이 프로토콜은 신경 세포 - glia의 상호 작용의 실형 분석을위한 간접적 인 신경 세포 성상 세포의 공 배양을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
적절한 신경 개발 및 기능은 개발 및 성인 뇌의 전제 조건입니다. 그러나, 복잡한 신경 네트워크의 고도의 제어 형성과 유지 관리의 기초가되는 메커니즘은 완전히 지금까지 이해되지 않습니다. 건강과 질병에서 신경 세포에 관한 개방형 질문은 인간과 관련된 병리, 예를 들어, 알츠하이머 병 및 정신 분열증 조사에 기본 개발을 이해에서 다양하고 도달한다. 뉴런의 가장 상세한 분석은 시험 관내에서 수행 될 수있다. 그러나 신경 세포를 요구하고 장기적인 생존을위한 성상 교세포의 추가 지원이 필요합니다. 이 세포의 이질성은 신경 세포와 성상 세포의 분석을 해부하는 목표와 충돌합니다. 물리적 인하면서, 여기에 동일한 화학적 한정 배지를 공유 순수한 차 뉴런 및 성상 세포의 장기간 동시 배양 허용 세포 배양 분석을 제시분리. 이 설정에서, 문화는 최대 4 주 동안 생존 분석은 신경 세포 - glia의 상호 작용에 관한 연구의 다양성에 적합하다.
서론
지난 수십 년 동안, 신경 교세포 기능의 일반적인 해석은 신경 기능 (1)에 관한 적극적인 규제 역할 향해 단순히 지원의 속성에서 진화했다. 때문에 건강과 질병이 뇌의 항상성에 자신의 눈에 띄는 영향으로, 성상 세포는 과학계에 대한 특별한 관심이 있습니다. 지난 몇 년 동안, 연구는 다양한 생체 내 및 생체 외 3 뉴런 - 아교 세포의 상호 작용에 초점을 맞추고있다. 그러나, 배양 시스템의 대부분은 두 종류의 세포 분리 및 분석을 위해 해당 secretomes으로 허용되지 않는다.
몇몇 접근 방식이 오래 지속 생존과 관련된 신경 생리 네트워크 개발을 달성하기 위해 4-6 뉴런 및 아교 세포의 직접 동시 배양을 이용한다. 물리적으로 분리 된 두 7 세포 형태를 유지하면서, 본 프로토콜은 동일한 목표에 도달한다. conditione에 비해D 매체는 우리의 시스템은 신경 세포와 성상 세포 사이의 양방향 통신을 연구 할 수 있습니다, 8,9 접근한다. 세포를 상기 공유 매체에 성숙하다 동안 분비 신호 분자의 발현을 모니터링 할 수있다. 성상 교세포함으로써 신경 세포의 성장을 조절....
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프로토콜
쥐 실험 동물 사육의 신경 과학 지침에 대한 독일의 법률과 독일의 사회에 따라했다. 루르 - 대학 보훔의 동물 관리 및 사용위원회는 적절한 허가를 부여했다.
1. 준비 및 두피 성상의 재배
참고 : 뉴런이 준비되기 전에 성상 세포 배양이 합류 단층으로 개발해야로서, 다음 단계로 진행하기 전에 프로토콜 적어도 7 일 이내의 다음 단계를 완료합니다. 차 성상 세포는 출생 후 하루 (P) 0-3 주위에 마우스 새끼에서 얻은 혼합 폐해 문화에서 파생됩니다. T75 플라스크 당 세 뇌 (피질 6)이 사용되어야한다.
- 무균 조건에서 10 %의 v / V 말 혈청과 0.1 % V / V의 겐타 마이신으로 둘 베코의 수정 독수리 중간 (DMEM)을 보완하여 성상 세포 매체를 준비합니다. 최대 2 주 동안 4 ° C에서 매체를 저장합니다.
- 코트 배 T75은 위스콘신 플라스크6 % V / V의 CO 2의 존재하에 37 ℃에서 적어도 1 시간 동안 (세포 배양 등급의 물 PDL) 10 μg의 / ㎖ 폴리 D 라이신 번째. 도포 후, 결합되지 않은 양이온을 제거하고, 9 ㎖의 성상 세포의 배지를 추가하는 인산염 완충 식염수 (PBS)로 두 번 플라스크를 ....
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결과
간접 공 배양 시스템을 통해 신경 배양 분석은 여러 가지이며, 배양 성숙의 다른 단계에서 수행 될 수있다. 인해 세포가 4 주 동안 유지 될 수 있다는 사실로 인해, 배양 장기간 조사도 가능하다.
그림 1의 중간 왼쪽 패널의 회로도는 공동 배양 설정을 보여줍니다. 성상 세포 단층 (좌측 상단 패널) 및 신경 네트워크 (왼쪽 아래 패널)의 위상차 이미지로 예시되는 본 시스템의 사용으로, 두 종류의 세포 생균 촬상이 수행 될 수있다. 오른쪽 상단과 오른쪽 하단 패널에 나타낸 바와 같이 고정 후, 면역 세포 화학적 평가는 가능하다.
뉴런은 우리 모델의 약 7 DIV 시작 시냅스 연결을 설정하기 시작한다 (데이터는 보이지 않음).......
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토론
공유 매체에 그들을 유지하면서 현재 프로토콜의 주요 목표는 완전히 별도의 연결 및 성상 세포 배양 물이다. 이 때문에, 얻어지는 배양액의 순도는 절차의 시작 부분에서 검증되어야한다. 우리는 신경 세포 마커로서 신경 세포 고유의 튜 불린, neurofilaments 또는 NeuN 단백질의 사용을 권장, GFAP는 성상 세포 마커로, 희소 돌기 아교 세포 전구체 마커 Iba1 단백질로 O4 항원은 미세 아교 세포를 식별합니다.
프로토콜의 중요한 단계를 수행 할 때 단계를 설명하기 전에 '참고'에 의해 지정된 특별한주의를 기울이십시오. 신경 세포와 성상 세포의 두 차 문화가 오히려 민감한 고려. 따라서, 몇 가지 문제가 절차의 초기에 발생할 수있다. 성상 교세포 (10) DIV (프로토콜 섹션 1) 후 T75 플라스크에 합류 단층에 도달하지 않은 경우 (유효 기간의 경우) 성상 세포 매체의 구성 요소를 확인합니다. 게다가,(최대 플라스크 당 10 피질에) 문화를 시작.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
본 연구는 독일 연구재단(Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG: GRK 736, Fa 159/22-1; 보훔 루르 대학교 연구 학교(GSC98/1) 및 우선 순위 프로그램 SSP 1172 "Glia and Synapse", Fa 159/11-1,2,3)의 지원을 받았다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| B27 | Gibco (Life Technologies) | 17504-044 | |
| 세포 배양 등급 물 | MilliQ | ||
| Cytosine-β-D-arabinofuranoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C1768 | 주의: H317, H361 |
| DMEM | Gibco (Life Technologies) | 41966-029 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1397 | 주의: H317-334 |
| 포도당 | Serva | 22700 | |
| HBSS | Gibco (Life Technologies) | 14170-088 | |
| HEPES | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| 호스 세럼 | Biochrom AG | S9135 | |
| L-시스테인 | 시그마-알드리치 | C-2529 | |
| MEM | Gibco (Life Technologies) | 31095-029 | |
| 오브알부민 | 시그마-알드리치 | A7641 | 주의: H334 |
| 파파인 | 워딩턴 | 3126 | |
| PBS | 자체 제작 | ||
| 폴리-D-라이신 | 시그마-알드리치 | P0899 | |
| 폴리-L-오르니틴 | 시그마-알드리치 | P3655 | |
| 피루브산 나트륨 | 시그마-알드리치 | S8636 | |
| 트립신-EDTA | Gibco (Life Technologies) | 25300054 | |
| Equipment | |||
| 24-well plates | Thermoscientific/Nunc | 142475 | |
| 24 웰 플레이트 (간접 공동 배양 용) | BD Falcon | 353504 | |
| 쌍안 | Leica | MZ6 | |
| 세포 배양 인서트 | BD Falcon | 353095 | |
| 원심 분리기 | Heraeus | Multifuge 3S-R | |
| 계수 챔버 | Marienfeld | 650010 | |
| 집게 | FST Dumont | 311254-20 | |
| 유리 커버 슬립 (12 mm) | Carl Roth (Menzel- glä ser) | P231.1 | |
| 인큐베이터 | , Thermo Scientific | Heracell 240i | |
| 마이크로 튜브(2mL), | Sarstedt | 72,691 | |
| 현미경 | Leica | DMIL | |
| , Millex, 주사기 구동 필터 장치 | Millipore | SLGV013SL | |
| Orbital shaker | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| 파라필름 | Bemis | PM-996 | |
| 페트리 접시 (10cm) | Sarstedt | 833,902 | |
| 피펫 (1mL) | Gilson | Pipetman 1000 | |
| 멸균 작업대 | The Baker Company | Laminar Flow SterilGARD III | |
| 수술용 가위 | FST Dumont | 14094-11 | |
| 주사기 | Henry Schein | 9003016 | |
| T75 플라스크 | Sarstedt | 833,911,002 | |
| 튜브(15mL) | Sarstedt | 64,554,502 | |
| 수조 | GFL | 수조 유형 1004 |
참고문헌
- Volterra, A., Meldolesi, J. Astrocytes, from brain glue to communication elements: the revolution continues. Nat Rev Neurosci. 6, 626-640 (2005).
- Barreto, G. E., Gonzalez, J., Torres, Y., Morales, L. Astrocytic-neuronal crosstalk: implications for....
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재인쇄 및 허가
