준비 및 체외 자기 공명 영상에 대한 덴드리머 기반 대조 대리인의 특성

요약

이 프로토콜은 상자성 가돌리늄 이온을 배위 cyclen 계 마크로 킬레이트를 운반하는 덴드리머 자기 공명 영상 (MRI) 조영제의 제조 및 특성을 설명한다. 시판되는 모노머 아날로그에 비해 시험 관내 MRI의 일련의 실험에서이 에이전트는 MRI 증폭 신호를 생성했다.

초록

비 고리 또는 마크로 킬레이트와 가돌리늄 (III) 상자성의 착물은 자기 공명 영상 (MRI)에 대한 가장 일반적으로 사용되는 조영제 (CAS)이다. 그들의 목적 따라서 MR 화상 콘트라스트 및 MRI 측정의 특이성을 증가 조직 물의 양자의 이완 율을 향상시킬 수있다. 현재 임상 적으로 승인 된 조영제 빠르게 본체로부터 클리어 저 분자량 분자이다. 상자성 킬레이트 제의 담체로서 덴드리머의 사용이 더 효율적인 MRI 조영제의 미래 개발에 중요한 역할을 할 수있다. 특히, 높은 신호 대비 상자성 종 결과의 국소 농도의 증가. 또한,이 CA는 고 분자량과 크기 때문에 장기간 조직 체류 시간을 제공한다. 여기서는 폴리 (아미도 아민)에 기초한 고분자 MRI 조영제 (PAMAM) monomacro 함께 덴드리머를 제조하기위한 편리한 방법을 보여순환 DOTA 형 킬레이트 (DOTA - 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-테트라). 킬레이트 부 티오 브리지를 형성 PAMAM 덴드리머의 아민 표면기를 향해 이소 티오 시아 네이트 (NCS) 기의 반응성을 이용하여 추가 하였다. 덴드리머 제품 그래피, 핵 자기 공명 스펙트럼, 질량 분석, 및 원소 분석에 의해 분석 하였다. 마지막으로, 고해상도 자기 공명 영상을 기록하고, 제조 된 덴드리머와 시판 제제 단량체로부터 얻어지는 신호 대조와 비교 하였다.

서론

자기 공명 영상 (MRI)은 인해 비침 특성이 우수한 고유 연조직 콘트라스트 널리 생물 의학 연구 및 임상 진단에 사용하는 강력한 비 이온화 이미징 기술이다. 가장 일반적으로 사용되는 MRI 방법은 수분 신호의 밀도의 차이에 기초하여, 조직 내에서 고해상도 이미지 및 상세 정보의 제공 물 양자로부터 얻어지는 신호를 이용한다. 신호 강도 및 MRI 실험의 특이성은 또한 조영제 (CAS)를 사용하여 개선 될 수있다. 이러한 상자성 또는 초상 자성 길이 (T _1)와 횡 방향에 영향을 종 (T ₂₎ 완화 시간은 각각 ^1,2이다.

폴리 카르 복실 산 리간드 란탄 족 이온의 가돌리늄 착물은 가장 일반적으로 사용되는 _하나의 CA T이다. 가돌리늄 (III)는 T ₁ 휴식을 단축물 양성자의 시간, 따라서 MRI 실험 ^3에서의 신호의 콘트라스트를 증가시킨다. 그러나, 이온 성 가돌리늄은 독성; 크기는 (II) 칼슘의 근사하고 심각 칼슘 보조 세포에서 신호에 영향을줍니다. 따라서, 비 환상 및 마크로 킬레이트이 독성을 중화시키기 위해 사용된다. 다양한 여러 자리 리간드는 높은 열역학적 안정성 운동 불활성 ¹ 가돌리늄 (III) 착체의 결과, 지금까지 개발되어왔다. 특히 그 테트라 파생 DOTA (1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-테트라)에서 12 원 azamacrocycle cyclen에 따라 사람들은,이 CA 클래스의 대부분의 연구와 적용 단지입니다.

그럼에도 GdDOTA 형 CA는 낮은 콘트라스트 효율과 빠른 신장 배출 특정 단점을 표시 저분자 시스템이다. 고분자와 다가 CA는 이러한 문제 ^4에 좋은 해결책이 될 수 있습니다. CA의 biodistribu 이후기 주로 자신의 크기에 의해 결정되고, 고분자 CA는 조직 내에서 더 이상 유지 시간을 표시합니다. 마찬가지로 중요한 것은, 실질적으로 획득 된 MR 신호 및 측정 품질을 향상시키는 단량체 MR 프로브 (예 GdDOTA 착체)의 증가 된 국소 농도 이러한 에이전트 결과 multivalency.

덴드리머는 MRI ^4,5에 대한 다가 CA의 준비를위한 가장 바람직한 발판 사이에 있습니다. 잘 정의 된 크기의이 매우 분기 거대 분자는 표면에 다양한 커플 링 반응하는 경향이 있습니다. 이 작품에서 우리는 한 세대 4 (G4) 폴리 (아미도 아민) GdDOTA 같은 킬레이트 (DCA)에 결합 (PAMAM) 덴드리머로 구성된 MRI에 대한 덴드리머 CA의 제조, 정제 및 특성을보고합니다. 우리는 반응성 DOTA 유도체의 합성 및 PAMAM 덴드리머과의 커플 링을 설명합니다. 하나님 (III), 표준 물리 화학적 특성과 착화시 proceduDCA 재 수행 하였다. 마지막으로, MRI 실험 저분자 CA에 의한 것보다 더 강한 콘트라스트 MR 화상을 생성하기 DCA의 능력을 입증 하였다.

프로토콜

DCA 1. 준비

1. 단량체 (4) ^(6)의 합성.
   1. 4- (4- 니트로 페닐) -2의 합성 (4,7,10- 트리스 -butoxycarbonylmethyl 급 - 나프탈렌 -1- 일 - 테트라 아자 1,4,7,10) 부티르산 부틸 에스테르 (2).
      1. ((4,7- 비스 급 -butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-cyclododec 테트라 아자 -1- 일) - N - 아세트산 부틸 에스테르 (1) (1.00 g, 1.94 밀리몰), N 디메틸 포름 아미드를 용해 DMF 5 ㎖). 0.67 g, 4.86 밀리몰, 2.5 당량의 탄산 칼륨 (추가), 45 분 동안 실온에서 혼합물을 교반한다.
         참고 : 거대 고리 1 cyclen에서 제조하고 급은 이전에 게시 된 절차 ^7에 따라 브로 모 부틸.
      2. 추가 급 부틸 2- 브로 모 -4- (4- 니트로 페닐) 부타 노 (0.87 g, 2.53 밀리몰, 1.3 당량). 조금씩 1 시간 이상. t 하에서 계속 교반다음 18 시간 동안 그 같은 반응 조건.
         주 : 부틸 2- 브로 모 -4- (4- 니트로 페닐) 부타가 이전에 발행 된 절차 ^8에 따라 4- (4- 니트로 페닐) 부티르산, 티 오닐 클로라이드, 및 브롬으로부터 제조 하였다.
      3. 40 ~ 60 ° C에서 ^9에서 벌브 - 투 - 벌브 진공 증류에 의해 DMF를 제거한다.
      4. 갈색 무정형 고체 (1.09 g, 72 %) ^10이 제품을 칼럼 크로마토 그래피 (실리카겔, 7 % 메탄올 / 디클로로 메탄)에 의해 잔류 물을 정제.
   2. 4- (4- 아미노 페닐) -2의 합성 (4,7,10- 트리스 -butoxycarbonylmethyl 급 - 나프탈렌 -1- 일 - 테트라 아자 1,4,7,10) 부티르산 부틸 에스테르 (3).
      1. 니트로 벤젠 유도체 (2) 에탄올 (1.00 g, 1.28 mmol)을 (10 mL) 및 메탄올 (150 μL) 중 7 N 암모니아 용액을 녹인다. soluti에 촉매 (PD / C, 150 ㎎, 15 중량 %)을 활성탄 상 팔라듐 추가에.
      2. 파르 수소 반응기 장치에서 수소 대기 (2.5 바)하에 16 시간 동안 균질 혼합물을 흔들어.
      3. 에탄올을 중단하고 소결 유리 깔때기를 통해 현탁액을 여과하여 규조토의 케이크를 준비합니다. 여과하여 팔라듐 / C 촉매를 제거하기 위해 준비된 케이크 위에 1.1.2.2에서 정지를 따르십시오.
      4. 갈색 무정형 고체 (0.91 g, 95 %)로서 화합물 3을 얻었다 로터리 증발기 (수조 온도 ~ 40 ° C)에 완만 증류에 의해 용매를 제거한다.
   3. 4- (4-isothiocyanatophenyl)의 합성 -2- (4,7,10- 트리스 급의 -butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10- 테트라 아자 시클로도 데스 -1- 일) 부티르산 부틸 에스테르 (4).
      1. 3의 혼합물 (0.91 g, 1.22 mmol) 및 트리 에틸 아민에 디클로로 메탄 (0.685 ㎖, 4.87 밀리몰, 4 당량.) (15 ㎖) (0.124 ㎖, 1.58 밀리몰, 1.3 당량.) 티오를 추가합니다.
      2. 적극적으로 반응 마일을 저어16 시간 동안 실온에서 자석 교반기 xture.
      3. 회전 증발기 (수조 온도 ~ 40 ° C)에 완만 증류하여 용매를 제거하고 고체 비결정질 담갈색로서 생성물 (4)을 칼럼 크로마토 그래피 (실리카겔, 5 % 메탄올 / 디클로로 메탄)에 의해 조질 생성물을 정제 (0.51 g, 53 %).
2. 덴드리머의 DCA의 합성.
   1. 덴드리머 (5)의 합성.
      1. (40 ° C를 수조 온도 ~) 회전 증발기에서 온화한 증류하여 메탄올을 증발 G4-PAMAM 덴드리머 (667 mg을 메탄올 10 % 덴드리머 용액 4.67 μmol)를 타고 및 DMF의 잔류 물을 용해 (4 mL) 중 .
      2. (. 0.105 ㎖, 0.75 밀리몰, 160 당량), 트리 에틸 아민 추가 60 ° C에서 45 분 동안 교반하고, 추가 이소 티오 시아 네이트 (4) (354 ㎎, 0.45 밀리몰, 1.5 당량. 덴드리머의 아미노 표면 그룹에 대해) 조금씩 비켜R 1 시간.
      3. 48 시간 동안 45 ℃에서 자석 교반기, 반응 혼합물을 교반한다.
      4. 40-60 ℃에서 벌브 - 투 - 벌브 진공 증류에 의하여 용매를 제거한다.
      5. 용리액으로서 친 지성 겔 여과 매체 및 메탄올을 사용하여 크기 배제 크로마토 그래피에 의해 잔류 물을 정제. 열 팩 압력을 가하지 않고, 실온 (> 분말 1g 당 메탄올 4 mL) 중 적어도 3 시간 동안 메탄올 여과재를 팽창. 1 ml의 분수를 수집하여 중력 분리를 수행합니다.
      6. 박층 크로마토 그래피 (TLC)로 수집 된 분획을 분석한다. (단베이스 라인에있는 대부분의 극성 스폿 덴드리머 생성물로부터 유래) 15 % 메탄올 / 디클로로 메탄의 TLC 플레이트를 개발한다. 생성물 5 (270 ㎎, 91 %)을 얻었다 로터리 증발기 (수조 온도 ~ 40 °의 C)에 완만 증류에 의해 수집 된 분획을 증발시켰다.
   2. 덴드리머의 합성
   3. 포름산 (5 mL) 중 보호 된 덴드리머 킬레이트 5 (270 ㎎, 4.23 μmol)을 용해시키고, 24 시간 동안 60 ℃에서 혼합물을 교반한다.
   4. 회전 증발기 (~ 15 밀리바의 압력, 수욕 온도 ~ 40 ° C)에서 증류에 의해 증발 포름산 6주는 제품을 동결 건조 (압력 ~ 0.2 밀리바) ^9.
3. 덴드리머 조영제의 합성 (DCA)
   1. 물에 덴드리머 킬레이트 6 (4.35 μmol)을 용해시키고, 0.1 M 수산화 나트륨 7.0 pH를 조정한다.
   2. 물 (1 mL) 중의 ₃ GdCl · 6H ₂ O (113 ㎎, 304 μmol)을 용해시키고,이 4 시간에 걸쳐 킬레이트 (6)의 용액에 적하 추가; pH 미터를 사용하여 pH를 측정하여, 수산화 나트륨 수용액 (0.05 M) 7.0에서 pH를 유지한다.
   3. 방 t에서 자기 교반기로 혼합 교반24 시간 동안 럼 온.
   4. 하나님의 과잉을 제거하여 4 시간에 걸쳐 용액에 조금씩에 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA, 158 ㎎, 426 μmol)를 첨가 (III) 수산화 나트륨 수용액 (0.05 M)으로 7.0의 pH를 유지하면서. 실온에서 24 시간 동안 혼합물을 교반한다.
   5. GdEDTA의 대부분과 EDTA의 과잉을 제거하기 위해 크기 배제 크로마토 그래피를 수행합니다. 열 팩을 물에 부어 친수성 겔 여과 매체를 사용합니다. 적당한 볼륨으로 혼합물을 줄이고 열을로드합니다. 압력을 가하지 않고 탈 이온수로 컬럼을 용출.
   6. GdEDTA 및 EDTA의 잔류 물을 제거하는 원심력 1,800 × g으로 30 분간 원심 3 kDa의 필터 장치를 사용하여 샘플을 원심 분리기. 여과 액은 EDTA와 GdEDTA의 부재를 보여줍니다 때까지이 단계 (약 다섯 번) 반복합니다. 최종 DCA 회백색 생성물을 수득 플라스크에 샘플을 이동을 증발시킨 후, 용매를 동결 건조 (186 ㎎, 71 %).
      주 : ESI-MS에 의해 EDTA와 GdEDTA의 유무를 확인합니다.
   7. 크 실레 놀 오렌지 시험을 이용하여 자유 이온 등 하나님 (III)의 유무를 확인한다. 아세테이트 완충액 (PH 5.8)의 여과 액 (0.5 ㎖)에 녹인다. 크 실레 놀 오렌지 용액 몇 방울을 첨가하고 색상 변화를 추적 ¹¹ (황색 또는 보라색 색상 부재 또는 자유 하나님 (III)를 각각 용액의 이온의 존재를 나타냄).

덴드리머 제품 2. 체외 특성

1. (DOTA와 같은 거대 고리로 덴드리머의로드)를 PAMAM 덴드리머에 연결된 거대 고리 DOTA-단위의 수의 추정
   1. ¹ H NMR (- 핵 자기 공명 분광법 NMR)을 추정.
      참고 :이 절차는 덴드리머 5, 6에 가능합니다,하지만 DCA에.
      1. ¹ H NMR 스펙트럼 ^{(12)를 기록합니다.}
      2. 각각 덴드리머 5, 6하거나 지방족 영역; 방향족 영역과 두 개의 분리 된 지방족 영역 (T 개의 -Bu 그룹 2. 신호 지방족 덴드리머와 거대 고리 양성자 1. 신호)를 통합 할 수 있습니다.
         참고 :이 가수 분해 된 이후 지방족 영역은 덴드리머 (6)에서 t의 -Bu 그룹에서 유래에서 별도의 신호가 없습니다.
      3. 식을 사용합니다. 1 식. (2) R은 적분 값의 비 = 마크로 단위 수 (n)를 추정하기 위해 (식. 1 또는 지방족 덴드리머 방향족 지방족 / / 지방족 식의 T- 니어. 2) H의 _DEND = 양성자의 개수 덴드리머에서, _Ar은 방향족 H 양성자의 수, H _{니어 t는} t의 -Bu 그룹의 양성자의 수 = 및 H _{MAC 한} 거대 고리의 양성자의 수 =.
         참고 : 어느 식을. 1 식. 2 fo를 사용할 수있다R 덴드리머 5 만 식 동안. 1 덴드리머 (6)에 사용될 수있다. 교환 가능한 양성자 (아민, 아미드, 티오 우레아, 또는 카르 복실 레이트에서) 일반적으로 중수소로 치환되기 때문에, 이들은 계산 상정되지 않았다. 여기서, H는 _DEND (5) = 1128 또는 1000 (6), H _아르곤 = 4, H _맥 = (27)가 사용되었다.
         (1)
         (2)
   2. 황, 질소의 비율을 이용하여 원소 분석 평가.
      1. 고체 덴드리머 샘플 (이 작품에서 DCA)의 원소 분석을 수행합니다.
      2. 식을 사용합니다. 도 3은 R 판정 %의 N 및 %의 S, N의 _DEND 또는 S _DEND의 비율 = 마크로 단위의 수 (N) = 수를 추정질소 또는 덴드리머 황 원자, 및 N 또는 S _{MAC MAC 한} 거대 고리 부에 질소 또는 황 원자의 수 =.
         주 : 계수 2.29은 황 및 질소 원자의 질량의 비로부터 얻어진다. 이 연구에서, N의 _DEND = 250, S의 _DEND = 2, N = _{5, MAC, MAC} 및 S = 1을 사용 하였다.
         (삼)
   3. 비행의 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 시간 (MALDI-TOF)으로 추정.
      1. MALDI-TOF MS 분석 ^{(13)을 수행합니다.}
      2. 식에있어서, 마크로 단위의 수 (N)를 계산한다. M의 _Z = 관측 질량 (m / z), Z = 종의 전하가 M의 _DEND = 덴드리머 부분의 질량, M 및 _{MAC 한} 마크로 단위 질량 = 4.
         아니TE : M의 _DEND = 14306 및 M _맥 = (719)은이 연구에서 사용되었다.
         (4)
2. DCA 농도 ([DCA])의 결정 벌크 자화율 측정 (BMS)
   1. 플라스틱 병 관 ([DCA] ~ 5-10 mM)을 물 (360 μL)에서 DCA (5-10 mg)을 녹인다.
      주 : DCA] δ = 4.7 ppm으로 물의 공명> 15mM의 농도에서 샘플의 현탁액 T- 공진 가능한 중복을 피하기 위해 5 내지 10㎜의 범위 내에 있어야한다.
   2. DCA의 수용액 (1 v / V를 2)와 소용돌이 믹서를 사용하여 생성 된 용액 (420 μl를) 혼합 T-의 현탁액 혼합물 : D ₂ O 60 μl를 추가합니다.
   3. 샘플 튜브에 H ₂ O 혼합물 (10:90 v / v)의 : 외부 NMR 튜브에 전송 시료 400 μl를하고 동축 NMR 삽입 튜브를 놓습니다 T-의 현탁액으로.
   4. 기록^1H NMR 스펙트럼 및 내부 및 외부 튜브 NMR (참조)의 현탁액을 ¹² T-로부터 유도 공진 신호 사이의 주파수 변화를 측정한다.
   5. 식을 사용합니다. 5 T는 절대 온도 =에서 [DCA]을 결정하기 위해, Δχ는 기록 변화를 = 하나님 (III) ^(14), 및 S = 일정한 종속에 대한 란탄 족 이온에 대한 _EFF = 유효 자기 모멘트 (μ _EFF = 7.94을 μ 상기 시료의 형상 자계 (각각 0, 1/3, 자계에 수직 인 구형, 실린더에 평행 한 실린더의 경우 1/6)에서의 위치에 따라.
      참고의 현탁액 용액 (60 μL) T- 다음 [DCA]에서 얻어진 계산 값 인해 D ₂ O를 첨가하여 원래의 농도로 보정한다.
      (5)
3. 동적 빛산란 (DLS) 측정.
   1. 필터링 DCA 용액을 제조 하였다 (0.2 ㎛의 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 / PTFE 필터 하나님 0.75 밀리미터 (III)) -4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES) 완충액 (25 mM의, pH를 7.4) 및로 전송 DLS 측정을위한 큐벳.
   2. DLS 장치에 큐벳을 놓고 다음 매개 변수를 설정 : 기록 30 초 전에 검사 사이의 온도 평형에 지연없이 15 스캔 (1 스캔 = 12 초, 굴절률 = 1.345, 흡수 = 1 %)의 5 반복을 .
   3. 상기 취득 된 데이터를 반출 및 크기 (수력 학적 직경)의 함수로서 인구 (%)을 플로팅하여 크기 분포 히스토그램을 얻었다.
4. 종 방향 및 횡 relaxivities의 측정.
   주 : 유사한 절차가 이미 휴식 시간 분석기 ^(15)를 사용하여 설명 하였다 이 절차는 탑 스핀와 300 MHz의 NMR 분광계를 사용하여 수행 하였다소프트웨어.
   1. H에서 DCA 솔루션 ₂ O의 세트 준비 : D ₂ O (500 μL, 10 % D ₂ O H ₂ O의를, [DCA] = 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0 밀리미터, [HEPES 상기 DCA 스톡 샘플에서 = 25 mM)을 () 2.2 절을 참조하십시오.
   2. NMR 튜브에 용액 450 μl를 전송하고 기기에 넣습니다.
   3. 획득 파라미터를 최적화하고 T를 수행 반전 복구 (IR) 및 차량 - 카르 · 퍼 어셀 · 메이 붐 · 길을 _{이용하여도 1} 및 T _2의 실험 (CPMG (90 여기 펄스 기간 (P1) 및 사출 주파수 (O ₁₎ 오프셋) ) 펄스 시퀀스들 각각.
   4. T _1과 T ₂ 휴식 시간의 결정.
      1. 기록 측정, 프로세스에게 F2 차원에서 2 차원 스펙트럼을 선택하고 대화 형 위상 보정을 수행합니다.
      2. 분석 / T에서 해당 슬라이스 (최대 강도 피크)을 선택 ₍₂₎ 휴식 창을 통합하고, 휴식 모듈에 영역을 내보낼 수 있습니다.
      3. T ₁ T ₂ 휴식 시간을 얻기 위해 적절한 피팅 함수 (IR 및 CPMG 실험 invrec 또는 uxnmrt2, 각각)을 선택합니다.
   5. 모든 [DCA] 남아있는 솔루션에 대한 단계를 반복 2.4.4.2-2.4.4.4.
   6. 수득 _한 T 값으로부터 이완 율 (R _1, R _2)을 계산 _(1,2- R = 1 / T _1,2).
   7. 플롯 R ₁ 및 R ₂ (초 ^-1)에서 밀리미터 하나님 (III) 농도의 함수로서.
   8. 식에 의해 정의 된 바와 같이, 장착 직선의 기울기로부터, 길이 방향 및 횡 relaxivities, _R1 및 _R2 (㎜ ^-1 초 ^-1)을 결정한다. 6, 여기서 R _{난, OBS} = 길이 (I = 1) 또는 가로 (I = 2) 반자성 완화 속도실험에 사용 된 상자성 종 부재와 [하나님 = 하나님 (III)의 농도로 물.
      (6)

체외 MRI 3.; DCA와 GdDOTA 사이 비교

1. 튜브 팬텀의 제조
   1. 조영제의 농도를 산출 실험의 두 세트의 DCA (4 × 350 μL) 및 GdDOTA (4 × 350 μL)과 물 샘플 (4 × 350 μL)의 수용액을 준비한다 (3.1.1.1)를 당 하나님 (III) 또는 분자 당 (3.1.1.2).
      1. 이 DCA 샘플과 두 GdDOTA 준비 각각 하나님 당 0.5 및 1.0 밀리미터 (III)의 농도 샘플. 또한, (제어 튜브 등)이 물 샘플을 준비합니다.
      2. 이 DCA 샘플 (2.5 하나님 (III) 또는 0.05 당 5.0 밀리미터 및 덴드리머 분자 당 0.1 mM)을 두 GdDOTA 샘플 (0.25, 0.5 mM)을 두 개의 물 샘플을 준비 (controL 튜브).
         참고 : 해당 DCA와 GdDOTA 농도는 BMS 방법을 통해 결정 농도와 각각의 재고 샘플을 희석하여 준비되어야한다 HEPES 완충액 (pH 7.4)와 (2.2 절 참조). 상기 계산을 간단히하기 위해 N = 50 덴드리머 분자 당 마크로 단위의 평균 수를 추정 하였다. 따라서, DCA의 비율은 분자 당 기준으로 계산 5 GdDOTA 1이었다.
   2. 용액 내의 기포의 존재를 피하기 위해, 300 ㎕의 플라스틱 바이알 관에 시료를 놓는다.
      주 : 플라스틱 바이알 관의 크기는 사용되는 고주파 코일의 종류와 크기에 의존한다 (여기서, 체적 코일 예가 주어진다).
   3. , 주사기 (60 ml의 볼륨) 내부에 샘플을 넣고 1 mM의 GdDOTA로 채우기 솔루션은 스캐너에 넣습니다.
      주의 : 샘플은 자장의 감수성에 영향 (변화를 피하기 위해 GdDOTA 수용액에 넣고다른 자화율의 물질 사이의 가까운 인터페이스)를 발생 trength.
2. 매개 변수 최적화 및 영상.
   1. 자석의 등각의 샘플 주사기의 위치를 ​​해부학 적 검사 (로컬 라이저 / Tripilot)를 사용합니다.
   2. 전체 볼륨의 중심 주파수 (O _1), 수신기 이득 (RG) 및 송신 이득 (TX0 및 TX1) (자기 필드 균질성의 조정) shimming위한 조정을 수행 할 수있는 신호등 (조정 스캔)을 누른다.
   3. T ₁ -weighted (T _1w) 이미징의 경우, 빠른 낮은 앵글 샷 (FLASH) 방법을 선택합니다.
   4. 로컬 라이저 스캔을 사용하여 스캐너 (수평 주사기) 수직으로 배치 된 샘플에 대한 관상 슬라이스를 선택합니다.
   5. 식을 사용합니다. 대비 잡음비 (CNR) 취득 최적화 7 α = 플립 각도, TE는 에코 시간 = ^16, 매개 변수, TR =반복 시간, T _{1, A는,} T _{1, B는} T ₁ 샘플 (A)의 시간 (T _{1, A)} 및 샘플 B = (T _{1, B)에} 대한 어떤 CNR 최대화한다 (동일 대해 유효 T ₂ 회 : T _{2, A와} T _{2, B).}
      참고 : TE, TR, 및 α는 CNR 최적화 계산에서 얻을 수 있어야하는 동안 T _1과 T ₂ 휴식 시간은, 종 방향 및 횡 방향 relaxivities (2.4)의 측정에서 얻은 값으로 설정해야합니다.
      (7)
   6. 이전 단계 (3.2.5)에서 얻어진 파라미터들을 사용하여 화상을 취득.
   7. 신호 대 잡음비 (SNR)를 계산한다.
      1. 이미지 표시 및 처리에 인수 T _1w 이미지 (스캔)을로드창 및이자 (ROI)의 영역을 정의를 클릭합니다.
      2. 원형 투자 수익 (ROI)을 선택하고 샘플의 위치와 배경에 그립니다. 그 후, 평균 신호 진폭 (S _신호)와 배경 (S _잡음)의 표준 편차를 얻기 위해 화면을 클릭합니다.
      3. DCA, GdDOTA, 물 샘플 단계를 반복 3.2.7.2.
      4. 식을 사용하여 SNR을 계산한다 SNR = S _신호 / S _잡음.
   8. 약간 수정 된 절차에 따라, 휴식 향상 (RARE) 방법으로 급속한 인수를 사용하여 T ₂ -weighted (T _2w) 이미징을 수행합니다. CNR 획득 매개 변수의 최적화를 들어, 식을 사용합니다. 8.
      (8)

결과

DCA의 제조는 두 단계로 구성되었다 : 1) 단량체 DOTA 형 킬레이트의 합성 (도 1)과 G4의 PAMAM 덴드리머와 복잡 덴드리머 하나님 (III)의 후속 제조와 킬레이트 2) 커플 링 (도 2) . 첫 번째 단계에서, 네 카복실산 함유 cyclen 기반 DOTA 형 킬레이트 및 상기 합성 변형 적합한 직교 그룹을 제조 하였다. 부틸 2- 브로 모 -4- (4- 니트로 페닐) 부타 ⁸ 알킬화 1 (DO3A- 부틸 에스테르) ^(7)로부터 시작 제조 2-DOTA 유도체를 제공한다. 팔라듐 촉매 수소화 아닐린 (3)을 얻었다 (2)의 방향족 니트로기를 환원. 티오 3의

토론

덴드리머 MRI 조영제의 제조 모노머 유닛의 적절한 선택을 요구한다 (즉, 하나님에 대한 킬 레이터 (III)). 그들은이 상자성 이온의 독성을 감소시키고, 현재까지 비 환식의 다양한 및 거대 고리 킬 레이터는 이러한 목적으로 제공 ^1-3. 이들 중, 거대 고리 형 DOTA 킬레이트는 높은 열역학적 안정성 및 불활성 운동을 보유하고, 따라서, 불활성 MRI 조영제 ^1,18의 제조에 가장 바람직한 선택이다. 여전히 (III) ⁽¹⁹⁾ 복합체 안정 하나님을 형성하면서 또한, 그들은 할 수있는 다양한 기능 분자에 링크의 관능 성 킬레이트 결과 다양한 합성 변환, (예를 들어, 대상 벡터 또는 나노 캐리어)하는 경향이 있습니다. 이를 위해,이 절차에서 설명 DOTA 형 모노머 유닛 DO3A- 부틸 에스테르, 공통 용이 가능한 전구체 및 브롬화 유도체로부터 제조 된4- (4- 니트로 페닐) 부 탄산 산. 이 분자는 DOTA로부터 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Cyclen	CheMatech	C002
tert-부틸 브로모아세테이트	Alfa Aesar	A14917
N,N-Dimethylformamide	Fluka	40248
Potassium carbonate	Sigma-Aldrich	209619
4-(4-Nitrophenyl)butryic acid	Aldrich	335339
Thionyl chloride	Acros	Organics	382662500 참고: 부식성 물질; 흡입하면 독성
브로민	Acros Organics	402841000	참고: 심각한 피부 화상을 일으키며, 흡입하면 치명적입니다
디에틸 에테르	어떤 출처
황산나트륨	Acros 유기물	196640010
클로로포름	VWR Chemicals	22711.29
tert-Butyl 2,2,2-trichloroacetimidate	Aldrich 364789		참고: 가연성 물질; 피부와 눈에 자극성
트리플루오르화 붕소 에테르레이트	Acros Organics	174560250	48% BF3. 참고: 가연성 물질; 피부 화상을 일으키고 흡입하면 치명적입니다
중탄산나트륨	Acros Organics	424270010
에틸-아세테이트	모든 소스		컬럼 크로마토그래피
n-Hexane	모든 소스		컬럼 크로마토그래피용
Bulb-to-bulb (Kugelrohr) 증류 장치	Bü chi		모델 유형: 유리 오븐 B-585
실리카겔	Carl Roth GmbH	P090.2
메탄올	모든 출처		컬럼 크로마토그래피용
디클로로메탄	모든 소스		: 컬럼 크로마토 그래피
: 에탄올	: VWR Chemicals	20821.296
암모니아	유기물	428381000	7 N 메탄올의 용액
팔라듐	Aldrich	643181	15 % 습식
수소화 장치 : PARR	PARR Instrument Company
: Celite 503	Aldrich	22151
소결 유리 깔때기	어떤 출처
Thiophosgen	Aldrich	115150	참고: 피부에 자극적; 흡입하면 독성
Triethylamine	Alfa Aesar A12646
Dichloromethane	Acros Organics	348460010	엑스트라 드라이
자기 교반기	모든 소스
PAMAM G4 Dendrimer	Andrews ChemService	AuCS - 297	10% wt. MeOH
Lipophylic Sephadex LH-20	Sigma	LH20100
박층 크로마토그래피 플레이트	Merck Millipore	1.05554.0001
포름산	VWR Chemicals	20318.297
로필라이저	모든 공급원
Gadollinium (III) 염화물 육수화물	Aldrich	G7532
수산화 나트륨	Acros 유기물	134070010
pH 측정기	모든 공급
: 에틸렌 디아민 테트라 아세트산, 디 소듐 염 이수화물	Aldrich	E5134
질량 분석기 (ESI)	애질런트		이온 트랩 SL 1100
아세테이트 완충액	모든 소스		pH 5.8
Xylenol orange	Aldrich	52097	20 μ M 아세테이트 버퍼
Hydrophylic Sephadex G-15	GE Healthcare	17-0020-01
Amicon Ultra-15 원심 필터 유닛	Merck Millipore	UFC900324	Ultracel-3 막 (MWCO 3000)
원심분리기	모든 소스
NMR 분광계	Bruker		Avance III 300 MHz
Topspin	Bruker		버전 2.1
연소 분석 기기	EuroVector SpA		EuroEA 3000 원소 분석기
MALDI-ToF MS instrument	Applied Biosystems		Voyager-STR
Deuteriumoxid	Carl Roth GmbH	6672.3
tert-Butyl alcohol	Carl Roth GmbH	AE16.1
Vortex mixer	any source
Norell NMR tubes	Deutero GmbH	507-HP-7
NMR coaxial tube	Deutero GmbH	coaxialb-5-7
DLS 기기	Malvern		Zetasizer Nano ZS
0.20 μ m PTFE 필터	Carl Roth GmbH	KC94.1
HEPES	Fisher BioReagents	BP310
플라스틱 튜브 바이알	모든 소스
Dotarem	Guerbet		NDC 67684-2000-1
MRI 스캐너	Bruker		BioSpec 70/30 USR 자석(7 T). 참고: 높은 자기장과 관련된 잠재적 위험
RF 코일	Bruker		이중 주파수 볼륨 코일(RF RES 300 1H/19F 075/040 LIN/LIN TR)
Paravision(소프트웨어)	Bruker		버전 5.1