 밀리몰 / L의 β-머 캅토 에탄올) ^9. 마우스 만능 줄기-MEF-잉-20D-17 셀 리튬Oct3 / 4, Sox2이, Klf4 및 c-Myc와 레트로 바이러스 형질 전환에 의한 마우스 배아 섬유 아 세포에서 유도 된, 네브라스카, 박사 신야 ....

결과

28 일에, 다음과 같이),은 (Ag 특정 Tregs는 실질적으로 CD3과 AG-특정 TCR,이 T 세포 마커를 표명했다. CD3 ⁺ TCRVβ5 ^{+ 인구는} CD4를 표명했다. 일반적으로 자연적으로 T의 _REGS (nTregs)를 발생 및 ectopically Foxp3를 표현 T 세포에서 높은 수준으로 발현된다 또한 CD25, CD127, 및 CTLA-4를 표현 CD3 ⁺ TCRVβ5 ⁺ CD4 ⁺ 세포의 대부분. 유동 세포 계측법 (도 1)에 의해 분석하여 세포 내 염색으로 검출되는 IPSC 유래 세포 Foxp3를 발현 노치 리간드 관내 자극 후에도 장기간 지속되었다. IPSC-Tregs 잠재적 억제 활동했다 나타내는 AG-펄스 비장 세포 (도 2)와 함께 생체 외에.......

토론

이 프로토콜에서 중요한 단계는 TCR / Foxp3의 유전자 형질 iPSCs의 체외 분화된다. 시험관 노치 신호는 T 세포 계통으로의 개발을 유도한다. CD4 ⁺ Foxp3의 ⁺ Tregs에 iPSCs를 구별하기 위해, 우리는 OP9-DL1 / DL4 / IA의 ^B 세포, 매우 빠른 MHC II (IA ^나) 분자를 사용했다. iPSCs 대부분은 CD4 ⁺ 세포로 분화. 그러나, 표면 TCR 발현 후 많은 분화 이전 T 세포 분화 결국 죽게 할 수있는 능력을 잃는다. 그 결과, IPSC 유래 기능성 Tregs의 셀 수가 대폭 체외 분화 4 주 후에 감소시킨다. 이를 방지하기 위해, IL-2의 첨가는 그 시점에서 세포 생존을 향상시킬 수있다. 다른 방법은 마우스에 주 동안 시험 관내에서 분화 한 프리 Tregs을 전송 AG-특정 사전 Tregs의 성숙 및 생존을 구동하도.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
C57BL/6j 마우스	Jackson Laboratory	664
B6.129S7 Rag1tm1Mom/J	Jackson Laboratory	2216
Anti-CD3 (2C11) 항체	BD Pharmingen	553058
Anti-CD28 (37.51) 항체	BD Pharmingen	553295
Anti-CD4 (GK1.5) 항체	Biolegend	100417
Anti-CD8 ( 53– 6.7) 항체	Biolegend	100714
Anti-CD25 (3C7) 항체	Biolegend	101912
Anti-TCR-β (H57597) 항체	Biolegend	109220
Anti-IL10	Biolegend	505010
Anti-TGFβ	Biolegend	141402
DMEM	Invitrogen	ABCD1234
α-MEM	Invitrogen	A10490-01
FBS	Hyclone	SH3007.01
Brefeldin A	Sigma	B7651
Polybrene	Sigma	107689
Genejammer	Integrated science	204130
ACK 용해 완충액	Lonza	10-548E
mFlt-3L	peprotech	250-31L
mIL-7	peprotech	217-17
젤라틴	시그마	G9391
파라포름알데히드	시그마	P6148-500G	주의: 알레르기성, 발암성, 독성
투과화 완충액	Biolegend
mBSA	시그마	A7906
OVA 알부민	Avantor	0440-01
CFA	Difco	2017014
Tailveiner 억제	Braintree Scientific	RTV 150-STD

421002기