여기에서 우리는 세 번째 령 (L3) 초파리의 애벌레 단계에서 유기체 지방 수준을 측정하는 방법을 제시한다. 이 방법은 변경된 지방 저장과 애벌레를 구분하는 지방 조직의 비교적 낮은 밀도를 이용한다. 부력 기반의 분석은 신속하게 재현, 경제적 선별을위한 유용한 도구입니다.
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이 논문에서
요약
초록
Drosophila melanogaster는 지방 조절 연구의 핵심 실험 시스템입니다. 현재 초파리에 저장된 지방의 수준을 측정하기 위한 수많은 기술이 존재하지만 대부분은 비용이 많이 들거나 힘들고 명확한 한계가 있습니다. 여기에서는 L3 Drosophila 유충의 유기체 지방 수준을 빠르고 저렴하게 측정하는 방법을 제시합니다. 이 기술은 지방 조직과 제지방 조직 간의 밀도 차이에 의존하며 지방 및 제지방 표현형을 신속하게 검출할 수 있습니다. 우리는 중성 지질 추출 및 질량 분석법(GCMS)과 결합된 가스 크로마토그래피에 의해 결정된 체지방 비율과 비교하여 이 방법의 정확성을 검증했습니다. 또한 유충의 수집 및 동기화를 위한 자세한 프로토콜과 관련 실험 레시피를 간략하게 설명합니다. 아래에 제시된 기술은 가장 널리 사용되는 지질 정량 분석법의 주요 단점을 극복하고 유충의 무결성을 유지하면서 L3 유충에서 지방 조절 표현형을 빠르고 민감하게 스크리닝할 수 있는 강력한 방법을 제공합니다. 이 분석법은 초파리를 사용한 신진대사 및 지방 조절 연구에 광범위하게 응용됩니다.
서론
노랑 초파리는 유전학 및 기타 기본적인 생물학적 질문의 연구에서 한 세기에 걸쳐 사용되어왔다. 초파리는 사람의 질환에 대한 연구를 위하여 강력한 도구가 있음을 지난 수십에서는 명백 해졌다. 인간의 질병과 관련된 유전자의 80 % 식별 된 비행 ortholog 1가 - - 70으로 4, 초파리는 복잡한 질병을 연구하기에 간단 아직 번역 시스템을 제공한다. 특히 대사는 연구로부터 혜택을 받았다. 뿐만 아니라 초파리와 인간 사이에서 보존 된 대사 유전자가 있지만, 관련 기관, 세포 유형은 2,5- 매우 유사하다. 예를 들어, 포유 동물의 간 및 흰색 지방 조직 (6)에서 수행 된 것과 모두 triacylglycerides (TAG)과 글리코겐, 기능과 유사 플라이 점포의 지방이 몸. 인간의 비만의 모델로 초파리를 사용하면 훨씬 지질에 대한 우리의 이해를 개선했다신진 대사와 비만 (7)의 유전학. 개발의 애벌레 단계가 공급하기 위해 최선을 다하고 있습니다 에너지의 저장은 pupariation 동안 사용으로 저장 또는 사용에 영양소의 분리를 공부에 특히 유용합니다.
현....
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프로토콜
1. 관심의 유전자형과 파리에서 계란을 수집
주 : 이상적인 십자가 150 처녀 파리 적어도 75 명의 남성으로 구성되어 있습니다. 주식 컬렉션은 최소 200 파리로 구성되어야합니다.
- 포도 접시를 준비합니다.
- 4 L 플라스크에 1.5 L 증류수에 37.5 g 한천을 추가합니다.
- 121 ºC (250 ºF)에서 50 분 동안 오토 클레이브 물 / 한천 혼합.
- 물 / 한천 혼합 고압 증기 멸균 동안, 500 ml의 포도 주스에 50g의 설탕을 추가하고 설탕이 녹을 때까지 가열 교반 접시에 교반 막대로 저어.
- 열을 끄고 70 아래 ºC로 포도 주스 / 자당 혼합물을 냉각 교반을 계속합니다. 알코올 온도계 내부 온도를 테스트합니다.
- 포도 주스 / 자당 혼합물을 따뜻하게 녹여 교반 (예를 들어, Tegosept) 3g 초파리 항 곰팡이 제를 추가합니다.
- 물 / 배지 혼합물을 오토 클레이브를 벗어나면, 플라스크 때때로 소용돌이에 의해 터치 식힌다.
- 물 / 한천 혼합물 포도 주스 / 자당 혼합물을 결합하고 잘 혼합 때까지 저어.
- 작은 페트리 접시 (35 × 10 밀리 스타일)의 뚜껑에 포도 액 10....
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결과
그림 1은 부력 기반의 분석은 유전자 조작 유충 모두 높고 낮은 지방 점포를 감지 할 수있는 방법의 예를 나타낸다. 그림 1a는 애벌레 뇌에서 신경 세포의 특정 부분 집합 (E347)의 여자 또는 침묵을 보여줍니다 유도 낮은 및 높은 지방 각각 저장한다. 동일한 유전 적 배경 제어는 두 경우 모두에서 사용 하였다. (1B)의 농도 분석에 의해 얻어진이 표현형 GCMS에 의해 중성 지질 추출 및 정량에 의해 뒷받침되는 방법의 예를도.
애벌레 뇌의 특정 지역에있는 그림 1.
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토론
10 - 지질 수준 8을 측정하기 위해 개발 된 기술이 다수가있다. 그러나, 이러한 각각의 방법은 위에 설명 된 부력 기반 분석에 의해 해결 된 몇 가지 큰 단점이 함께 제공됩니다. 우선,이 분석은 매우 빠르다. 60 분 - 전체 농도 구배를 테스트하는 것은 더 이상 30 이상 걸립니다. 이것은 현재 사용중인 대부분의 기술에 큰 개선이다. 이를 분석하는 지질 및 다른 여러 시간 분리 9 시간 - 예를 들어, MS에 의한 지질 정량 7 걸린다. 동물의 다수의 화면을 수행 할 때 강한 억제력이다. 빠른 부력 표현형을 측정함으로써, 하나는 신속하게 관심의 표현형이 유전자형에 집중할 수 있습니다. 둘째, 밀도 분석은 (PBS에 대한) 소금과 설탕으로 만 일반적인 시약이 필요합니다. 이는 더 쉽고 더 저렴 유충 다수의 화면 또는 신속 흥미롭게 유전자형을 테스트 할 수있다. 마지막으로,이 프로토콜 난비 침습적 및 유생들 말에 여전히 살아있다. 이것은 상기 실험은 특정 지질 정량 .......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
K.E.H.는 Training Grant in Molecular Biology NIH-T32-GM08730의 지원을 받았습니다. 이 작업은 NIH, NIDDK Grant 5K01DK095932 및 AHA Award 12BGIA11930014 to T.R.의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Bacto Agar | VWR | 214030 | |
| Welch's Original 100% 포도 주스 | |||
| 자당 | 피셔 | S512 | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | |
| 에탄올 | 200 프루프 | ||
| 베이커 효모 | Fleichmann's | ||
| Yellow 옥수수 가루 | 퀘이커 | 농축 탈아 | |
| 초파리 한천 유형 II | Apex | 66-104 | |
| 콩 | ADM 특수 성분 | 062-100 | |
| 맥아 추출물 | Breiss | 5748 | |
| 가벼운 옥수수 시럽 | 카로 | ||
| 프로피온산 | VWR | U330-09 | |
| 염화나트륨 | Fisher | 50147491 | |
| 인산 칼륨 일 염기성 | 시그마 | P5655-100G | |
| 인산 나트륨 무수 | Fisher | S3933 | |
| 염화칼륨 | Fisher | P330-500 | |
| 35 x 10 mm 페트리 플레이트 | Fisher | 08-757-100A | |
| 50 ml 원추형 | Fisher | 50-869-569 |
참고문헌
- Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).
- Liu, Z., Huang, X. Lipid metabolism in Drosophila development and disease Usin....
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재인쇄 및 허가
