Method Article

를 사용하여 금 나노 입자의 효율적인 방사성 표지를위한 최적화 된 프로토콜 (125) I-표시 아 지드 보철 그룹

DOI:

10.3791/54759

⸱

October 10th, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Advanced Radiation Technology Institute, Korea Atomic Energy Research Institute, 2Department of Radiation Biotechnology and Applied Radioisotope Science, University of Science and Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I 125 - 표지 지드의 합성 및 무도 클릭 반응을 이용 dibenzocyclooctyne (DBCO) - 기 - 컨쥬 게이트 13 나노 크기의 금 나노 입자의 방사성 표지에 대한 세부 절차를 설명한다.

Abstract

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여기에서는 125I-표지된 아지드 보철기의 방사선 합성을 위한 자세한 프로토콜과 구리가 없는 클릭 반응을 사용하여 DBCO-그룹 기능화된 금 나노 입자의 효율적인 방사 표지에 대한 적용을 보여줍니다. 주석화된 전구체 (2)의 방사성 요오드화는 [125I]NaI 및 클로라민 T를 산화제로 사용하여 실온에서 15분 동안 수행하였다. 조생성물의 HPLC 정제 후, 정제된 125I-표지 아지드(1)를 높은 방사성 화학적 수율(75 ± 10%, n = 8) 및 우수한 방사성 화학적 순도(>99%)로 얻었다. 방사성 표지 된 13nm 크기의 금 나노 입자의 합성을 위해 DBCO 기능성 금 나노 입자 (3)는 티올 화 폴리에틸렌 글리콜 중합체를 사용하여 제조 하였다. 1과 3 사이의 구리가 없는 클릭 반응은 125개의 I-표지된 금 나노입자(4)에 방사성 박막 크로마토그래피(radio-thin-layer chromatography, radio-TLC)에 의해 측정된 95% 이상의 방사성 화학적 수율을 제공했습니다. 이러한 결과는 스트레인 촉진 구리가 없는 클릭 반응을 사용하는 현재의 방사성 표지 방법이 DBCO 그룹 함유 나노 물질의 효율적이고 편리한 방사성 표지에 유용할 것임을 분명히 나타냅니다.

Introduction

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아지드와 시클로옥틴 사이의 변형 촉진 무동 클릭 반응은 광범위한 생체 분자, 나노 물질 및 살아있는 피험자1-7의 효율적인 생체 직교 표지에 광범위하게 적용되었습니다. 이 접합 반응의 우수한 부위 특이성과 빠른 반응 속도로 인해 방사성 표지된 추적자를 합성하는 데에도 사용되었습니다. 몇 개의 18F-표지 아지드 또는 DBCO 보철 그룹은 펩타이드 및 항체를 표적으로 하는 다양한 암의 체외 라벨링과종양 8-13의 생체 내 사전 표적 이미징을 위해 준비되었습니다. 이러한 예 외에도 양전자 방출 단층 촬영(PET) 이미징 연구를 위한 나노 물질의 금속-방사성 동위원소 라벨링에 동일한 접합 반응이 적용되었습니다14-16.

수십 년 동안 방사성 요오드는 PET 이미징(124I), 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영(SPECT) 이미징(123I, 125I) 및 갑상선암 치료(131I)를 통해 생물 의학 연구 및 임상 시험에 사용되었습니다17-21. 따라서 방사성 요오드 라벨링을 위한 효율적인 방법은 분자 이미징 연구, 생체 분자의 장기 분포 분석, 바이오마커 식별 및 약물 개발을 포함한 다양한 조사에서 근본적으로 중요합니다. 구리가 없는 클릭 반응 전략은 방사성 요오드 라벨링에 사용될 수 있습니다. 그러나 이 응용 분야는 18개의 F-표지된 생체 분자22-23만큼 광범위하게 조사되지 않았습니다. 여기에서는 DBCO 그룹 유래 분자의 방사성 표지를 위한 125I 표지 아지드의 합성을 위한 단계별 프로토콜을 제공합니다. 본 보고서의 절차에는 주석화 전구체의 방사성 요오드화, HPLC를 사용한 정제 단계 및 고체상 추출이 포함됩니다. 또한 125I-표지된 아지드화물을 사용하여 DBCO-group 변형 13-nm 크기의 금 나노입자의 효율적인 방사성 표지를 입증합니다. 이 보고서의 자세한 프로토콜은 합성 화학자가 방사성 표지 제품의 합성을 위한 새로운 방사성 표지 방법론을 이해하는 데 도움이 될 것입니다.

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Protocol

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주의 : 방사성 요오드의 산화 된 형태가 매우 휘발성 적절한 리드 방패와 리드 유리 병 취급해야합니다. 모든 방사 단계는 통풍이 잘되는 숯을 여과 후드에서 수행 한 실험 절차는 방사능 검출 장치에 의해 모니터링해야한다.

I 125 - 표지 된 아 지드의 합성 화학 및 역상 카트리지 (1)의 제조

  1. 용액의 시약의 조제
    1. 150 μL의 아 지드 전구체 (2) 무수 에탄올 (그림 1)의 1 mg의 용해.
      참고 : 아 지드 전구체에 대한 자세한 합성 절차 (2) 이전의 종이 (22)에보고되었다.
    2. 1X 인산 완충 생리 식염수 (pH는 7.4) 20 μL를 1 mg을 클로라민 T를 녹인다.
    3. 20 μL의 H 2 O 2 mg의 나트륨 메타 비설 파이트를 녹여
  2. Prepara카트리지 기
    1. 10 ㎖의 H 2 O이어서 10 ㎖의 무수 에탄올로 TC18 카트리지 워시 공기와 카트리지의 행렬을 건조하지 마십시오.

125 I 표지 아 지드 보철 그룹의 2 Radiosynthesis

  1. 전구체의 방사성 요오드화 반응
    1. 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 지드 전구체 용액 및 아세트산 (10 μL) (무수 에탄올 150 ㎕의 1 mg)을 추가한다.
    2. 반응 혼합물에 0.1 M의 NaOH (50 μL)에 [125 I]의 NaI 150 MBq의 추가.
    3. 클로라민 T 용액 (1X 인산 완충 식염수 20 ㎕의 1 mg)을 첨가하고 튜브를 마이크로 원심 함유하는 반응 혼합물을 닫는다.
    4. 방사성 요오드화 반응이 완료 될 때까지 실온에서 15 분간 반응 혼합물을 인큐베이션.
    5. 반응 혼합물에 소듐 메타 바이 설 파이트 용액 (2 ㎎을 20 μL의 H 2 O)를 추가방사성 요오드화 반응을 해소합니다.
    6. 조 생성물을 0.2 μl를 인출 한 후 용액을 100 ㎕로 희석 (H 2 O / CH 3 CN, 1 : 1) HPLC 분석.
      참고 : 모든 HPLC 실험의 경우, H 2 O (용매 A)를 포함하는 0.1 % 포름산 및 이동상 0.1 % 포름산 함유 아세토 니트릴 (용매 B)를 사용합니다.
    7. 칼럼 상 반전 (역상 분석 무선-HPLC를 이용하여 희석하고, 조 생성물을 C18 분석; 유속 : 1 ml / 분 용리액 구배 : 0-2 분 동안 20 % 용매 B, 20 % ~ 80 % 용매 B에 대한 2-22 분, 22 ~ 23 분 80~100% 용매 B, 그리고 23-28 분 동안 100 % 용매 B, 체류 시간 : 16.4 분) (그림 2).
  2. 분취 HPLC로 조 생성물을 정제하여
    주 : 이러한 주입기, 컬럼, 검출기 수집 튜브 및 폐수 수집 된 컨테이너 HPLC 부품 주위에 충분한 납 차폐를 제공한다.
    1. 일 철수HPLC 바이알에 전체 반응 혼합물을 전자. 아세토 니트릴 (0.5 mL)로 반응 관을 씻어 동일한 주입 병에 린스를 추가합니다. H 2 O (1 mL)로 수집 된 용액을 희석.
    2. (조제 무선 HPLC 상에 주입하여 조 생성물을 C18 컬럼 상 역방향 유속 : 10 ㎖ / 분 용리액 구배 : 2-22 분 동안 0-2 분, 20 % ~ 80 % 용매 B 20 % 용매 B를 22 ~ 23 분 동안 80~100% 용매 B, 그리고 23-28 분 동안 100 % 용매 B).
    3. I 125 - 표지 지드 (1)를 나타내는 피크 방사능 수집을 유리 시험관에 (도 2) (이들의 HPLC 조건에서의 t R은 17.8-18.8 분이다).
    4. 제조사의 프로토콜에 따라 방사선 도즈 교정기를 사용하여 분획의 방사 화학적 수율을 측정한다.
    5. 제품의 방사 화학적 순도를 결정하기위한 동일한 HPLC 조건을 사용하여 분석 무선 HPLC로 정제 된 생성물을 주입한다.
  3. 제품의 고체상 추출
    1. 40ml의 순수 H 2 O로 원하는 생성물 (1)을 포함하는 분획을 희석
    2. 컨디셔닝 TC18 카트리지에 희석액을 추가합니다.
    3. 추가로 15 ML의 H 2 O와 카트리지를 세척
    4. 리드 방패에 의해 보호되는 10 ml의 유리 바이알에 2 ㎖의 아세톤으로 카트리지에 갇혀 제품 (1) 용출. 제조사의 프로토콜에 따라 방사선 도즈 교정을 사용하여 용출 된 생성물의 방사능을 측정한다.
      주 : 디메틸 설폭 사이드 (DMSO) 또는 무수 에탄올 또한 카트리지로부터의 생성물의 용출을 위해 사용될 수있다. 방사능의 약 5-10 %는 보통 카트리지 스틱, 남은 방사선 표지 생성물은 완전히 유기 용매의 과잉을 사용하여 용출 될 수 없다.
    5. 질소 또는 아르곤 가스의 흐름과 함께 아세톤을 증발시켰다.
    6. 재를 녹여다음 방사성 표지 단계에 대한 DMSO (100-200 μL)와 sidue.

DBCO 기 - 금 나노 입자 컨쥬 게이트 (3)의 합성

  1. 13 나노 크기의 금 표면 변형 DBCO 기 함유 폴리에틸렌 글리콜 나노 입자
    1. 준비 나트륨 구연산 안정화 된 금 나노 입자 (3) (평균 크기 = 13 ㎚) 이전의 보고서 (24)에 따라.
    2. (10 nM 내지 15 mL) 중 시트 레이트 - 안정화 된 금 나노 입자에 트윈 20 (1 ㎜, 1.5 ㎖)의 수용액을 추가한다. 궤도 통에 20 분의 솔루션을 흔들어.
    3. DBCO 기 함유 폴리에틸렌 글리콜 티올 (평균 분자량 = 5,000, 100 μM, 1.5 ㎖)의 수용액을 추가한다. 오비탈 진탕 기에서 2 시간 동안 용액을 흔들어.
  2. DBCO 그룹 - 개질 된 금 나노 입자의 정제
    1. 정제 DBCO 그룹 - 개질 된 금 나노 입자 (4) </ 연속 원심 분리 (11,400 XG, 15 분 × 3)로> 강한.
    2. 뜨는을 가만히 따르다 및 금 나노 입자 펠릿의 재 부유 순수을 추가합니다.

4. 구리 무료 클릭 반응을 통해 DBCO - 그룹 - 개질 된 금 나노 입자의 방사성 표지

  1. I 125 - 표지 된 아 지드를 사용하여 125 I 표지 된 금 나노 입자의 합성 (1)
    1. 원심 분리 (11,400 × g으로 15 분간)을 사용하여 DBCO 그룹 - 개질 된 금 나노 입자의 농축 용액을 제조하고, 2 μM로 금 나노 입자의 농도를 조절한다.
    2. 금 나노 입자의 현탁액을 DMSO (5 μL)의 125I 표지 지드 (1) 4.1 MBq의 추가 (4) (2 μM, 50 μL).
    3. 60 분 동안 40 ° C에서 얻어진 반응 혼합물을 인큐베이션.
    4. 조 생성물로부터 분취 량 (0.2 μL)를 인출하고, 실리카 - 코에 적용ated 박층 크로마토 그래피 (TLC) 판.
    5. 이동상으로서 에틸 아세테이트를 사용하여 TLC 판을 개발한다.
    6. 전파 TLC 스캐너의 TLC 플레이트를 배치하고, 제조자의 프로토콜에 따라 방사성 표지 반응 (도 3)을 감시하는 스캐너를 실행.
  2. 조 생성물을 정제하여
    1. 원심 분리하여 125 I 표지 된 금 나노 입자 (4) (11,400 × g으로 15 분간)를 포함하는 반응 혼합물을 정제 하였다.
    2. 뜨는을 가만히 따르다 및 금 나노 입자 펠릿의 재 부유 순수을 추가합니다.
    3. 정제 된 제품에서 나누어지는 (0.2 μl를) 철회 및 실리카 코팅 된 TLC 판에 적용합니다.
    4. 이동상으로서 에틸 아세테이트를 사용하여 TLC 판을 개발한다.
    5. 무선-TLC 스캐너에 TLC 판을 놓고 125I 표지 GOL의 방사 화학적 수율 및 방사 화학적 순도를 결정하기 위해 스캐너를 실행제조 업체의 프로토콜에 따라 D 나노 입자 (4) (그림 3).

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Results

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stannylated 전구체 (2)의 방사성 요오드화 반응은 방사능 표지 된 생성물을 제공하기 위해 실온에서 15 분 동안 [125 I] NaI를 아세트산 및 클로라민 T 150 MBq의를 사용하여 수행 하였다 (1). 조 혼합물을 예비 HPLC 정제 후, 목적 생성물을 방사 화학적 수율은 75 ± 10 % (N = 8)을 얻었다. HPLC 분석은 125 I 표지 된 생성물의 방사 화학적 순도는 99 % 이상 (도 2)이고, 제품 (1)의 관찰 특정 방사능 40.7 MBq의 / μmol 않은 것을 확인했다. 카트리지를 사용하여 정제 된 생성물을 함유하는 분획을 고체상 추출 (1)의 아세톤 용액을 제공 하였다. 질소 또는 아르곤 가스의 스트림을 사용하여, 유기 용매가 증발 될 수 있...

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Discussion

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일반적으로, 정제 된 I-125 표지 지드 (1)의 관찰 방사 화학적 수율은 75 ± 10 %이었다 (N = 8). 방사성 표지는 방사능 MBq의 50-150로 수행하고, 그 결과 방사 상당히 일치한다. [125 I]의 NaI (t 1/2 = 59.4 d) 방사성 요오드화 반응에 사용 하였다 개월 이상 방사성 붕괴를 시행 한의 방사 화학적 수율로 관찰하면 약간 (53~65%) 감소 하였다. 따라서, [125 I]의 NaI 그것이 생성 되 자마자 이용 될 최적의 방사 또는 수율을 획득하기 위해 실험실로 전달하는 것이 좋다. 또한, 새로 제조 클로라민 T 용액은 원하는 방사 화학적 수율을 획득하기 위해 상기 반응에 사용되어야한다.

프리 커서 (2)는 매우 소수성이기 때문에, 150 μL의 절대 에...

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Disclosures

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저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 연구는 대한민국 정부지원지원기금(지원번호 2012M2B2B1055245, 2012M2A2A6011335)과 한국원자력연구원 RI-Biomics Center의 지원을 받았다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
클로라민 T 삼수화물시그마402869
[125I]NaI in aq. NaOHPerkin-ElmerNEZ033A010MC
나트륨 메타중아황산염 SigmaS9000
포름산Sigma251364
Sep-Pak tC18 plus 카트리지WatersWAT036800
Dimethyl sulfoxide SigmaD2650
아세톤Sigma650501
에탄올Sigma459844
Gold(III) chloride trihydrateSigma520918
Tween 20 SigmaP1379
DBCO PEG SH (MW 5,000)NANOCSPG2-DBTH-5k
TLC 실리카 겔 60 F254Merck
Analytical HPLCAgilent1290 Infinity모델 번호
Prep HPLCAgilent1260 Infinity모델 번호
Analytical C18 역상 컬럼AgilentZorbax Eclipse XDB-C18
Prep C18 역상 컬럼AgilentPrepHT XDB-C18
Radio TLC 스캐너BioscanAR-2000모델 번호
방사성 동위원소 선량 교정기Capintec, IncCRC -25R 선량 교정기모델 번호

References

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