나노 PCR에 의한 동물 표본의 호흡기 병원체의 높은 처리량 검출

요약

나노 크기의 PCR에 의한 DNA 및 RNA 기반 병원균 높은 처리량 테스트는 syndromic 개와 말 호흡기 PCR 패널을 사용하여 설명한다.

초록

나노 리터 규모의 실시간 PCR 분석은 여러 서로 반응을 조합의 전형적인 결점없이 단판에 병렬로 실행할 수 있도록하기 위해 공간 다중화를 사용한다. 우리가 고안 빠르게 급성 호흡기 질환 개와 말 일반적인 질병 인자의 존재를 식별하기 위해 본 원리에 기초 패널을 평가 하였다. 이 원고는 마이크로 리터 규모의 반응과 다른 절차에 초점을 맞추고, 샘플 준비, 증폭, 및 목표 병원체 서열 분석을위한 나노 진단 PCR 워크 플로우를 설명합니다. 제시된 호흡 패널에서 18 분석법은 각 플레이트 당 48 샘플까지 수용, 세중 년에 설립되었다. 범용 추출 사전 증폭 플로 여러 매트릭스 및 DNA 및 RNA 기반 병원균을 수용하도록 높은 처리량 샘플 제제에 대해 최적화되었다. 대표적인 데이터는 하나의 RNA 대상 (인플루엔자 A 행렬)와 하나의 DNA 대상 (말 헤르페스 바이러스에 대해 제시1). 신속하고 정확하게 병원균의 포괄적 증후군 기반 그룹을 테스트 할 수있는 능력은 효율성과 진단 테스트의 능률을 향상 급성 호흡기 질환의 진단과 관리를위한 유용한 도구입니다.

서론

하나의 질병에 대한 테스트중인 샘플의 많은 사용하지 않는 인간과 동물에 대한 임상 적 진단에 여러 에이전트의 신속하고 포괄적 인 검출을위한 수요, 병원균 검출을위한 단일 생물 분자 진단 방법은 부담이다. 수의학 맥락에서 높은 처리량 진단 방법으로 인해 종의 다양한 병원체를 덮는 추가의 필요에 특히 중요하다. 세균의 수를 포함하는 테스트 요구의 예는 OneHealth 식중독 질환의 관리 및 신흥 병원체 감시 접근 바이러스 (DNA 또는 RNA가 기준), 기생충, 진균. 테스트 효율을 향상시키기 위해 함께 여러 분석 (다중화)에 대한 시험을 조합하는 과제는 감도의 가능한 손실 최적화 분석법 검증 큰 부담이다.

나노 리터 규모 실시간 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)은 바꾼다 인많은 별도의 반응이 동일한 샘플 ^(1)에서 동시에 실행할 수있는 다중의 연습 네이티브. OpenArray 플랫폼은이 원리 ^(2)의 응용 프로그램입니다; 이는 실시간 PCR과 마이크로 어레이 기술을 결합한다. 공간 다중화의 개념에 기초하여, 모든 샘플은 관통 구멍에 분리 대상의 다수를 위해 테스트된다. 이 플랫폼은 초기에 시아닌 기반의 이중 가닥 DNA 결합 화학 ^2와 함께 사용과 어두운 담금질 프로브 ^(3)를 사용하여 프로브 기반 화학에 대해 사용할 수 있습니다했다. 이 플랫폼은 주로 인간과 동물 ^{사 (5)에} 유전 적 프로파일을 위해 사용되어왔다. 이는 최근 Grigorenko 동부 등에 의해 혈액 유래 DNA 및 RNA 병원체를 검출하도록 하였다. ⁽⁶⁾ 두 단계 역전사 / 프리 앰프 (프리 앰프) 절차를 사용.

우리는 호흡기 병원체 초에서 두 종류의 검출 여기 원스텝 프리 앰프 기반 절차를 설명retions 및 표준 근무 전적으로 수행 될 수있는 다른 종류의 시료 다양한. 한 단계의 프리 앰프가 완료되면, 샘플이 나노 PCR 플랫폼과 함께 제공되는 자동화 된 액체 처리 시스템에서 허용하는 형식입니다 384 웰 플레이트로 전송됩니다. 이 시스템은 한 번에 최대 4 판 (192 샘플 및 제어)의 표면에 걸쳐 마스터 믹스 및 샘플을 그린다. 이로드 프로세스에 따라, 우리는 샘플을 증폭 한 인쇄 된 페이지에 맞는 테이블에 각 샘플 / 대상 조합에 대한 3 기술 복제의 평균을 요약하는 매크로 스프레드 시트를 사용하여 분석하는 방법에 대해 설명합니다.

이 플랫폼을 사용하여 시료에서 추출한 DNA 및 / 또는 RNA를 분석하는 균일 한 방법이 설립되었다. 샘플의 다양한 추출 역전사 및 오류의 가능성을 최소화하는 96 웰 형식으로는 예비 증폭 하였다. 테스트 호흡 샘플은 비강 면봉, 깊은 인두 면봉을 포함,트랜스 기관 세척, 기관지 세척 및 폐 조직. 또한 말초 혈액 또는 배설물에 존재할 수있는 테스트 에이전트의 일부 있기 때문에, 우리는 절차에 샘플의 그 유형을 통합. 이 간소화 된 워크 플로우는 개별 테스트 대신에 패널 기반의 병원체 및 독소 유전자 검출을 통해 효율적인 테스트를 가능하게함으로써 여러 판에서 실험을 실행에 비해 시간과 자원을 절약 할 수 있습니다. 여기에 입증 호흡 패널 (18) 분석은 각 플레이트 당 48 샘플까지 수용, 구멍을 통해 세중 인쇄했다. 검출 된 말 병원균 말 아데노 바이러스 1 및 2, 말 동맥염 바이러스, 말 비염 바이러스 A 및 B, 말 헤르페스 바이러스 (EHV) 유형 1 (4), 스트렙토 동등 포함. 송곳니 병원체는 개 호흡기 코로나 바이러스 (betacoronavirus), 개 디스템퍼 바이러스, 개 아데노 바이러스, 개 파라 인플루엔자 바이러스, 개 pneumovirus, 보르 데 텔라 브론 키셉 및 마이코 플라즈마 cynos 포함되어 있습니다. 에이범용 인플루엔자는 분석과 내부 통제 (MS2의 RNA 파지)도 포함되었다.

프로토콜

어떤 사람을 대상으로 또는 실험 동물이 프로토콜의 개발에 사용되지 않았다. 컨트롤은 시퀀스 확인 증폭의 정제에 의해 RNA 목표에 대한 시험 관내 전사에서 발생했다. 임상 샘플은 코넬 동물 건강 진단 센터에 일상적인 진단 테스트를 위해 제출되었다.

1. 플레이트 디자인

1. 각각의 분석은 프라이머 프로브 테스트 도구를 사용하여 60 ℃로 어닐링 표준 프로브 기반 실시간 PCR 순환 조건에 부합하는지 확인하기 위해 프라이머 설계 소프트웨어를 사용 (기본 매개 변수를 설정 정량화 프로브를 선택).
   참고 :. 사용되는 대표적인 RNA 대상은 보편적 인 인플루엔자 슈 등에 의해 발표 된 매트릭스 대상으로 분석 ^7에서 적응했다. 다음과 같이 프라이머 및 프로브는 다음과 같습니다 앞으로 프라이머 : AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA, 프로브 : 팸 - TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-QSY GACCRATCCTGTCACCTCTGAC는, 프라이머 역. 여기에 사용되는 대표적인 DNA 분석 이리저리 적응시켰다엘리아 등이 발행 한 말 헤르페스 바이러스 1 형 (EHV-1) 검출 방법을 해요. ^8. 다음과 같이 프라이머 및 프로브는 다음과 같습니다 앞으로 프라이머 : CTTTACCCAGGCCCTTGAAA, 프로브 : GCTCTCAGGTTTTACGACATC는, 프라이머 역 FAM-TCAACGTGGACAATACCGCAGTGATTAT-QSY합니다.
2. 원하는 구성에 나노 크기의 PCR 증폭 접시를 주문하십시오.
   참고 : 본 연구를 들어, 18x3 유전자 발현 포맷이 사용되었다 (표 1). 제조업체에 각 대상에 대한 모든 프라이머 및 프로브 (또는 인벤토리 분석 아이디)에 대한 시퀀스를 제공합니다.

2. 핵산 추출

1. 원하는 방법으로 총 핵산 (DNA 및 RNA)를 추출합니다.
   참고 : 자동화 된 자기 비드 기반 추출 키트 제조업체의 지침에 따라 여기에 사용되었다 (자세한 내용은 재료 표 참조).
2. 다음과 같이 샘플을 준비 :
   1. 철저하게 10 % 표백제 및 건조 각 시료 용기의 외부를 청소합니다. 장갑을 낀 F를 닦아교차 오염을 방지하기 위해 샘플 사이 10 % 표백제와 INGER 팁.
   2. 장소 비강 또는 식염수를 몇 방울 (예 : 빨간색 위쪽 혈관 등) 모든 멸균 밀봉 된 유리 병에 깊은 인두 면봉 처리하기 전에 탈수를 방지하기 위해 추가.
      참고 : 코튼, 플라스틱, 목재 처리 및 쿠론 및 기타 합성 면봉 모두 허용하지만, 칼슘 알긴산 면봉을 피하십시오.
   3. 액체의 적어도 1-2 ml를가되도록 면봉과 기관 세척의 경우, 둘 베코의 수정 독수리 중간 (DMEM)를 추가합니다. 튜브에 적극적으로 면봉과 DMEM을 소용돌이. 그런 다음 새로운 튜브에 미디어의 약 1 ml에 전송 피펫을 사용합니다.
   4. 825 x g에서 3 분 동안 원심 분리 한 다음 제조사의 지시에 따라 조직을 교란하여 기계적를 Lyse 조직 (DMEM 1 ㎖에서 100 ~ 200 mg)을 얻었다. 새로운 튜브에 뜨는 500 μl를 전송합니다.
   5. 배설물, 1X 인산 완충 SA 800 μL와 대변의 400 mg의 결합선 pH가 7.4 (PBS). 샘플이 균질화 또는 완전히 중단 될 때까지 1 분 이상에 대한 정지를 소용돌이. 일단 균질화, 새로운 튜브에 400 μl를 전송, 18,000 XG에서 10 분 동안 현탁액을 원심 분리기.
   6. 전체 uncoagulated 혈액 샘플 와동과 250 μL 나누어지는을합니다. 혼합 용균 시약과 소용돌이의 여섯 방울을 추가합니다. 37 ° C에서 15 분을 품어.
3. 제조업체의 지침에 따라 용해 및 세척 버퍼를 준비합니다. MS2 파지 또는 내부 긍정적 추출 제어 ^(9)로 용해 버퍼에 선택의 내부 컨트롤을 추가합니다.
4. 각 비드 튜브에 용해 버퍼 235 μL와 (음성 대조군 또는 PBS) 시료 175 μl를 추가합니다. 제조 업체의 프로토콜을 진행합니다.
   주 : 정제 총 핵산 90 ㎕를 여기에서 용출되었다.

3. 역 - 전사 / 프리 앰프 (프리 앰프)

참고 :에 사용 된 모든 시약 및 샘플을 유지항상 얼음에 프리 앰프 반응. 프리 앰프는 다음 실온에서 모든 시약을 유지한다.

1. 용출 DNA 및 / 또는 RNA, PCR 반응 믹스 클레아없는 물 대조군으로서, 양성 증폭 제어 풀링 기준을 조립한다.
   참고 : 48 샘플까지 컨트롤을 포함하는 증폭 판에서 실행할 수 있습니다 (샘플을 뽑아 처가되는 각각의 추출 판 적어도 하나의 부정적인 추출 제어 포함).
2. 샘플 맵을 인쇄합니다. 지도 및 샘플 레이아웃 일치하는 두 번째 사람 점검을해야합니다.
3. 1.5 ㎖의 튜브에, 상기 프리 앰프의 마스터 믹스를 제조 다음 추가한다.
   참고 : 14 ㎕의 최종 부피가 여기에 사용 하였다.
   1. 각 타겟의 혼합 프라이머의 풀을 추가되도록 각 프라이머의 최종 농도는 900 ㎚이다.
      참고 : 여기에 사용 된 풀은 10 배 농도로 제조하고, 1.4 ㎕의 반응에 따라 추가되었습니다.
   2. 600 nm의 또는 0.1X의 최종 농도 랜덤 프라이머를 추가합니다.
   3. 최종 부피의 절반 (7 μL 여기)를 2 배 RT-qPCR에 믹스를 추가합니다.
   4. 부드럽게 텍싱 아래로 회전시켜 함께 마스터 믹스 구성 요소를 섞는다.
4. 판 단 (열 1-6)의 왼쪽을 사용하여 표준 96 웰 플레이트에서 프리 앰프를 수행합니다.
5. 프리 앰프 마스터 믹스의 8.5 μl를 각에 DNA / RNA 샘플의 5.5 μl를 잘을 추가합니다.
6. 모든 시약 (샘플, 양성 대조군 및 프리 앰프 믹스와 음성 대조군)를 조합 한 후, 철저하게 명확한 접착 물개 표준 96 웰 플레이트를 밀봉. 사이클링 동안에 시일 간극의 형성을 방지하도록 면도날을 사용하여 초과 시일을 제거한다. PCR의 판 스피너를 사용하여 20 초 동안 밀봉 판을 원심 분리기. 모든 시약이 판 우물의 바닥에 결합되도록 확인합니다.
7. 다음과 같은 조건에서 기존의 열 순환기에 프리 앰프 분석을 실행 : 50 ° C에서 15 분; 95 ° C에서 1 분; 95 ° C, 다음 2 분 60 ℃에서 15 초 20주기; 99.9 & #176 10 분 C; 4 ° C에서 개최합니다. 프로그램을 시작하기 전에 이러한 조건.
8. 종래의 열 순환기를 켜고 프리 앰프 순환 프로그램을 선택하고 프로그램을 시작합니다. 열 순환기 (안 커버)의 바닥 부 화면에 판독 온도를 모니터링하여 cDNA를 생산 (50 ° C)에 요구되는 온도에 도달 할 때에 만 열 순환기에서 96 웰 플레이트를 놓는다. 이에 앞서, 위양성 결과가 발생의 위험을 최소화하기 위해 콜드 플레이트를 유지한다.
9. 프리 앰프 실행이 완료되면, 플레이트를 밀봉 남아 있는지 확인합니다.
10. 4.1 단계로 바로 진행합니다. 하룻밤이 판을 저장하는 대신 느슨하게 판을 덮는 것을 제외하고, 단계 4.2 ~ 4.5에 설명 된대로 희석을 수행하려면, 4 ℃에서 보관 지퍼 잠금 가방 안에 명확한 접착제 시일과 장소, 함께 접시를 밀봉.

프리 앰프 플레이트 4. 희석

1. 이리저리 증폭 판의 해당 번호를 제거냉장고 (4까지 한 번에 실행할 수 있습니다)를 해요. 포장을 열지 마십시오. 플레이트는 실온에서 적어도 15 분 동안 워밍업합니다. 플레이트의 일련 번호와 로트 번호를 기록합니다.
   참고 : 미개봉 판은 24 시간까지 실온에서 남아 있지만 가장 좋은 방법에 대해 이전에 필요하지 더 이상 분 (30)보다 냉장고에서 이들을 제거 할 수 있습니다.
2. PCR을 판 스피너를 사용하여 20 초 동안 완성 된 프리 앰프 판을 원심 분리기. 증폭 기계와 컴퓨터를 켜고 관련 프로그램을 시작합니다.
3. PCR의 설정 영역에서 불필요한 항목을 제거합니다. 이중 장갑 및 슬리브 커버를 착용 할 것.
4. 프리 앰프 판에서 봉인을 제거하고 조심스럽게 제거하고 외부 장갑을 폐기합니다. 로 pipetting 아래로 열이 96- 웰 플레이트 프리 앰프의 1-6 및 혼합의 각 웰에 TE 완충액 56 μL를 첨가하여 5 : 1의 프리 앰프 제품을 희석. 바닥에서 흡입 이상까지 분배하지만 작성하지 만 피펫의 첫 번째 정류장으로 이동거품입니다. 사용하지 않는 우물에 관계없이 모든 6 컬럼에 TE 버퍼를 추가합니다.
5. 명확한 접착제 또는 호일 씰 중 하나와 함께 접시를 봉인하고, PCR 플레이트 스피너를 사용하여 20 초를 원심 분리기. 옆이 판을 설정 (느슨하게 적용) 단계 6.1가 완료 될 때까지. 나머지 장갑 및 슬리브 커버를 폐기하십시오.

증폭 플레이트에 384 웰 전송 5. 준비

1. 뚜껑, 플러그, 침지 유체, 판 프레스, 에탄올 물총 병, 및 보풀이없는 실험실 와이프의 주사기 : 증폭 플레이트를 커버하고 밀봉하는 데 필요한 자료를 설정합니다. (힘이 필요합니다) 주사기 캡을 제거하고 주사기에 작은 플라스틱 팁을 잠급니다. 공기 축적을 제거하는 종이 타월 상에 침지 액을 소량 꺼내 (일부 작은 기포가 팁에 남아 있다면 그것은 OK 임). 진공 밀봉 알루미늄 백에서 주사기를 제거 60 분 내에 침지 유체를 사용한다. 주사기가 개방되면, 나중에 사용하기 위해 뚜껑을 재 부착되지 않는다.
2. 검사판 로딩 액체 핸들러의 쓰레기통이 비어와 팁의 상자를 열고있다. 새로운 상자가 열립니다 팁 상자 덮개의 팁의 유효 기간을 쓰기 및 팁이 만료되지 않도록. 액체 핸들러와 컴퓨터를 켜고 자체 테스트를 수행 할 액체 처리기 소프트웨어를 엽니 다.
3. "설정 및로드"를 클릭합니다. 샘플 트래커 소프트웨어에서 생성 된 csv 파일을 선택하려면 "찾아보기"를 클릭합니다. 파일이 표시되지 않는 경우, "악기 / 편집 환경 설정"으로 이동 한 다음 "샘플 플레이트 파일 폴더"에 의해 "변경"을 클릭합니다. CSV 파일이 저장된 폴더를 선택합니다. 그런 다음, "찾아보기"파일을 선택, "설정 및로드"를 클릭합니다.
4. 다음, 옆에있는 "플레이트 홀더 위치 (1)"을 "찾아보기"를 클릭하고 판과 동일한 일련 번호가 (제조업체에서 제공)를 TPF 파일을 선택합니다.

6. 액체 처리기 전송

참고 : 파이를 시작하지 마십시오위의 모든 단계가 완료 될 때까지 384 웰 플레이트를 lling. 증발 작은 볼륨과 관심사 - 384 웰 플레이트 내부 액체로 발견 앉게하지 않습니다.

1. 일단 위의 모든 단계는 새로운 잘 장착 이중 장갑을 넣어 완성 및 슬리브 커버. 그 후, 384 웰 플레이트에 증폭 마스터 믹스의 2.5 μl를 추가합니다.
2. 표 2의지도에 따라 384 웰 플레이트에 희석 프리 앰프 제품의 2.5 μl를 전송하고 즉시 호일 씰 단단히 판 커버. 외부 장갑 및 슬리브 커버를 폐기하십시오.
3. 원심 분리기 PCR 플레이트 회에서 20 초 동안 384 웰 플레이트.
4. 호일 씰을 제거 할 수 있지만 액체 처리기에서 384 웰 플레이트를 설치하지 마십시오.
5. 쌌다 증폭 플레이트를 포함하는 패키지를 열고 오른쪽에있는 일련 번호와 첫 번째 슬롯의 액체 핸들러에서주의 깊게 배치 - 표면 O를 건드리지 않고 가장자리 경우를 개최판 바. 개방 1 시간 이내에 풀어 플레이트를 사용합니다.
   주 : 케이스의 목적은 접촉되는 판을 보호하는 것,이 관통 구멍의 내부 프라이머 및 프로브의 소량을 방해 할 수 있기 때문이다.
6. 모든 장소에 일단 액체 핸들러 내부의 384 웰 플레이트에서 호일 씰을 제거합니다. 다음을 클릭하고 각 단계가 완료되면 모든 확인란을 선택합니다. 실행을 시작하려면 확인을 클릭합니다.
7. 액체 처리기에 문을 닫고 즉시 충전 프로세스를 시작합니다. 액체 핸들러 옆에있어 플레이트가 작성되면 바로 다음 단계로 진행합니다.
8. 액체 핸들러가 실행되는 동안, 케이스 덮개의 바닥에서 보호 필름을 제거합니다.
   주 : 상기 케이스 뚜껑의 하단 접착제는 적색 테이프 및 보호막으로 덮여있다. 이 영화는 빨간 테이프에 액세스 할 수 먼저 제거해야합니다.
   1. 단계 6.15까지 장소에서 최고의 영화를 둡니다. 업데이트 버전에 약간 당겨 총리 빨간 테이프접착제에서 그것을 전자.
9. 액체 처리기에서로드 (충전) 증폭 플레이트를 제거하고 부드럽게 오른쪽에있는 일련 번호 판 보도에 넣습니다.
10. (플레이트쪽으로 향하고) 하단의 권리와 접착제의 홈 부분을 접시 위에 뚜껑을 놓습니다.
11. 신중하게 닫을 판 보도 레버를 아래로 당겨; 빛이 20 초 동안 깜박입니다. 이 시간 동안 판 보도를 만지지 마십시오. 표시등이 녹색으로 변되면, 조심스럽게 레버를 들어 올려 조심스럽게 가장자리를 잡고 밀봉 된 플레이트를 제거합니다.
12. 케이스의 가장자리를 수직으로 밀봉 증폭 판 채 바로 케이스의 단부에서로드 포트에 주사기 팁을 삽입 후, 플레이트 사이의 공간을 채우도록 한 부드러운 연속 동작으로 천천히 침지 유체를 분배 뚜껑. 플레이트가 침지되면 구석에 작은 공기 방울을 둡니다.
13. 시간을 계속하면서이전 플레이트 수직 모서리, 핸들이 끊기는까지 충분한 압력을 가하여 포트에 플러그를 삽입하고, 플러그를 시계 방향으로 꼬아 선적항 밀봉. 그립 케이스의 가장자리가 단단히 핸들 파괴의 힘은 경우 드롭 발생하지 않도록. 접시가 제거 될 경우이를 폐기합니다.
14. 보풀이없는 것을 닦아 충분히 에탄올로 분사 된와 케이스를 청소합니다. 케이스를 건조하기 위해 닦아 깨끗한와 아래 케이스를 닦으십시오. 부드럽게 경우를 처리; 우물 위의 유리에 압력을 가하지해야합니다.
15. 증폭 기계 밀봉 판을 가져옵니다. 은 "악기"탭에서 "악기 콘솔"을 선택합니다. 다음 증폭 시스템을 선택 "열기 문"버튼을 클릭합니다.
16. 어댑터가 올바르게 왼쪽 상단 모서리에있는 A1으로 줄 지어 것을 확인, 플레이트 어댑터의 첫 번째 슬롯에 증폭 판을 놓습니다. 바코드와 함께 접시가 위로 향하게쪽으로 방향악기의 앞. "닫기 도어"버튼을 클릭합니다. 어댑터 트레이를 사용하는 주 - 10 용도의 한계가있다.
17. 화면 하단의 홈 탭에서 실행 메뉴에서, OpenArray을 선택합니다. "플레이트 ID를 가져 오기 '를 클릭합니다. 빈 상자가 자동으로 판에 대한 정보로 채워집니다. 실행을 시작하려면 "시작 실행"을 클릭합니다.
18. 액체 처리기 소프트웨어를 닫고 액체 핸들러를 해제합니다. 팁 랙을 통해 팁 덮개를 놓습니다. 폐기물 빈에서 팁을 취소하고 청소. 깨끗하고 가공면, 피펫, 폐기물 양동이, 및 팁 상자를 포함하여 모든 항목을 오염을 제거.
19. -20 ° C에서 명확한 접착 밀봉 저장과 프리 앰프 판을 다시 봉인.

7. 결과 분석

1. 실행이 완료되면, 파일을 저장하고 파일을 닫습니다 화면의 하단에 실행 이름으로 탭의 "X"를 클릭합니다.
2. "오픈 도어를 클릭"문을 열려면 화면 상단에. 더 침지 액이 누출이 없는지 확인, 증폭 플레이트를 제거합니다.를 클릭"문을 닫으려면 화면 상단 도어를 닫고 ".
3. "열기"를 클릭하여 열어 실행 파일을 선택합니다. 녹색 화면의 오른쪽 상단에있는 버튼을 분석 누릅니다. (.txt 파일로) 결과를 내보내려면 다음 왼쪽 화면의 측면과 "시작 수출"의 "내보내기"를 클릭합니다. 이 열린 후 파일을 최소화합니다. 그런 다음, "수출 QC 이미지"를 클릭하십시오.
4. 하기 기준에 따른 이미지 분석 프로그램 QC 이미지를 검토
   1. 더 어두운 반점이나 얼룩이 없는지 확인하여, PRE-READ_CHANNEL_4.tiff 및 POST-READ_CHANNEL_4.tiff를 사용하여로드의 품질을 평가합니다.
      참고 :이 채널에 의해 검출 된 염료는 반응이로드 될 때 용액에 해제 프라이머 및 프로브의 제조 업체에 의해 추가됩니다. 이 채널의 독서는 반응이 제대로되었음을 나타냅니다로드 염료와 혼합 프라이머 및 프로브는 존재있다.
   2. S02_C001_t03_p001_m1_x2_e1_cp 번호의 _spotfind.tiff를 사용하여로드 한 후 접시에 누출 또는 교반을 확인합니다. 이미지가 어둡게 보이는 경우 밝기 (Ctrl 키 + 시프트 + 컨트롤을 엽니 C) 전체 판을 보일 때까지 증가. 이미지가없는 그림자, 거품, 또는 치환 샘플 유니폼을 보이는 있는지 확인합니다.
   3. STAGE2_CYCLE1_CHANNEL_1.tiff 및 STAGE2_CYCLE40_CHANNEL_1.tiff를 사용하여 덮개 (밝은 부분) 아래 뚜껑 위치와 파편을 평가합니다.
5. 선택 사항 : 결과 매크로 (기업 코드 파일)를 포함하는 스프레드 시트를 엽니 다. 내 보낸 데이터 파일에서 마우스 오른쪽 화면 하단의 탭을 클릭하고 "이동 또는 복사"를 선택합니다. 은 "예약하기"필드에서 "Macro.xlsm 결과"를 선택합니다. 클릭하고 상자 "복사본을 만듭니다"를 확인 "끝으로 이동". 그런 다음 확인을 클릭합니다.
   1. 결과 매크로 옵션은 "예약하기"필드에 나타나지 않는 경우, 심플라이 보낸 데이터 파일 워크 시트의 내용을 복사 (모든 셀을 강조하기 위해 왼쪽 위 셀을 클릭하고 Ctrl-C를) 및 새 탭에 붙여 넣습니다.
6. 기존의 '내보내기'탭을 삭제 한 후 '내보내기'로 새로 추가 된 탭의 이름을 바꿉니다.
7. "Alt 키 F8"을 클릭 (또는 다음 매크로보기를 클릭) 한 다음 "매크로"를 선택하고 "실행"을 클릭합니다. 그런 다음 "Alt 키 F8"다음 "Macro2"을 선택하고 "실행"을 클릭을 클릭하여 Macro2에 대해이 작업을 반복합니다.
8. 관련 정보 (날짜와 일련 번호)를 사용하여 결과 매크로 파일의 이름을 변경, 위의 테이블에이 정보를 입력하고 내 보낸 결과 폴더에 같은 파일 이름으로 저장합니다. 마지막으로, 매크로 생성 결과 표를 출력한다.
9. 증폭 컴퓨터 소프트웨어, 화면 왼쪽 분석 / 증폭 플롯을 선택하여 매크로 테이블에 대해 각각의 샘플 및 제어 커브를 확인한다. 그런 다음, 샘플 탭을 선택하고 각 샘플을 클릭표에서 긍정적 인 결과의 각각에 대해 2 또는 3 개의 긍정적 증폭 곡선이 있음을 확인한다.
10. 증폭 기계의 전원을 끕니다.

결과

결과는 양성 대조군 및 일상적인 진단 시험에 제출 된 임상 샘플의 조합으로 대표 RNA 분석 (인플루엔자 매트릭스) 및 DNA 분석 (EHV-1)에 대한도 1 및도 2에 나타내었다. 이 일반적인 반응에 걸쳐 방출 된 형광 신호는 사이클 당 원료 형광 값을 나타내는도 1에 도시된다. 모든 상대 사이클 역치 (CT)의 값을 자동 증폭 시스템 소프트웨어에 의해 생성되었다. 배경 형광이 코네티컷 값을 계산하기 전에 형광 측정으로 통합보다는 적재 품질 평가를위한 별도의 측정을 사용한다.

각 대상에 대한 탐지의 분석 한계 (LOD)를 계산 컨트롤 풀에있는 코네티컷의 95 % 검출 레벨의 값을 더한 2 표준 편차의 전체 평균에 기반모든 대상. 복제의 적어도 95 %는 대표적인 분석법 양성인 최고 희석액 50 복제본이었다; 5 사본의 검출은 복제의 50 %에 성공했다. 어느 분석은 아래의 사본에서 검출되었다. RNA의 및 DNA 분석을위한 LOD를은 21.92과 20.05의 코네티컷의 값으로 계산 하였다. 이러한 값은 용의자 대 포지티브 (잠재적되지 반복)을보고 값에 대한 컷오프로 간주 하였다.

타겟의 분석 성능의 다른 측면은 세 가지 일 (도 2)에서 실행 풀링 양성 대조군의 희석액을 사용하여 평가 하였다. 대표 RNA 및 DNA 분석의 평균 효율은 101.1 %와 106.6 %였다; 모든 대상에 대한 전체 평균 효율은 101.3 %였다. 분석법도 좋은 선형성 (> 0.98 R ^2)를 가지고 있었다. 복제 내에서 변화는 관통 구멍 일반적으로 모두 임상 샘플 0.2의 표준 편차 내에하던D 제어합니다. 타겟 중간에 교차 반응은 관찰되지 않았다.

보조 파일의 최종 결과 워크 시트 (10) 임상 진단 샘플과 4 컨트롤의 대표 양적 결과를 보여줍니다. 임상 샘플은 샘플의 종류의 서브 세트는 통상적으로 비강 / 인두 면봉, 폐 조직, 분변 시료를 포함한 시험된다. 이 세트의 한 (말) 분변 샘플은 샘플 억제제의 존재를 나타내는 실패 MS2 내부 통제를 보여줍니다. 이것은 일반적으로 용출 샘플 및 / 또는 재 추출의 희석에 의해 관리됩니다. 여기의 경우와 같이, 음의 증폭 제어를 모든 타겟 제외해야하며, 음의 추출 제어는 내부 제어를 포함한다. 임상 설정에서, 샘플 betacoronavirus, 보르 데 텔라 브론 키셉, 개 디스템퍼 바이러스 A, 개 파라 인플루엔자 바이러스, 개 pneumovirus, 인플루엔자에 대한 코네티컷 값을 생성에이.

도 1 증폭 플롯. 형광 표시는 RNA 분석 (A) 및 DNA 분석 (B)에 대한 증폭 사이클에 대해 도시된다. 삼각형이 코네티컷 값을 나타내는 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2. 표준 곡선. 세 가지 다른 일 테스트에서 RNA 및 DNA 분석에서 표준 곡선은 긍정적 인 컨트롤을 사용하여 증폭의 선형성과 범위를 설명하기 위해 그려진다. 사이클 임계 값 (CT) 값 RNA (A) 또는 DNA의 카피 수의 로그 (10) (에 대해 플롯 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

증폭 플레이트와 타겟 위치 표 1. 회로도.이 플랫폼 나노 실시간 PCR 시험에 사용되는 판은 현미경 슬라이드 크기 및 관통 구멍 3,072 개의 관통 구멍 (64)의 48 개의 서브 어레이로 배열되고 개별 반응합니다. 한 부분 배열은 세중의 18 목표로, 여기에 표시됩니다. 각 샘플은 액체 핸들러에 의해 하나의 부분 배열에 추가됩니다. 플레이트 표면 장력을 통해 관통 구멍의 시약을 보유하는 친수성 및 소수성 화합물로 코팅된다. 스테인레스 칩 "은 포토 리소그래피 패터닝되고 3072 마이크로 머신, 320 μm의 diamete의 직선 어레이를 형성하기 위해 습식 에칭. 다음과 같이 연구 대상 33 NL 각각 ^"2 약어의 구멍은 : BCOR, 송곳니 호흡기 코로나 (betacoronavirus) BORD, 보르 데 텔라 브론 키셉 CAV, 개 아데노 바이러스를, CPIV, 개 파라 인플루엔자 바이러스, CPNV, 개 pneumovirus, DISTA / B, 송곳니 디스템퍼 바이러스 A와 B, EADV1 / 2, 말 아데노 바이러스 2, EAV, 말 동맥염 바이러스, EHV1 / 4, 말 헤르페스 바이러스 유형 1/4, ERVA / B, 말 비염 바이러스 A / B, IVM, 인플루엔자 매트릭스; MCYNOS, 마이코 플라즈마 cynos, MS2, 내부 통제 (MS2의 RNA 파지) SEQU, 연쇄상 구균 동등.

표 2 플레이트 전사지도. 384 웰 플레이트의 96 웰 플레이트에서 프리 앰프에 전송하는 고정 8- 채널 피펫을 사용하는 컬러 코딩 된 전사 플레이트 맵이 도시되어있다. 대안으로, 조정 가능한 피펫이 사용될 수있다. 동일한 절차가 시간에 관계없이 매번 수행 유동 많은 샘플 플레이트에 있습니다.

추가 파일. 요약 테이블에 서식 결과 두 매크로가 포함 된 매크로 사용 스프레드 시트 파일 (프로토콜에 설명 된대로) 제공됩니다. 매크로에 의해 생성되는 전형적인 결과 테이블 (최종 결과 아래) 파일에 포함된다. 두 매크로는 샘플 이름을 첫 번째 열의 (48 샘플까지)과 긍정적 인 결과에 그들을위한 각 대상에 대한 세 가지 코네티컷 값의 평균을 작성합니다; 증폭하지 않았다 대상이 테이블에 빈 표시 있습니다. 이것은 쉽게 종이 한 장에 인쇄하고 효율적 원시 데이터를 확인하기위한 기준으로 사용될 수있다. 최종 결과 탭에서 10 임상 샘플 및 4 컨트롤에 대한 대표적인 결과가 표시됩니다. 분석 이름에 대한 요약은 표 1의 전설에 나열되어 있습니다.www.jove.com/files/ftp_upload/54781/supplemental_code_file_R1.xlsm "대상 ="_ 빈 ">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

이 절차 여섯 개월 (주 2 ~ 3 회)의 과정을 통해 우리의 실험실에서 호흡기 병원체의 일상적인 테스트를 위해 사용되어왔다. 또한 별도로 정의 접시 분변 시료 및 박테리아 균주의 장내 병원균 프로파일과 동일한 방법을 사용하여 성공이 있었다. 플레이트가 생성되면, 경험이 풍부한 직원은 하나의 표준 근무 시간 내에 2-7 단계를 완료 할 수 있습니다. 가장 중요한 단계는 프리 앰프 플레이트의 적절한 시일 (증발을 방지하기 위해 신속하게 수행되어야한다) 플레이트 사이 프리 앰프를 샘플들의 전송 및 증폭 판의 최종 덮고있다. 이 크게이 공정에 필요한 시간 및 서류의 양을 환산 결과 분석 (샘플 및 컨트롤 곡선을 확인)을위한 가이드로서 매크로 스프레드 시트의 사용은 중요 하였다. 제공되는 매크로 스프레드 시트는 예입니다; 서로 다른 구성으로 플레이트에 대한 수정 또는 재 작성 될 필요가있을 것이다. 이것은 쉽게 체육 될 수 있습니다기본 스프레드 시트 지식을 가진 사람이 rformed.

인해 증폭 판 (33 NL)에로드 시료의 미량으로 미리 증폭이 요구된다. 이 프로토콜 (미도시)의 최적화에서는 종래 증폭 마스터 믹스, 랜덤 프라이머의 첨가, 횟수, 소둔 시간, 희석 포함한 프리 앰프 파라미터의 개수를 비교 하였다. 각각의 목표는 자신의 최적의 조건을 가지고 있었고, 여기에 기술 된 우리의 패널에 대한 검색 전체의 최고 한도를 산출하는 사람들을 나타냅니다. 이 패널은 병원성 목표와 일상적인 의학적 진단 테스트에서 발생하는 샘플 종류의 넓은 범위를 커버하지만, 프리 앰프 절차에 대한 수정은 다른 패널 필요할 수 있습니다. 제조자 최적화 증폭 조건은 95 ° C에서 앤 변성이어서 95 ° C 효소 활성에서 10 분으로 표준 프로브 기반 실시간 PCR 프로토콜에 기초60 ° C에서 일링은 / 확장. 프라이머 및 프로브는 또한 미리 인쇄 제조업체 최적화 조건을 이용하여 적정하므로 필요하지 않은 판에있다. (상관없이 타겟의 종류) 모든 샘플에 대해 역전사 사전 증폭 단계를 결합함으로써 워크 플로우의 효율성을 유지하기 위해 필요했다. 모든 샘플은 전사 역 갖는 것은 또한 감도를 극대화하기위한 유용합니다. 또한 최소화 억제제에 최적화 된 프리 앰프를위한 마스터 믹스의 사용은 동일한 플레이트 상에 상이한 종류의 시료 조합에 다양성을 허용한다.

질병 통제 (CDC) 나노 리터 규모의 반응 여기 슈 등. ^(7)에 의해 기술 및 적응 인플루엔자 매트릭스 분석 센터는 범용 인플루엔자 인간과 반려 동물에서 테스트 샘플에 적합한 분석이다. 이것은 마이크로 리터 규모 REA을 사용하여 모든 인플루엔자 바이러스의 매트릭스 유전자의 범용 검출 설계된ctions. 그것은 CDC 인간 인플루엔자 바이러스 패널과 CDC 돼지 독감 패널의 일환으로 전 세계적으로 사용되어왔다. 여기에 적응 EHV-1 분석 ⁸ 낙태 및 신경 학적 질환 (Pusterla와 Hussey는 ¹⁰ 검토)를 일으킬 수 있습니다 말의 중요한 호흡기 병원체를 검출한다. 종 독립적 내부 제어와 높은 처리량 플랫폼 테스트를 적응의 의미는 그들이 OneHealth 감시 방법에 통합 될 수 있다는 것이다. 높은 처리량 테스트 플랫폼에서 이러한 분석을 모두 갖는 것은 임상 시설, 대피소 및 성능 이벤트에 대한 비상 대책을 촉진 할 것이다.

상기 결과는 분석 성능이 상당히 변화를 보였다 마이코 cynos 제외 가진 플레이트상의 모든 표적을 대표했다. 이는 이상적인 58-60 및되어야 프라이머 차선의 용융 온도 (T의 _m)에 것 같았다# 176; C (이상적인 프로브 (Tm)가 68-70 °에 C)입니다. 이 플랫폼의 한계는 신속 시퀀스를 변경하는 능력을 제한 개별 프로브를 주문하는 것보다 판을 설계하고 제조하는 것이 더 오래 걸리는 점이다. 일반적으로 실시간 PCR의 다른 제한은 신규 한 또는 예기치 않은 병원체를 검출 할 수 없다는 것이다. 이것은 여러 종류의 서열과 일치 분석을 설계함으로써 어느 정도 극복 될 수 있지만, 편향 총 유전체 기반의 방법은 새로운 에이전트 발견 더 적합하다. ^11,12

나노 실시간 PCR을위한 새로운 패러다임을 허용 증후군 기반의 높은 처리량 분자 진단 시약 및 노동 비용을 절감하는 데 유용 종 기반의 테스트보다는. 이 방법에 의하여 대형 패널 테스트는 던 및 Gurfield ¹³ Moutailler 외. ^(14)에 의해 기재된 것과 같은 OneHealth 감시 활동을 용이하게 할 수있다. 초기 면봉 샘플 수집,일반적으로 임상 발병 3 일 이내에, 호흡기 병원체의 존재를 확인하는 가장 좋은 기회를 제공합니다. 감염증 출현은 종종 예측 불가능하고, 시약의 변형 없이도 다른 종에 대해 수행 할 수있는 테스트가 준비 이상적이다. 이 기술의 미래 애플리케이션 pathotyping, 항생제 내성 프로파일 및 상기 신드롬 - 기반의 임상 진단 패널에있을 가능성이 높다. 나노 실시간 PCR 여러 샘플 병원체 유형의 신속한 고 처리량 스크리닝에 가장 유용하고 새로운 긴급 병원체를 식별하기위한 바이어스 또는 부분적으로 바이어스 시퀀싱 기반 접근법에 의해 보완 될 것이다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Zap-OGlobin II 용해 시약	Beckman Coulter	7546138	혈액 샘플 준비를 위한 선택적 시약.
추출 키트(MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	AM1840	원하는 시료 유형에 적합한 다른 추출 키트로 대체할 수 있습니다. 이 키트에는 PBS, 용해 버퍼 및 세척 버퍼가 함께 제공됩니다.
2x One-Step RT-qPCR mix(qScript, XLT, One-Step RT-qPCR, ToughMix)	Quanta Biosciences	95134-500
유전자 특이적 프라이머 풀	IDT	맞춤형 주문	: 사용자가 생성하거나 증폭 플레이트와 함께 구매할 수 있습니다.
무작위 프라이머 믹스	New England Biolabs	S1330S
표준 96웰 플레이트	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	N8010560	이 플레이트는 기존 PCR 기계에 맞는 모든 플레이트가 될 수 있습니다.
증폭 마스터 믹스(OpenArray 마스터 믹스)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4462164
투명 접착 씰	Thermo-Fisher	430611
Foil seal	Excel Scientific	AF-100
384웰 플레이트	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4482221
증폭 플레이트(QuantStudio 12K Flex OpenArray 플레이트)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4470813	표준 TaqMan 조건을 준수하는 모든 어세이로 맞춤화할 수 있습니다.
액세서리 키트	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4469576	케이스 뚜껑, 플러그 및 침수 유체가 포함되어 있습니다.
AccuFill 팁	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4457246
증폭 기계(QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR 시스템)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4471090
Liquid Handler(OpenArray AccuFill 시스템)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4457243	이것은 증폭 기계와 함께 구입합니다.
프라이머 설계 소프트웨어 (Primer Express)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4363991	자세한 프라이머 및 프로브 사양은 제조업체의 지침을 참조하십시오.
이미지 분석 프로그램(ImageJ)	NIH		http://imagej.nih.gov/ij/
스프레드시트 프로그램(Excel)	에서		사용 가능Microsoft https://products.office.com/en-us/excel
DMEM	Thermo-Fisher/Gibco	11965-092
조직 교란기(TissueLyser II)	Qiagen	85300
기존 열 순환기(Veriti)	에서 사용 가능Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4375786	가열된 뚜껑이 있는 기존의 모든 열 순환기를 사용할 수 있습니다.
PCR 플레이트 스피너	VWR	89184-608	이 장치는 단 하나의 속도(2,500rpm)만 가지고 있습니다. 로터는 뚜껑이 닫히면 시작되고 버튼을 누르면 멈춥니다.
TE 버퍼	Millipore	8890-100ML	10 mM 트리스 (하이드 록시 메틸) 아미노 메탄 염산염, 1 mM 에틸렌 디아민 테트라 아세트산, pH 8.0