자가 면역 대해 줄기 세포 유래의 항원 특이 적 조절 T 세포의 발달

요약

여기서는 쥐 모델에서 자가면역 관절염의 면역 요법을 위해 유도 만능 줄기 세포(iPSC)에서 기능적 항원(Ag) 특이적 조절 T 세포(Tregs)를 개발하는 방법을 제시합니다.

초록

자가 면역 질환으로 인해 면역 자기 관용의 손실이 발생한다. 규제 T 세포 (Tregs)는 면역 자기 관용의 중요한 매개체이다. 말초 혈액 순환 그 Tregs 2 % - 1과, 마우스 및 인간 성숙 CD4 ⁺ T 세포 개체군의 10 % - 약 5 Tregs를 나타낸다. 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)은 전위가자가 면역 질환의 세포 기반 치료에 사용할 수있는 기능 Tregs로 분화 될 수있다. 여기서는 iPSCs에서 항원은 (Ag) 특이 Tregs (즉, IPSC-Tregs)를 개발하기위한 방법을 제시한다. 상기 방법은 iPSCs으로 전사 인자 Foxp3의 및 AG-특정한 T 세포 수용체 (TCR)를 포함하고 노치 발현 OP9 간질 세포 분화에 기초하여 델타 형 (DL) 1 DL4 리간드. 체외 분화 후, IPSC-Tregs는 CD4, CD8, CD3, CD25, Foxp3를하고, AG-특정 TCR을 표현하고의 Ag 자극에 응답 할 수 있습니다.이 방법은 성공적 뮤린 모델에서자가 면역 관절염 세포 기반 치료에 적용되고있다. AG-유도 관절염 (AIA) -bearing 마우스로 이러한 AG-특정 IPSC - Tregs의 입양 전송은 관절 염증을 감소하고 붓기와 뼈 손실을 방지 할 수있는 능력을 가지고 있습니다.

서론

자가면역 관절염은 활막 조직의 증식과 관절 연골, 뼈 및 인대의 점진적인 파괴를 특징으로 하는 전신 질환입니다¹. 자가면역 관절염에서 Tregs의 결함 생성 또는 기능은 Tregs가 자가 반응성 면역 세포의 발달을 예방하는 데 중요한 역할을 하기 때문에 만성 염증 및 조직 손상에 기여합니다.

Tregs의 조작은 Ag 의존적 방식으로 염증을 억제하는 치료법 개발에 이상적인 전략입니다. Treg 기반 면역요법의 경우, 전달된 Tregs의 특이성은 진행 중인 자가면역²의 치료에 중요합니다. 억제 활성을 나타내기 위해, Tregs는 영향을 받은 부위에서 이동하고 유지되어야 하며, 이는 해당 위치에서 Ag에 대한 TCR의 특이성에 의해 지시될 수 있습니다³. 다클론 Treg는 TCR에서 이러한 Ag 특이성을 포함하는 작은 집단을 포함할 수 있지만 이러한 Ag 특이적 Tregs의 수는 일반적으로 낮습니다. 결과적으로, 자가면역 질환에 대한 다클론 Tregs를 사용하는 세포 기반 치료법은 많은 수의 Treg의 채택 전달을 필요로 합니다^4,5. 만능줄기세포(PSC)는 모든 유형의 세포로 발달할 수 있는 능력이 있기 때문에 Ag 특이적 PSC-Tregs는 Treg 기반 면역요법에 적합한 후보가 될 수 있습니다. 이전 연구에서는 Tregs^6-8을 포함한 PSC 유래 T 세포의 성공적인 발달을 보여주었습니다.

여기에서는 Ag 특이적 iPSC-Tregs를 개발하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 우리는 또한 이러한 Tregs를 사용하여 쥐 모델에서 자가면역 관절염의 세포 기반 요법을 설명합니다. 이 방법은 Ag 특이적 TCR과 전사 인자 FoxP3를 가진 유전적으로 변형된 쥐 iPSC를 기반으로 합니다. 그런 다음 엔지니어링된 iPSC는 사이토카인 mFlt3L 및 mIL-7의 존재 하에서 Notch ligands DL1, DL4 및 MHC-II(I-A^b) 분자를 발현하는 OP9 기질 세포에서 Ag 특이적 Tregs로 분화합니다. 이러한 Ag 특이적 iPSC-Tregs는 Ag로 자극될 때 TGF-β 및 IL-10과 같은 억제성 사이토카인을 생성할 수 있으며, 이러한 Tregs의 채택 전달은 쥐 모델에서 AIA 발달을 억제할 수 있습니다. 설명된 프로토콜은 잠재적인 치료 개입을 위한 줄기세포 유래 Ag 특이적 Tregs를 개발하는 데 사용할 수 있습니다.

프로토콜

모든 동물 실험은 의학 동물 관리위원회의 펜실베니아 주립 대학 (IACUC 프로토콜 # 45470)에 의해 승인 및 실험 동물 관리의 평가 및 인증을위한 협회의 가이드 라인을 준수하여 실시하고 있습니다.

1. 줄기 세포 배양

1. 코트하기 위해서는 37 ° C (인큐베이터)에서 최소 30 분 동안 0.1 % 젤라틴 10 ml의 플레이트와 10cm 접시를 품어.
2. 접시와 접시 3 × ^106에서 젤라틴 제거는 SNL76 / 7 세포를 조사, 10 % DMEM 배지 (10 % FBS와 1 % 페니실린 스트렙토 마이신)를 사용하여 37 ° C (인큐베이터)에서 하루 동안 배양한다.
3. IPSC 매체를 사용 SNL76 / 7 세포 공급기 층 위에 접시와 배양 해동 iPSCs에서 용지를 제거 (15 % 소 태아 혈청, 0.1 밀리몰 / L 비 필수 아미노산, 1 밀리몰 / L L- 글루타민을 함유하는 DMEM 배지 및 0.1 밀리몰 / L의 β-머 캅토 에탄올) ^9. 마우스 만능 줄기-MEF-잉-20D-17 셀 리튬Oct3 / 4, Sox2이, Klf4 및 c-Myc와 레트로 바이러스 형질 전환에 의한 마우스 배아 섬유 아 세포에서 유도 된, 네브라스카, 박사 신야 야마나카 (프론티어 의료 과학 연구소, 교토 대학, 교토, 일본)로부터 얻은 것입니다.
4. 신선한 미디어와 함께 3 일에 미디어를 변경하고 현미경으로 IPSC의 식민지를 관찰합니다.
   참고 :이 식민지가 작고, 반짝 클러스터 또는 형광 현미경으로 GFP 발현을 보여주는 명확한 경계 라운드 세포이다.

AG-특정 IPSC - Tregs의 체외 분화 2.

1. 구조를 생성하는 MiDR-TCRα-2A-TCRβ-2A-Foxp3의 구조를 만들기 위해 자기 절단 펩티드 (2A)와 연결된 MiDR 플라스미드 ^(10)에 서브 클로닝 OT-II TCR 유전자 및 Foxp3를하여 레트로 바이러스 전달에 사용되는.
2. 패키징 세포주로서 플랫 E 세포를 사용 iPSCs의 레트로 바이러스 형질 도입 ^구를 수행한다.
3. 일 0, 종자 OP9-DL1-DL4-IA의 ^B 세포20 % FCS 및 2.2 g / L 탄산 수소 나트륨. 접시 10 cm 접시에 1 × ¹⁰⁶ 세포를 포함하는 OP-9 매체 (α-MEM 배지를 사용하여 ¹⁰⁴ 세포 / ^㎠의 TA 최소 밀도.
4. OP9-DL1-DL4-IA의 ^B 세포가 80-90% 합류 될 경우 3 일에서 미디어를 제거하고 0.5 시드 - OP9-DL1-DL4를 통해 1 × 10 ⁵ iPSCs를 - IA의 ^B 세포를 OP-9 미디어.
   주 :이 OP9-DL1-DL4-IA의 ^B 세포에 iPSCs의 공 배양을 설정하고 분화 ⁹ 일 0으로 간주된다.
5. 5 일에, 흡인에 의해 10cm 접시에서 미디어를 제거 1X PBS 10 ml의 세포를 세척하고, PBS를 대기음. 0.25 % 트립신의 4 ML을 추가하고 10 분 동안 37 ° C에서 품어. 실온에서 5 분 동안 400 XG에서 세포에 IPSC 매체의 또 다른 8 mL로 추가을 다시 중지하고, 원심 분리기.
   1. 기음 뜨는 및 IPSC 미디어 10ml에 세포를 재 - 일시 중지합니다. 신선한 10cm 접시에이 다시 중단 세포를 품어30 분 동안 인큐베이터로 돌아갑니다.
      참고 : OP9-DL1-DL4-IA ^{나 피더} 세포를 제거하고 미디어에 떠있는 차별화 된 iPSCs를 유지합니다. 또한 공동 문화에 대한 90 % 컨 플루 - 유지 OP9-DL1-DL4-IA의 ^B 세포는 지속적으로 80을 달성했다.
   2. 30 분 후, 부유 세포를 수집하고 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 필터링하고, 혈구 세포 계산.
6. OP9 매체에 OP9-DL1-DL4-IA의 ^B 세포의 90 % 합류 - 새로운 80 씨 iPSCs의 5 × 10 ^5. 5 NG / ㎖의 최종 농도 mFlt-3L로 미디어를 보완.
7. 하루 8 일, 10 ML의 피펫을 사용하여 요리 자체에서 미디어 접시를 세척하여 부분적으로 차별화 된 iPSCs를 수집합니다. 접시의 하단에있는 OP9 단일 층을 파괴하지 않도록 조심스럽게주의, 강력한 피펫 팅에 의해 반 부착 세포를 씻어 접시에 OP-9 미디어의 또 다른 5 mL를 사용합니다. 모든 세미 광고를 수확 PBS 10 mL로 세척을 반복내재 세포를 분화.
   1. 실온에서 5 분 동안 400 XG 모두에서 세척, 원심 수확기, mFlt-3L (5 NG / ㎖), MIL-7 (1 NG / ㎖)를 함유 OP9 배지 10ml에 다시가 탁하고 (70)를 통해 필터링 μm의 셀 스트레이너.
8. 단계 1.1에서와 같이, 전지 ^b를 90 % 합류 OP9-DL1-DL4-IA - (80)를 포함하는 6 웰 배양 접시에 세포를 옮긴다. 전송 세포는 6- 웰 플레이트의 한 웰에 하나 10cm 접시에서 수확.
9. 10 일에, mFlt-3L (5 NG / ㎖) 및 MIL-7 (1 NG / ml)로 보충 신선한 OP9 미디어에 세포에서 미디어의 변화 절반. 이틀이 단계를 반복합니다.
10. 모든 4~6일, 성장에 따라 다시 씨앗 단계 1.1에 설명 된대로 OP9-DL1-DL4-IA의 ^B 세포의 새로운 층 플레이트 상에 차별화 된 iPSCs.

체외 TREG 분화 및 성숙 3. 평가

1. 차별화 된 iPSCs의 형태 학적 변화.
   1. 모nitor 일상 종래 시야 현미경 (20X) 하에서 살아있는 세포를 관찰하여 OP9-DL1-DL4-IA의 ^{B 세포} iPSCs의 공동 배양. 5 일까지, 같은 편평 세포와 같은 중배엽과 같은 특성을 가진 식민지를 관찰합니다. 8 일째으로 분화 세포를 표현 세포의 작고 둥근 클러스터를 관찰합니다.
   2. 생균 수 및 비율을 감지하는 세포를 카운트 트립 판 블루 배제 법을 사용한다. 혈구에있는 4 개의 그리드 내의 셀의 총 개수로 나누어 생존 세포의 수로 세포 생존율을 계산한다. 세포는 트리 판 블루를 가지고가는 경우에, 그들이 죽은 또는 비 실행 가능한 고려한다. 배양 물로부터 수확 된 살아있는 세포의 수를 기록한다.
2. iPSCs 차별화의 분석 유동 세포 계측법.
   1. 일 5, 7, 11, 15, 19, 21, 및 공 배양 28, 단계 25에서와 같이 0.25 % 트립신으로 세포를 제거한다.
   2. 상이한 형광 색소 공역 항체 표면 얼룩에 앞서 incubat즉 20 분 동안 4 ℃에서 PBS (최종 농도 10 μg의 / ml)에 희석 된 Fc 차단제 2.4G2 100 ㎕로 1 × ¹⁰⁶ 세포는 세포 표면상의 Fc 수용체에 대한 항체의 결합을 방지한다.
   3. 일 5, 7, 11, 15, 19, 21 및 28, CD3, TCRβ, CD4, CD8, CD25을 포함하여 세포 표면 마커를 검출하기 위해 상이한 형광 색소 공역 항체 유세포 1 × ¹⁰⁶ 세포를 사용하여, 및 CTLA4.
   4. 의 Fc 블록에 이어, 4 ° C에서 20 분 동안 서로 다른 형광 색소 - 복합 항체와 10 PBS ㎖의 얼룩 세포를 세척하고 흐름 cytometer 15 색으로 유세포 분석을 수행합니다. PBS 100 ㎕에 희석 10 ⁶ 세포 당 항체의 0.200 μg의를 사용합니다.
   5. 날 28 일, CD4 및 CD8 형광 색소 - 복합 염색법을 사용하여 CD4 ⁺ CD8 ⁺ 세포에 ¹¹ 유동 세포 계측법 및 게이트에 의해 세포를 분석; TCRVα2, TCRVβ5, CD25, CTLA의 발현에 대한 분석-4 및 Foxp3의 (도 1). Foxp3의 염색의 경우, 세포를 해결하고이를 permealize 후 항체 염색 ^{(11)을 수행합니다.}
3. iPSCs의 시험 관내 항원 자극합니다.
   1. 부동 세포를 수집하여 문화 공동 문화, 수확 IPSC - Tregs의 날 28 일. (단계 250에서와 같이), 0.25 % 트립신으로 세포의 나머지를 Trypsinize IPSC 및 배지 8 ㎖에 세포를 다시 일시. 실온에서 400 × g으로 5 분간 원심 미디어 10ml에 세포를 일시 중지 다시 다시 매체를 흡인하고.
      1. 30 분 동안 37 ° C에서 새로운 10cm 접시에 재 현탁 세포를 부화 부유 세포를 수집한다. 차가운 PBS로 세포를 씻으십시오.
   2. 96 웰 플레이트 ^(11)에 30 분 동안 4 ° C에서 미디어 200 μL 5 μM의 오브 알부민 펩타이드와 마우스 (OVA _323-339) - / - C57BL / 6 Rag1의 비장에서 3 × 10 ⁶ 비장 세포를 품어.
   3. OVA _323-339로 Tregs 믹스 -pulsed 1에서 비장 : 4의 비율은 (0.75 × ¹⁰⁶ Tregs 사용). 40 시간에 대한 CO ₂ 배양기에서 37 ° C에서 품어. 마지막 4 시간에서, 문화 (1 배 배양 배지에 희석 실제 농도의 1000 배)로 희석 Brefeldin (A)의 4 μl를 추가합니다.
   4. (단계 2.5에서와 같이) 0.25 % 트립신과 수확 세포는 희석 (최종 농도 10 μg의 / ㎖)의 Fc 차단 2.4G2, 얼룩 100 ㎕와 10 % NaN이 ₃ 0.5 M EDTA 용액 (FACS 버퍼), 블록과 세척 단계 3.2.3-3.2.4에서와 같이 표면 마커, CD4, CD8, TCRVα2 및 TCRVβ5합니다.
   5. PBS 중의 4 % 파라 포름 알데히드 용액으로 세포를 고정시키고 세포 표면 염색 이후 1 배 permeabilization 완충액 100 ㎕로 Permeabilize 하시려면.주의! 파라 포름 알데히드, 알러지 발암 성 및 독성이다.
   6. Fluorochrome과 접합 된 TGF-β와 IL-10 어둠 속에서 20 분으로 세포를 얼룩. 항체의 0.200 μg의 / 10 ⁶ 세포를 사용 dilutPBS 100 ㎕의 에디션. 15 색상 흐름 세포 계수기 (그림 2)와 TGF-β와 IL-10의 세포 내 생산을 감지합니다.
   7. 흐름 세포 측정 분석 ⁽¹¹⁾ 이전에 차가운 FACS 완충액으로 세포를 세 번 씻는다.
4. AG-특정 IPSC - Tregs의 생체 내 지속성합니다.
   1. OP9-DL1-DL4-IA의 ^B 세포에 공동 문화 8 일 후, 전송 IPSC 파생 사전 Tregs 비아 단계주의 1.1 congenic 마우스로 3.3.1 (4~6주 이전)에서와 같이 (Thy1.2) 마취없이 꼬리 정맥 주입입니다. 꼬리 정맥 주사를 수행하기 전에, 5 분 동안 적외선 램프를 이용하여 정 맥 꼬리를 팽창. 꼬리 정맥 팽창 후, 제한 수단의 마우스와 적응 적 전송 꼬리 정맥을 통해 주입하여 PBS 200 μL에 재현 탁 3 × 10 ⁶ 세포를 배치합니다.
   2. 6 주 TREG 전송 한 후, 자궁 경부 전위 다음 CO ₂ 질식하여 쥐를 안락사. 마일 있는지 확인CE 마크는 호흡되지 않습니다. 복강 안감 내부 피부 노출을 뒤로 당겨 조심스럽게 가위와 집게를 사용하여 복막의 외피를 절단하여 복강을 엽니 다. 비장과 주입 네 1.1 congenic 마우스의 주변 림프절을 분리합니다.
   3. 단일 세포 현탁액을 수득 기계 브레이크를 사용하는 비장 및 림프절로부터 세포를 수집한다. 적혈구를 용해시키기 위해 RT에서 5 분 동안 ACK 용해 완충액 5 ㎖로 세포를 인큐베이션. 수집하고 차가운 FACS 완충액 10 ㎖로 나머지 비장 세포 또는 림프구를 씻는다.
   4. 세척 후, 희석 형광 색소 - 복합 안티 네 1.2 항체 100 ㎕와 단계 3.2.2 및 얼룩과 20 분 동안 4 ° C에서의 Fc 차단 2.4G2와 세포를 치료.
   5. FACS 완충액 10 ㎖로 세포를 씻어 및 세포 계측 분석 ¹¹ 흘러 진행합니다.

자가 면역 관절염의 생체 내 성숙 4. 및 억제

1. 단계 2.1에서와 같이 구조를 생성합니다.
2. 단계 2.2에서와 같이 레트로 바이러스 전달 ^{구를 수행합니다.}
3. 생체 내 분화와 생쥐에서 관절염 유도합니다.
   1. OT-II TCR / Foxp3를 형질 도입 iPSCs (OT-II-Foxp3의 / iPSCs)을 차별화 사이토킨 mFlt-3L의 존재 OP9-DL1-DL4-IA ^{B 간질} 세포 Foxp3를 형질 도입 iPSCs하고을 DsRed 형질 iPSCs 및 2.6 - MIL-7 8 일간은 단계 2.1에 설명 된대로.
   2. Trypisinize 10 센티미터 접시에서 세포의 모든 삼가지 신선한 미디어 10ml에 각각 10cm 접시에서 세포를 재 - 일시 중지합니다. 신선한 10cm 접시에 세포를 추가하고 30 분 동안 인큐베이터로 돌아갑니다. 30 분 후, 세포를 부유 모은다.
   3. 세포 클러스터를 제거하고 혈구를 사용하여 계산하는 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포를 전달합니다. 차가운 PBS에 1.5 × ¹⁰⁷ 세포 / ml의 농도로 세포를 조절하고 필요한 경우 다시 필터. 마우스로 입양 셀 전송 될 때까지 얼음 세포를 유지합니다.
   4. 3.4.1에 설명 된 바와 같이 꼬리 정맥을 통해 6 주령의 암컷 C57BL / 6 마우스 - (4)의 세 개의 다른 그룹으로 세포 현탁액 200 μL (3 × ¹⁰⁶ 세포)을 주사
   5. 셀 전송 후 10 일에서 MBSA의 μg의는 1 ML의 주사기를 사용하여 꼬리의 기지에서 프로 인트 완전 보조제에 유화 (100)와 마우스를 주입.
   6. 날 17 일, 이소 플루 란 기화기 (IACUC 지침에 따라)를 사용하여 마우스를 마취. 유도 5 % 이소 플루 란 1 - - 유지 보수를 위해 2 % (4)를 활용합니다. 오른쪽 무릎 관절에 10 μl의 PBS에서 20 μg의 MBSA 100 μg의 전체 OVA 공동 왼쪽 무릎에 그리고 10 μl의 PBS에서 20 μg의 MBSA의 관절 내 주입에 의한 관절염을 유도한다. 관절염은 개발 후 음식과 gelpack은 침구 바닥에 배치 할 수 있습니다. 2/5이나 죽어가는 심각한 악액질 및 / 또는 영구 드러 누움 (24 시간주기)의 몸 상태 점수 (BCS), 및 심각도 점수에서 4 점수 : 마우스는 안락사됩니다4, 홍반, 심한 붓기 발목, 발과 숫자, 또는 사지의 ankyloses을 포함한다.
4. 구약-II TCR / Foxp3를 형질 도입 iPSCs의 특성.
   1. 고정되지 않은 라이브을 DsRed ⁺ GFP ⁺ 세포를 시각화하기 위해 형광 현미경 (20X)를 사용합니다.
   2. 모두 웨스턴 블롯에 의한 유전자 통합 및 표현을 검사하고 ¹¹ 유동 세포 계측법.
5. TREG 발달 및 성숙.
   1. 주 2, 4, 6 셀에서 전송 한 후, 마우스를 안락사. 첫 번째 단계에서 CO _2의 2 L - 안락사의 경우, 각 장에 1을 사용합니다. / 분 5 L - 동물 의식을 잃은 후에 4 CO _(2)의 유량을 증가시킨다. CO ₂ 흡입하여 쥐를 안락사. 비장을 분리하여 복강을 긋고 내 피부 노출을 뒤로 당겨 조심스럽게 가위와 집게를 사용하여 복막의 외피를 절단하여 림프절을 배출.
   2. 단일 세포 현탁액 f를 수집롬 셀 스트레이너 1 % IPSC 미디어의 1 ML의 주사기를 사용하여 기계적 고장에 의한 비장과 림프절. 5 분 동안 400g의 매체를 함유하는 원뿔형 튜브를 원심 분리기. 적혈구를 용해시키기 위해 ACK 용해 완충액 5 ml의 세포 펠렛을 다시 일시. 다시 원심 분리기 5 분 동안 1,000 rpm에서. 세포 펠렛을 다시 중단하고 차가운 FACS 버퍼에 남아있는 비장 세포 또는 림프구를 씻는다. 단계 3.4.4에 따라 - 3.4.5 및 세포 계측 분석 흐름 진행합니다.
6. 세포 내 염색.
   1. 하루 50 후 도전, 비장을 분리하고 CO에 의해 euthanization 후 (단계 4.5.1에서와 같이) 자궁 경부 전위 다음 ₂ 흡입을 생쥐의 림프절을 배출.
   2. 셀 스트레이너와 1 ML의 주사기를 사용하여 기계적 고장에 의한 비장과 림프절에서 단일 세포 현탁액을 수집합니다. 적혈구를 용해시키기 위해 ACK 용해 완충액 5 mL를 5 분 동안 실온에서 비장 세포를 인큐베이션. 수집하고, 나머지의 세척차가운 FACS 버퍼와 plenocytes 또는 림프구. 표면 마커 CD4, CD8, CD25, 및 TCRVβ5와 3.2.4,하지만 얼룩 - 단계 3.2.3을 따르십시오.
   3. 3.3.7 라이브 CD4 ⁺ CD25 ⁺ 세포에 세포 내 사이토 카인 생산 (TGF-β와 IL-10) IPSC 파생 Tregs의 게이트를 분석 - 3.3.5에 기술 된 바와 같이 세포 염색에 대한 세포를 해결하기 위해 진행합니다.
7. 무릎에 AG-특정 Tregs의 침투 및 관절염의 억제.
   1. 칠일에 - 단계 (4.3.6 4.3) - 다음 14 후 관절염 유도 (IACUC 지침에 따라) CO에 의해 자궁 경부 전위 다음 ₂ 흡입 쥐를 안락사. 전기 클리퍼와 무릎에서 머리를 제거하고 수술로 무릎을 절제.
   2. 무딘 엔드 가위로 뒷다리에 절개를하여 다리에서 피부를 제거하고 발목 허벅지에서 아래로 피부를 잘라. 부드럽게 근육을 노출 할 수있는 다리와 발을 통해 피부를 벗겨. 없애다신중 무릎 관절 손상없이 다리의 근육.
      1. 바로 골반 / 고관절 위의 뒷다리를 잘라 날카로운 해부 가위를 사용하여 경골를 잘라.
   3. 48 시간 동안 4 % 포르말린에 무릎을 수정합니다. 2.5 M 포름산을 사용하여 무릎 석회; 95 % 에탄올에 두 번 씻어, 100 % 에탄올에 두 번 씻어, 3 분 자일 렌에 세 번 씻어 2 분 동안 탈 이온수에 두 번 헹구고, 1 mM의 EDTA에 석회. 20 분 동안 서브 끓는 온도 (90 ℃)에서 처리한다.
   4. 30 분 동안 고정 된 조직을 냉각. 4 분 동안 1X PBS로 씻어 그리고 파라핀에 포함. 물을 치환 한 다음 왁스를 침투 에탄올 화장실의 시리즈를 통해 조직을 탈수. 이어서 왁스 블록으로 함침 조직을 포함. 염색에 대한 수직 및 수평 절편을 수행합니다. 슬라이딩 마이크로톰으로 4 μm의 섹션을 준비합니다.
   5. deparaffi의 표준 절차 후 섹션에 면역 형광 염색을 수행합니다그러한 조직과 수분 보충은 자일 렌, 에탄올 ^(12)를 사용.
   6. 의 Ag 회수 후에 3 분 동안 3 % 과산화수소 용액에 충분한 양으로 상기 슬라이드를 침지시켜 내생 퍼 옥시 다제 활성을 차단. 60 분간 가습 실 내에 실온에서 PBS로 3 % BSA로 비특이적 결합을위한 블록 슬라이드.
   7. 차단 용액 100 : 1 희석하고, 형광 공역 TCRVβ5 항체 200㎕를 가진 얼룩 부분. 75 실온에서 2 시간 동안 배양 - 100 % 가습 챔버, 5 분 동안 1X PBS로 5 회 세척 하였다.
   8. DAPI를 포함하는 antifade 시약 핵 염색 슬라이드를 Counterstain과. 전체 커버 슬립이 적용되는 특정 만드는 커버 슬립에 희석 DAPI 염색 용액 (1X PBS 300 ㎚)의 약 300 μl를 추가합니다. 형광 현미경 (그림 3)에서 분석 할 때까지 4 ° C에서 어둠 속에서 슬라이드를 저장합니다.
8. 관절염 억제 분석법
   1. 기준을 설정하기 위해 다이얼 게이지 캘리퍼스를 사용하여 관절염을 유도하기 전에 마우스의 양쪽 무릎의 붓기를 측정한다.
   2. 관절염 유도 및 TREG 전송을위한 - 단계 (4.3.6 4.3)을 따릅니다. 다이얼 게이지 캘리퍼스 후 TREG 전송으로 마우스 무릎을 측정합니다.
   3. 무릎 직경 비율 증가를 계산 : % 증가 = (무릎 직경을 하루 1 - 0 일에 무릎 직경) / 일 0에 무릎 직경.
9. 조직 학적으로 무릎 관절 파괴와 염증 세포의 침윤의 측정 (그림 4).
   1. 7 일 후 관절염 유도에서, 전술 한 바와 같이 쥐를 안락사 및 수술 절차에 의해 무릎을 절제. 4.7.2 - 단계를 4.7.1을 참조하십시오.
   2. 4 % 포르말린에 무릎을 수정 EDTA에 석회, 파라핀에 포함. 단계 4.7.3 참조
   3. 10 % 포르말린에 고정, 모두 무릎을 제거하고 Formical-4에 석회 성으로 만들다. 4 μm의에서 파라핀 섹션에서 조직을 포함하고 hematoxyl와 얼룩및 에오신 (H & E) 또는 (단계 4.7.7에서와 같이) Safranin O 염색과에서 현미경으로 관찰한다.
   4. 반 정량적 평가 시스템과 뼈의 침식을 평가하기 위해 H & E 염색을 사용합니다 (0 : 없음 미란 4 : 확장 미란과 뼈의 파괴). 프로테오글리칸의 손실을 평가하고 반 정량적 평가 시스템으로 점수를 Safranin O 염색을 사용합니다 (0 : 프로테오글리칸의 손실; 3 : 프로테오글리칸을위한 염색의 완전한 손실).
      1. H & E 염색 슬라이드에 염증 세포의 침윤 점수를 반 정량적 평가 시스템을 사용하여 (: 없음 세포의 침윤 4 : 0 세포의 침윤을 풍부). 맹검 방식으로 두 무릎을 검사하여 점수를 평가합니다.

높은 해상도 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (마이크로 CT) 시스템과 무릎의 뼈 손실 5. 측정

1. 10 일 후 관절염 유도에서 2 % 이소 플루 란과 쥐를 마취시키다 및 이미징을위한 준비.
2. 위치 마이크챔버 내에서 위쪽으로 향하도록 무릎 전자.
3. 쥐의 무릎 주위의 뼈 구조의 생체 촬상에서 취득 고해상도 마이크로 CT 시스템을 사용한다.
4. 55 KV에서 10.5 μm의 복셀 크기, 145 μA 200 밀리 초 적분 시간, 211 이미지 : 다음 매개 변수를 마우스 무릎 관절을 포함하여 2.2 mm 길이의 마이크로 CT 스캔을 수행합니다.
5. 추가 이미지 처리 (볼륨 렌더링 및 변환) (그림 5) 후 가져 오기 마이크로 CT 영상과 캡처 정면 평면 이미지.

결과

28 일에, 다음과 같이),은 (Ag 특정 Tregs는 실질적으로 CD3과 AG-특정 TCR,이 T 세포 마커를 표명했다. CD3 ⁺ TCRVβ5 ^{+ 인구는} CD4를 표명했다. 일반적으로 자연적으로 T의 _REGS (nTregs)를 발생 및 ectopically Foxp3를 표현 T 세포에서 높은 수준으로 발현된다 또한 CD25, CD127, 및 CTLA-4를 표현 CD3 ⁺ TCRVβ5 ⁺ CD4 ⁺ 세포의 대부분. 유동 세포 계측법 (도 1)에 의해 분석하여 세포 내 염색으로 검출되는 IPSC 유래 세포 Foxp3를 발현 노치 리간드 관내 자극 후에도 장기간 지속되었다. IPSC-Tregs 잠재적 억제 활동했다 나타내는 AG-펄스 비장 세포 (도 2)와 함께 생체 외에서 자극 된 경우뿐만 아니라, AG-특정 IPSC-Tregs는, 예컨대 TGF-β와 IL-10 억제 사이토 카인을 생산했다. 형광 현미경 밝혀 더 Foxp3를 ⁺ 세포에 존재하는 OVA-처리 된 PBS 처리 된 무릎보다; 을 DsRed ^{+ 벡터} - 형질 iPSCs를받은 쥐의 무릎에 존재하는 어떤 Foxp3를 ⁺ 세포는 없었다. 더 많은 CD4 ^+를 MiDR-Foxp3를보다 MiDR-TCR-Foxp3를 형질 도입 iPSCs를받은 쥐의 무릎에 제시 Foxp3의 ⁺ TCRVβ5 ⁺ 세포 (그림 3). 이러한 관찰은 AG-특정 IPSC-Tregs받는 사람 마우스로 입양 전송 후 AIA 무릎으로 마이그레이션하는 것이 좋습니다. 전송 된 IPSC 파생 된 세포는 실질적으로 OVA가 존재하는 경우 부종 염증 무릎을 감소하지만 쥐 모델에서 MBSA와 주입 제어 무릎 (그림 4)에 영향을 미치지 아니합니다; 고해상도 마이크로 CT 시스템 (도 5)에 의해 가시화 셀 전송 무릎 뼈 손실 감소.

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그림 1 :. AG-특정 IPSC - Tregs의 차별화 쥐 iPSCs는 구조로 형질 도입했다 : MiDR-TCRα-2A-TCRβ-2A-Foxp3의는 OVA 특정 TCR 및 Foxp3의 유전자를 포함. 유전자 형질 도입 세포 (을 DsRed ^+)는 mFlt3L 및 MIL-7의 존재 OP9-DL1-DL4-IA의 ^B 세포에 공동 - 배양 하였다. (A)는 T의 형태학은 0 일, 7, 14에 대한 세포 분화를 _REGS 하루 28 CD3에 IPSC 파생 된 세포의 단백질 발현을위한 22 (B) 유세포 분석 ⁺ TCRVβ5 ⁺ 표시 (R1)로 게이트와 CD4와 CD8의 발현을 분석, CD25, CD127, CTLA-와 한 세포 CD4 ⁺ CD8으로 게이트 셀 표시 4, Foxp3의 ^- 세포 (R2). (진한 라인, 음영 영역은 이소 타입 컨트롤을 나타냅니다) larg의를 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 어 버전입니다.

그림 2 : I n은 체외 차별화 된 AG-특정 Tregs의 기능 분석 쥐 IPSC-Tregs는 비장 세포에 의해 자극했다. (장갑차, T의 _REGS / 장갑차 = 1 : 4), OVA _323-339 펩타이드와 펄스. 세포 내 사이토 카인 생산 (TGF-β와 IL-10) 세포 계측법 라이브 CD4 ⁺ CD25 ⁺ 세포에 게이팅 후 흐름에 의해 분석 하였다. (진한 라인, 음영 영역은 이소 타입 컨트롤을 표시) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3 :g-고유의 무릎 관절에 IPSC-Tregs에 침투. AG-특정 IPSC-Tregs는 적응 적 C57BL / 6 마우스로 옮겼다. 얼마 관절염 유도 (일 7-14) 후, 무릎을 제거하고 면역 조직학을 위해 염색 (스케일 바 : 20 μm의). OVA 특정 IPSC - Tregs를 수신 마우스가 무릎에 TCRVβ5 ⁺ 세포의 큰 숫자가있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4 : AG-특정 IPSC - Tregs의 입양 전송 쥐에 AIA를 개선한다 쥐 iPSCs는 레트로 바이러스 구조 MiDR, MiDR-Foxp3를, 또는 MiDR-TCR-Foxp3를하고 있었다 OP9-DL1에 공동 배양 / DL4 / 형질 도입 하였다. IA의 ^B 세포. 7 일에, 유전자 형질 세포 (3 × 10 ⁶ / 마우스)이었던doptively 2 주 셀 전송 후에 AIA로 유도 된 암컷 C57BL / 6 마우스에 옮겼다. 하루 다음 관절염 유도에서 관절염의 심각도는. 무릎 직경의 측정에 의해 모니터링 된 무릎 직경 (AC) % 증가. 무릎 직경의 증가는 눈을 멀게 방식으로 두 무릎을 검토하여 평가 일 0 관절염 점수에 주입하기 전에 각 마우스 preinjection 무릎 직경을 기준으로 계산 하였다 각 무릎 점수 할당 (0 : 눈에 보이는 부종이나 변색을 1 : 또는 변색없이 붓기 볼 2 : 변색과 붓기 보통 3 : 심한 변색과 붓기). 각 그룹에서, 다섯 마우스를 사용하고, 데이터는 세개의 독립된 실험의 대표 값이다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시됩니다. (D)의 평균 다섯 생쥐에서 모두 무릎을 위해 하루 7 득점. 데이터는 3 개의 독립적 인 실험 (에서 SD 평균 ±로 표시됩니다 ** p <0.01, *** p <0.001, 양방향 ANOVA). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5 :. 난자 주조 무릎에 IPSC-Tregs 마이그레이션 AG-특정과 뼈 손실을 줄일 수는 IPSC-Tregs 적응 적 C57BL / 6 마우스로 옮겼다. 이십일일 후 관절염 유도 내에 마우스를 마취시키고, 마우스의 무릎 주위의 뼈 구조는 마이크로 CT 장치에 의해 촬영 하였다. 수신 마우스 OT-II TCR / Foxp3의 유전자 형질 도입 벡터 형질 iPSCs 수용 생쥐 제어 비해 IPSC-Tregs는 골 손실의 상당한 감소를 나타낸다 쥐. (A)을 스캔이 2.2 mm 길이로 수행하고, 이미지 후에 캡처 된 상기 화상 처리부 (볼륨 렌더링 및 변환;스케일 바 :. (스케일 바 1mm) (B) 무릎 관절 주위의 뼈 볼륨 마이크로 CT 이미지의 3 차원 재구성을 사용하여 평가하고, 관심의 볼륨 내부 뼈의 볼륨을 계산 하였다. 1mm) 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

토론

이 프로토콜에서 중요한 단계는 TCR / Foxp3의 유전자 형질 iPSCs의 체외 분화된다. 시험관 노치 신호는 T 세포 계통으로의 개발을 유도한다. CD4 ⁺ Foxp3의 ⁺ Tregs에 iPSCs를 구별하기 위해, 우리는 OP9-DL1 / DL4 / IA의 ^B 세포, 매우 빠른 MHC II (IA ^나) 분자를 사용했다. iPSCs 대부분은 CD4 ⁺ 세포로 분화. 그러나, 표면 TCR 발현 후 많은 분화 이전 T 세포 분화 결국 죽게 할 수있는 능력을 잃는다. 그 결과, IPSC 유래 기능성 Tregs의 셀 수가 대폭 체외 분화 4 주 후에 감소시킨다. 이를 방지하기 위해, IL-2의 첨가는 그 시점에서 세포 생존을 향상시킬 수있다. 다른 방법은 마우스에 주 동안 시험 관내에서 분화 한 프리 Tregs을 전송 AG-특정 사전 Tregs의 성숙 및 생존을 구동하도록되어있다. 이 사전 Tregs 공동 수ntinue 차별화 된 또 다른 3 주 동안 생체 내에서 성숙. 이 방법을 사용하는 기능 AG-특정 TREG 인구 nTregs 형상이며 뮤린 모델에서자가 면역 관절염을 억제하는 기능이 iPSCs로부터 생성 될 수있다.

AG-특정 IPSC-Tregs의 생체 현상의 효과를 향상시키기 위해, 다른 화합물 (예를 들어, 레티노 산, gelectin) ^{13, 14} 또는 억제 사이토 카인 (예를 들면, TGF-β, IL-10)은 대체 전송 후에 사용될 수있다 사전 Tregs의. 세포 생존을 증가시키는 것 이외에,이 결합 방법은 Foxp3를 발현 ^{14,15 유지} 및 AG-특정 IPSC-Tregs의 품질을 향상시킬 수있다.

생체 TREG 개발에 발생할 수있는 잠재적 문제점은 감염 또는 후속 감량시 합병증 발생 전반적인 면역이다. VI에서 개발 AG-특정 Tregs의 많은 수의VO는 감염을 악화시킬 수 있습니다. 이 경우, 자살 유전자의 유도 카스파 제 9 (iCasp9) ^15,16은 TCR / Foxp3의 벡터 내로 혼입 될 수있다. 이 방법은 이러한 잠재적 인 문제를 극복 줄기 세포 유래 Tregs의 생성을 "차단"할 에이전트 (AP1903)을 이량 생체 불활성 작은 분자의 주사에 의한 줄기 세포 유래 Tregs의 제거를 허용한다.

자체 AG의 개별자가 ​​면역 질환을 앓고있는 호스트의 면역 시스템에 의해 인식 전형적인 단백질이다. 이 자동 AG는 면역계의 대상이며, T 세포 상호 삭제하지 않는다. 자기 AG에 특정 Tregs를 생성하기 위해, TCR 전달의 사용은 좋은 선택이다. 셀프 AG (예, 열 충격 단백질) 특정 TCR 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 성숙한 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Tregs로 형질 도입 될 수 있고, 이러한 접근은 임상에서 이용되고있다. 또한,로 데스, 세포 유래 Tregs 줄기 노치 신호와 유전자 자체의 Ag의 전달 Foxp3를 가진 특정 TCR 자극을 사용하여이 프로토콜 cribed는, 자기의 Ag 특정 Tregs 수 있습니다.

설계 Tregs를 이용하여자가 면역 질환에 대한 세포 기반 치료는 ¹⁷ 유용 할 수 있습니다. T 세포의 TCR 전달이 가능한 금고 및 임상에 적용 가능한 것으로 판명되었지만, 건강한 조직에 의한 ¹⁸ 교차 반응에 의해 야기되는자가 면역에 중요한 안전성 문제는 여전히 존재한다. 또한, 현재의 방법을 이용하여 유전자 조작 Tregs는 일반적으로 생체 내에서 ¹⁹ 단기 지속성을 갖는다. 대안 적으로, 모노클 AG-특정 Tregs 다수의 개발을위한 유망한 공급원은 줄기 세포이다. 배아 줄기 세포 (는 ESC)가 가장 능성 자기 갱신해야하지만, 환자들을 입수 가능하지 않다. 쉽게 말초 혈액으로부터 분리되지만, 조혈 줄기 세포 (조혈 모세포)가있는 멀티강력한 줄기 세포와는 ESC ^(20)와 마찬가지로 세포 배양 물에서 확장 될 수있다. 본 IPSC 기술은 다양한 전사 인자의 형질 도입에 의해 환자의 체세포에서 PSC의 더 효율적인 생성에 진출하고있다. 방법론 개선 다수 최대한 이러한 면역 원성 및 발암 등의 잠재적 인 위험을 감소시킴으로써 iPSCs를 생성하는 최근에 개발되었다. 는 ESC에 비해 iPSCs는 동일 능성과 자기 갱신을해야합니다. 그 결과, IPSC 기술은 환자 - 및 / 또는 질병 특정한 PSC를 개발하는 이점을 제공 할 수있다. iPSCs의 사용은 AG-특정 Tregs는자가 면역 질환 ^{10, 11에} 대한 세포 기반 치료법의 필드를 진행할 수 개발.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
C57BL/6j 마우스	Jackson Laboratory	664
B6.129S7 Rag1tm1Mom/J	Jackson Laboratory	2216
Anti-CD3 (2C11) 항체	BD Pharmingen	553058
Anti-CD28 (37.51) 항체	BD Pharmingen	553295
Anti-CD4 (GK1.5) 항체	Biolegend	100417
Anti-CD8 ( 53– 6.7) 항체	Biolegend	100714
Anti-CD25 (3C7) 항체	Biolegend	101912
Anti-TCR-β (H57597) 항체	Biolegend	109220
Anti-IL10	Biolegend	505010
Anti-TGFβ	Biolegend	141402
DMEM	Invitrogen	ABCD1234
α-MEM	Invitrogen	A10490-01
FBS	Hyclone	SH3007.01
Brefeldin A	Sigma	B7651
Polybrene	Sigma	107689
Genejammer	Integrated science	204130
ACK 용해 완충액	Lonza	10-548E
mFlt-3L	peprotech	250-31L
mIL-7	peprotech	217-17
젤라틴	시그마	G9391
파라포름알데히드	시그마	P6148-500G	주의: 알레르기성, 발암성, 독성
투과화 완충액	Biolegend
mBSA	시그마	A7906
OVA 알부민	Avantor	0440-01
CFA	Difco	2017014
Tailveiner 억제	Braintree Scientific	RTV 150-STD