여기에서 우리는 세 번째 령 (L3) 초파리의 애벌레 단계에서 유기체 지방 수준을 측정하는 방법을 제시한다. 이 방법은 변경된 지방 저장과 애벌레를 구분하는 지방 조직의 비교적 낮은 밀도를 이용한다. 부력 기반의 분석은 신속하게 재현, 경제적 선별을위한 유용한 도구입니다.
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이 논문에서
요약
초록
Drosophila melanogaster는 지방 조절 연구의 핵심 실험 시스템입니다. 현재 초파리에 저장된 지방의 수준을 측정하기 위한 수많은 기술이 존재하지만 대부분은 비용이 많이 들거나 힘들고 명확한 한계가 있습니다. 여기에서는 L3 Drosophila 유충의 유기체 지방 수준을 빠르고 저렴하게 측정하는 방법을 제시합니다. 이 기술은 지방 조직과 제지방 조직 간의 밀도 차이에 의존하며 지방 및 제지방 표현형을 신속하게 검출할 수 있습니다. 우리는 중성 지질 추출 및 질량 분석법(GCMS)과 결합된 가스 크로마토그래피에 의해 결정된 체지방 비율과 비교하여 이 방법의 정확성을 검증했습니다. 또한 유충의 수집 및 동기화를 위한 자세한 프로토콜과 관련 실험 레시피를 간략하게 설명합니다. 아래에 제시된 기술은 가장 널리 사용되는 지질 정량 분석법의 주요 단점을 극복하고 유충의 무결성을 유지하면서 L3 유충에서 지방 조절 표현형을 빠르고 민감하게 스크리닝할 수 있는 강력한 방법을 제공합니다. 이 분석법은 초파리를 사용한 신진대사 및 지방 조절 연구에 광범위하게 응용됩니다.
서론
노랑 초파리는 유전학 및 기타 기본적인 생물학적 질문의 연구에서 한 세기에 걸쳐 사용되어왔다. 초파리는 사람의 질환에 대한 연구를 위하여 강력한 도구가 있음을 지난 수십에서는 명백 해졌다. 인간의 질병과 관련된 유전자의 80 % 식별 된 비행 ortholog 1가 - - 70으로 4, 초파리는 복잡한 질병을 연구하기에 간단 아직 번역 시스템을 제공한다. 특히 대사는 연구로부터 혜택을 받았다. 뿐만 아니라 초파리와 인간 사이에서 보존 된 대사 유전자가 있지만, 관련 기관, 세포 유형은 2,5- 매우 유사하다. 예를 들어, 포유 동물의 간 및 흰색 지방 조직 (6)에서 수행 된 것과 모두 triacylglycerides (TAG)과 글리코겐, 기능과 유사 플라이 점포의 지방이 몸. 인간의 비만의 모델로 초파리를 사용하면 훨씬 지질에 대한 우리의 이해를 개선했다신진 대사와 비만 (7)의 유전학. 개발의 애벌레 단계가 공급하기 위해 최선을 다하고 있습니다 에너지의 저장은 pupariation 동안 사용으로 저장 또는 사용에 영양소의 분리를 공부에 특히 유용합니다.
현재, 초파리 지방 저장 레벨을 결정하는 다양한 정량 방법이있다. 가장 널리 사용되는 방법은 결합 비색 분석 (CCA) -8,9-이다. CCA 인간 혈청 TAG 수준을 결정하기 위해 개발되고 궁극적으로 착색 된 생성물을 생성하는 산화 환원 커플 링 반응의 결과로 여러 반응을 겪을 것이다 트리글리세리드의 백본에서 해방 글리세롤 전제로 동작한다. 빛의 특정 파장의 흡수 후, 글리세롤의 존재의 초기 양을 측정한다. 그러나, 글리세롤은 TAG뿐만 아니라 모노 - 및 디아 실에서 해방 될 수 있으므로들에 대한 정확한 측정하지 않을 수 있습니다tored 체지방 9. 또한, 분쇄 성인 파리의 눈 안료는 약간의 흡광도 판독을 방해하고 결과 9,10을 복잡하게 할 수 있습니다. 따라서, CCA는 동반 10,11 농도계에 의해 정량화 될 수있는 대부분의 지질 군의 분리를 허용 박층 크로마토 그래피 (TLC)에 의해 검증되어야한다. 그러나, 스테롤 등 일부 지질 분류 분석 할 수 없으며, 다른 방법 (12)을 정량한다. 질량 분석 (MS)의 주요 세포 지질 12, 13의 모든 클래스를 정량 할 수있는 정확한 방법입니다. 그러나, MS에 의해 분석 할 필요 지질 추출 절차는 두 시간 소모적 (대부분 촬영 거의 전체 일) 및 비용이다. 여기서 우리는 신속하고 저렴 초파리의 L3 유충에 유기체 지방 수준을 결정하기위한 다른 방법을 제시한다.
아래에 제시된 방법은 지방 조직, 마른 조직 사이의 밀도의 차이를 이용한다. 포유 동물 FAt 조직은 1.06 g / ㎖ (15)의 밀도는 약 0.9 g / ㎖ 14 동안 골격근의 밀도를 갖는다. 이 차이는 지방의 높은 점포 동물들이 고정 농도의 용액에 더 부유 할 수 있도록 지방의 낮은 매장과 동물보다 낮은 밀도를 가질 것을 의미합니다. 이 호텔은 저렴하고 비 침습적 모두있는 동안 동물의 많은 수의 매우 빠른 스크리닝 할 수 있습니다. 부력 기반 분석은 또한 비만 16,17 새로운 유전 적 신경 레귤레이터를 식별하기 위해 같은 지방 수준의 공지 된 레귤레이터 변경의 표현형을 확인하는 데 모두 사용되어왔다.
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프로토콜
1. 관심의 유전자형과 파리에서 계란을 수집
주 : 이상적인 십자가 150 처녀 파리 적어도 75 명의 남성으로 구성되어 있습니다. 주식 컬렉션은 최소 200 파리로 구성되어야합니다.
- 포도 접시를 준비합니다.
- 4 L 플라스크에 1.5 L 증류수에 37.5 g 한천을 추가합니다.
- 121 ºC (250 ºF)에서 50 분 동안 오토 클레이브 물 / 한천 혼합.
- 물 / 한천 혼합 고압 증기 멸균 동안, 500 ml의 포도 주스에 50g의 설탕을 추가하고 설탕이 녹을 때까지 가열 교반 접시에 교반 막대로 저어.
- 열을 끄고 70 아래 ºC로 포도 주스 / 자당 혼합물을 냉각 교반을 계속합니다. 알코올 온도계 내부 온도를 테스트합니다.
- 포도 주스 / 자당 혼합물을 따뜻하게 녹여 교반 (예를 들어, Tegosept) 3g 초파리 항 곰팡이 제를 추가합니다.
- 물 / 배지 혼합물을 오토 클레이브를 벗어나면, 플라스크 때때로 소용돌이에 의해 터치 식힌다.
- 물 / 한천 혼합물 포도 주스 / 자당 혼합물을 결합하고 잘 혼합 때까지 저어.
- 작은 페트리 접시 (35 × 10 밀리 스타일)의 뚜껑에 포도 액 10 ㎖ - 8을 추가하기 위해 혈청 학적 피펫을 사용합니다. 뚜껑 벽의 높이가 볼록 형상을 형성하는 것보다 높은 혼합물 크라운 할 수있다.
- 포도 판 4 ºC에서 밀폐 용기에 실온에서 2 시간 동안 냉각 한 후 저장할 수 있습니다.
- 효모 페이스트를 준비합니다.
- 50 ML 원뿔 튜브에 4g 라이브 활성 건조 효모에 6 ml의 인산염 완충 용액 (PBS)를 추가하고 부드러운 때까지 주걱으로 섞는다.
- 저장 효모는 4 ºC에 붙여 넣습니다.
- 포도 판의 중간에 효모 붙여 넣기의 작은 덩어리 (약 1/8 작은 술)를 추가합니다. 주걱으로 어떤 거친 가장자리를 부드럽게.
- 그들은 주위 온도에 도달 할 때까지 인큐베이터에서 포도 접시를 놓습니다.
- 계란 수집 챔버와 장소 포도 판 w에 관심이 파리로 이동상단에 안쪽을 향하게 i 번째 효모 붙여 넣기. 계란 수집 챔버에 테이프 포도 판은 판 열외시키는 방지 할 수 있습니다. 포도 판의 하단에 중요한 유전자형과 날짜 정보를 기록해야합니다.
- 파리는 포도 접시에 알을 낳기 할 수 있도록 계란 수집 챔버를 뒤집다.
- 상자를 배치 또는 계란 수집 챔버를 통해 커버하고 25 ºC에서 인큐베이터에 배치합니다.
- 6 시간 - 파리 4 알을 낳기 할 수 있습니다.
- 계란 수집 챔버에서 포도 판을 복용하고 음식의 자신의 병에 다시 파리를 전송하여 수집을 종료합니다. 포도 판에서 초과 효모 페이스트를 닦아 주걱을 사용합니다. 24 시간 ~ 25 ºC에서 가습 인큐베이터에서 더 큰 페트리 접시에 보관 포도 접시입니다.
실험 식품 2. 전송 애벌레
- 실험 음식을 준비합니다.
참고 :이 음식 조리법이 블루밍턴 재고 센터 레시피 (18)에 기초한다. 중요 변경무대를 방황의시기에 의해 평가로 음식의 영양 가치를 최적화 할 수있는 효모의 양을 증가 포함 (112 사이 - 120 시간 25 ºC에서 계란을 수집 후). 우리는 건강과 우리의 실험 애벌레의 개발을위한이 조리법에 적합 찾을 수 있지만, 어떤 음식 조리법 단계 3.10에 나와있는 예들이 긍정적이고 부정적인 컨트롤과 허용 주어진 교정이다.- 1,600 ml의에게 증류수를 측정한다.
- 134g의 옥수수 가루 10.6 g 초파리 한천 타입 II, 및 1 L의 비커에 물 일부 (~ 500 ml)에 혼합한다. 전동 핸드 믹서 2 분 동안 혼합.
- 70g 라이브 활성 건조 효모, 18.4 g 간장 가루, 84.8 g 맥아 추출물, 또 다른 1 L의 비커에 물을 약간 (~ 500 ml)에 섞는다. 전동 핸드 믹서 2 분 동안 혼합.
- 각 비커를 소용돌이와 4 L 플라스크에 붓는다. 비커를 씻어 플라스크에 추가 남아있는 물을 사용합니다.
- 소용돌이에 의해 혼합, 140 ml의 빛 옥수수 시럽을 측정하고 플라스크에 추가 할 수 있습니다.
- 액체 환경에서 121 ºC (250 ºF)에서 50 분 동안 오토 클레이브.
- 고압 증기 멸균 한 후, 4 L 비이커에 음식을 부어 냉각 할 수 있습니다. 전동 핸드 믹서로 혼합하여 냉각 과정을 도와주세요.
- 플라스크 터치 충분히 냉각되면, 8.8 ml의 프로피온산 및 16.8 ml의 초파리 항진균 에이전트 / 에탄올 용액을 추가합니다. 잘 섞다. (용액이 70 ºC를 초과하지 않도록하고, 380g 초파리 항 곰팡이 제 L 1-200 증거 에탄올을 첨가하고 용해 될 때까지 따뜻한 접시에 교반 초파리 항 곰팡이 제 용액을 확인합니다.)
- 음식이 약 1 인치 깊이 때까지 튜브로 음식을 붓고 2 실온에서 냉각 할 수 - 3 시간. 25 ºC에서 인큐베이터에서 튜브 및 저장소를 연결합니다. 주일 이내에 사용하십시오.
- 점수는 그것 음식의 유리 병의 상단 층에 주걱을 여러 번 플 런지. 이 굴 및 공급하는 유충 도움이 될 것입니다.
- 22 - 24 시간 계란 컬렉션이 후종단, 같은 대략적인 크기의 50 첫째 령 (L1) 애벌레를 수집하는 작은 붓을 사용합니다. 실험 음식에 애벌레를 놓습니다. 다른 유전자형을 계속하기 전에 붓에 남아있는 애벌레가 없는지 확인 와이프 실험실에 페인트 브러시를 청소합니다.
- 25 ºC에서 인큐베이터에서 유충의 병을 놓고 개발 할 수 있습니다.
3. 애벌레의 지방 수준을 결정
- 솔루션을 준비합니다.
- 1 L의 10 배 PBS 주식을 준비합니다.
- 교반 막대를 포함하는 2 L의 비커에 800 ml의 물에 80g의 NaCl, 2 g의 KCl, 14.4 g이 나 HPO 4, 2.4 g의 KH 2 PO 4를 추가합니다. 모든 염이 통합 될 때까지 더 가열 교반한다. 7.4으로 산도를 가져옵니다. 물 1 L에 볼륨을 높입니다.
- 2 L 1X PBS를 준비합니다. 1,800 ml의 물에 200 ml의 10 배 PBS 주식 솔루션을 추가합니다.
- 20 % / V 자당 승하기 위해 1X PBS의 콘텐츠를 사용합니다.
- 1 L의 10 배 PBS 주식을 준비합니다.
- 로부터 유충의 병을 제거(일반적으로 계란 컬렉션 후 다섯 번째 날에) 유리 병의 측면을 방황하는 40 애벌레 - 인큐베이터 번 (20)이있다. 일시 분석뿐만 아니라 유충 방황의 수를 기록한다.
- 50 ML 원뿔 튜브에 11.5 ml의 PBS 9 ml의 20 % 자당을 추가하여 실험적인 솔루션을 준비합니다.
- 바이알의 상단에서 1 인치 - 0.5이 될 때까지 바이알에 20 %의 슈 크로스를 추가한다.
- 부드럽게 여전히 음식에 굴을 파기하는 무료 유충에 음식의 상단 층을 자극하기 위해 주걱을 사용합니다. 모든 유충 자당 용액의 표면으로 상승 할 것이다.
- 부드럽게 단계 3.3에서 초기 자당 농도에 애벌레를 전송하는 집게를 사용합니다.
- 부드럽게이 솔루션의 애벌레를 저어 주걱을 사용합니다.
- 원뿔 튜브를 모자와 철저하게 솔루션을 혼합시키기 위해 거꾸로 여러 번 흔들어 준다.
- 원뿔형 관 뚜껑을 벗기다하고 부드러운 소용돌이를 만드는 소용돌이 친다.
- 하나의 해결책 또는시의 상단에 떠있는 유충이 정착 할 수 있도록 허용바닥에 nking. 애벌레 해결하기위한 5 분 - 2 기다립니다.
참고 : 하나 부동 또는 침몰 확실히하지 유충이 여전히 존재하는 경우, 플로터 또는 싱커 중 하나로 애벌레 라벨을 절단 지점으로 사용할 수있는 라인을 선택합니다. 모든 유전자형이 같은 기준을 적용합니다. 우리는 19 돌연변이 분석 교정 용 음성 대조군으로서 사용될 수있는 양성 대조군과 lsd2로서 사용될 수있다 우리 경계. ADP SIR2 또는 17 돌연변이 애벌레와 원추형 튜브의 하단에 각도를 사용한다. - 부유 유생의 수와 시험 특정 농도를 기록한다.
- 밀도를 증가시키는 실험 용액에 1 ㎖의 20 % 슈 크로스를 추가한다.
- 반복 3.10-3.7 단계를 반복합니다. 부유 유생의 수와 새로운 농도를 기록한다.
- 유충의 95 % 이상이 부동 때까지 단계 3.12와 3.13을 계속합니다.
- PBS 가득 해부 접시에 모든 애벌레를 수집하기 위해 집게를 사용합니다.
- OBS어떤 작은 애벌레, 사전 번데기, 번데기, 또는 유전자형 사이에 다른 차이가있는 경우 현미경과 주에서 정말 짜증나 애벌레.
참고 : 이상적으로, 모든 애벌레가 균일하고 동일한 발달 단계에 나타납니다. 우리는 이러한 조건에서 일관된 지방 측정을 관찰했다. - 유충의 수를 기록한다.
- 집게 사용, 건조 닦아 실험실에 10 애벌레를 전송합니다. 미세 원심 튜브를 라벨 및 튜브 (10)의 유충을 배치합니다.
- 플래시는 액체 질소의 유충을 동결. -20 ºC에서 튜브를 저장합니다.
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결과
그림 1은 부력 기반의 분석은 유전자 조작 유충 모두 높고 낮은 지방 점포를 감지 할 수있는 방법의 예를 나타낸다. 그림 1a는 애벌레 뇌에서 신경 세포의 특정 부분 집합 (E347)의 여자 또는 침묵을 보여줍니다 유도 낮은 및 높은 지방 각각 저장한다. 동일한 유전 적 배경 제어는 두 경우 모두에서 사용 하였다. (1B)의 농도 분석에 의해 얻어진이 표현형 GCMS에 의해 중성 지질 추출 및 정량에 의해 뒷받침되는 방법의 예를도.
애벌레 뇌의 특정 지역에있는 그림 1.
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토론
10 - 지질 수준 8을 측정하기 위해 개발 된 기술이 다수가있다. 그러나, 이러한 각각의 방법은 위에 설명 된 부력 기반 분석에 의해 해결 된 몇 가지 큰 단점이 함께 제공됩니다. 우선,이 분석은 매우 빠르다. 60 분 - 전체 농도 구배를 테스트하는 것은 더 이상 30 이상 걸립니다. 이것은 현재 사용중인 대부분의 기술에 큰 개선이다. 이를 분석하는 지질 및 다른 여러 시간 분리 9 시간 - 예를 들어, MS에 의한 지질 정량 7 걸린다. 동물의 다수의 화면을 수행 할 때 강한 억제력이다. 빠른 부력 표현형을 측정함으로써, 하나는 신속하게 관심의 표현형이 유전자형에 집중할 수 있습니다. 둘째, 밀도 분석은 (PBS에 대한) 소금과 설탕으로 만 일반적인 시약이 필요합니다. 이는 더 쉽고 더 저렴 유충 다수의 화면 또는 신속 흥미롭게 유전자형을 테스트 할 수있다. 마지막으로,이 프로토콜 난비 침습적 및 유생들 말에 여전히 살아있다. 이것은 상기 실험은 특정 지질 정량 ...
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
K.E.H.는 Training Grant in Molecular Biology NIH-T32-GM08730의 지원을 받았습니다. 이 작업은 NIH, NIDDK Grant 5K01DK095932 및 AHA Award 12BGIA11930014 to T.R.의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Bacto Agar | VWR | 214030 | |
| Welch's Original 100% 포도 주스 | |||
| 자당 | 피셔 | S512 | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | |
| 에탄올 | 200 프루프 | ||
| 베이커 효모 | Fleichmann's | ||
| Yellow 옥수수 가루 | 퀘이커 | 농축 탈아 | |
| 초파리 한천 유형 II | Apex | 66-104 | |
| 콩 | ADM 특수 성분 | 062-100 | |
| 맥아 추출물 | Breiss | 5748 | |
| 가벼운 옥수수 시럽 | 카로 | ||
| 프로피온산 | VWR | U330-09 | |
| 염화나트륨 | Fisher | 50147491 | |
| 인산 칼륨 일 염기성 | 시그마 | P5655-100G | |
| 인산 나트륨 무수 | Fisher | S3933 | |
| 염화칼륨 | Fisher | P330-500 | |
| 35 x 10 mm 페트리 플레이트 | Fisher | 08-757-100A | |
| 50 ml 원추형 | Fisher | 50-869-569 |
참고문헌
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