HIV-1에 감염된 세포에서 엑소 좀의 SILAC 기반 단백체 특성

요약

여기서는 호스트 exosomal의 프로테옴에서 HIV-1 감염의 효과를 분석하기 위해, 세포 배양 (SILAC)의 아미노산이 안정 동위 원소에 의한 표지의 기술을 이용하여 정량적 프로테오믹스 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 쉽게 다른 스트레스 또는 감염 조건 하에서 세포에 적용 할 수있다.

초록

단백질체학은 단백질의 대규모 분석입니다. 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분광법(LC-MS/MS)과 같은 단백질체학 기술은 한 번에 수천 개의 단백질을 특성화할 수 있습니다. 이러한 강력한 기술을 통해 특히 세포가 감염, 스트레스 및 특정 테스트 조건과 같은 다양한 자극을 받을 때 세포 변화를 체계적으로 이해할 수 있습니다. 최근의 발전에도 불구하고 엑소좀 단백질체를 분석하는 것은 시간이 많이 걸리고 종종 복잡한 방법론이 필요합니다. 또한 결과적으로 생성된 대규모 데이터 세트는 연구원이 추가 다운스트림 연구를 수행하기 위해 강력하고 간소화된 분석이 필요한 경우가 많습니다. 여기에서는 세포가 HIV-1에 감염되었을 때 엑소좀 단백질체를 특성화하기 위한 SILAC 기반 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 방법은 간단한 동위원소 라벨링, 차등적으로 라벨링된 세포에서 엑소좀의 분리, 질량 분석 분석을 기반으로 합니다. 그 다음에는 단백질체 유효 물질에 대한 자세한 데이터 마이닝 및 생물 정보학 분석이 이어집니다. 결과 데이터 세트 및 후보는 이해하기 쉬우며 다운스트림 분석에 유용한 풍부한 정보를 제공하는 경우가 많습니다. 이 프로토콜은 다른 세포 내 구획 및 광범위한 테스트 조건에 적용할 수 있습니다.

서론

바이러스 감염을 포함한 많은 인간의 질병은 종종 및 영향을받는 세포 주위에 발생하는 독특한 세포 과정과 연결되어 있습니다. 단백질은 종종 이러한 과정을 중재 궁극적 이펙터 세포로서 작용. 단백질의 분석은 종종 영향을 세포의 지역 환경에 관한 귀중한 정보를 제공하고 질병 발병의 기본 메커니즘을 이해하는 데 도움이 있습니다. 다양한 단백질 분석 기법 중 프로테오믹스 특히 큰 약속을 보유하고있다. 강력한 대규모 도구로서 특히 프로테오믹스 기능과 단백질의 상호 작용의 영역에서 세포 과정의 체계적인 이해를 제공 할 수있다. 특정 단백질을 분석하여 조사 부위에서 연구자들은 세포 성분, 특히 단백질의 발현을 모니터링 할 수 있도록 분류 기술의 개발을 간단하게한다. 많은 프로테옴 분석은 세포에서 수행되었지만프로테옴 규모, 세포 내 구획에 단백체 특성화 ¹ 특히 유익한 것으로 판명했다. 이는 HIV-1 감염의 연구에서 잘들 수있다.

엑소 좀 셀 타입 ^{2, 3,} 광범위한 분비 30-100 nm의 막 소포 간 통신 및 분자 수송의 중요한 구성 요소이다. 이들은 이전에 HIV-1 신진 공정

프로토콜

1. 세포 배양 및 HIV-1 감염

참고 : 실험을 시작하기 전에,이 MTT 분석 ^(12)를 통해 트리 판 블루 염색 ^(11)를 통해 세포의 생존과 증식을 확인하는 것이 좋습니다. 또한 새롭게 준비 SILAC 매체를 사용하는 것이 중요합니다. 다양한 세포주가 활발하게 증식 단계에 있으며, HIV-1 감염, 또는 원하는 시험 조건에 민감한만큼 사용될 수있다. 이 프로토콜에서, 예로서, H9 세포주를 사용한다.

1. 각 세포 배양 플라스크에 종자 2 × ¹⁰⁶ H9 세포. 10 % 투석 된 소 태아 혈청 (FBS), 100 ㎎ / ℓ ⁽¹³⁾ C ₍₆₎ L- 라이신 및 100 ㎎ / ℓ ^{13 15} C ₆ N ₄ L 아르기닌을 함유하는 RPMI 1640 배지 10ml에 표시된 하나의 그룹으로 성장한다. 투석 FBS 10 %, 100 ㎎ / ℓ의 L- 라이신 및 100 ㎎ / ℓ L- 아르기닌과 함께 10 mL의 표지되지 않은 RPMI 1640 배지에서 다른 그룹 성장.
2. 큰 아미노산으로 표지 된 ....

결과

도 1a는 SILAC 라벨링 방법 ^{(21)을 개략적으로} 나타내는 흐름도이다. 엑소 좀을 정제하기 위해, 샘플은 원심 분리를 통해 스핀 다운되어야한다. 도 1b는 직렬 초 원심 분리하여 엑소 좀 ²¹ 정화 단계를 도시한다. 정제하면 절차에 설명 된 바와 같이, 엑소 좀 실험 단백체 분석 될 수 있습니다.

도 2a는 단백체 데이터 ^{(21)로부터} 상당한 단백질 후보를 결정하기위한 흐름도이다. 선택한 후보는 다음 하류 프로테오믹스 분석에 사용됩니다. 도 2b는 SILAC 히스토그램의 예 (이 숫자는 리튬 등의 변형.......

토론

이 논문에 기재된 절차에서는 호스트 exosomal 프로테옴에서 HIV-1 감염의 효과를 조사하기 SILAC 기술의 적용을 설명했다. 처음에 감염되지 않은 및 HIV-1에 감염된 세포는 차동 동위 원소 표지입니다. 차등 표지 엑소 좀은 단백질 추출을 수행하기 전에 정제된다. 다음에, 액체 크로마토 그래피 - 탠덤 질량 분석은 exosomal 프로테옴을 분석하기 위해 사용된다. 마지막으로, 생성 된 질량 분석 데이터 및 잠재적 후보 단백질 통계적 정보학을 실시 하류 생화학 해부하기 전에 해석한다.

프로토콜에 걸쳐 중요한 단계는 최적의 결과를 달성하기 위해 따라야 할 필요가있다. 프로토콜의 초기 단계에서, SILAC 라벨링은 세포 유형 및 라벨 매체에 의해 영향을받을 수있다. 건강 높은 증식 세포는 높은 표지 효율을 얻기 위해 사용한다. 비판적, 라벨 medium 갓 투석 소 태아 혈청 (FBS)이 아닌 일반 FBS를 사용하여 제조한다. 투석 된 FBS는 아미노산 및 펩티드의 고.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
H9 세포주	ATCC	HTB-176
Trypan Blue	Thermo Fisher	15250061
MTT 분석 키트	Thermo Fisher	V13154
투석 소 태아 혈청 (FBS)	Thermo Fisher	26400044
SILAC 단백질 정량 분석 키트 – RPMI 1640	Thermo Fisher	89982	DMEM 버전 (89983)
L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 SILAC	Thermo Fisher	88434
		용 13C6
		2480
Alliance HIV-1 p24 항원 ELISA 키트	PerkinElmer	NEK050001KT
냉장 초고속 원심분리기	Eppendorf	22628045
냉장 초원심분리기	Beckman Coulter	363118	100,000 x g
50mL 원추형 원심분리기 튜브	Thermo Fisher	14-432-22
에 도달할 수 있어야 합니다.초원심분리기 튜브	Beckman Coulter	326823
SW 32 Ti 로터	Beckman Coulter	369694
RIPA 버퍼	Thermo Fisher	89900
프로테아제 억제제 칵테일	Thermo Fisher	78430
써모믹서	Eppendorf	5384000020
BCA 단백질 분석 키트	Thermo Fisher	23250
분광 광도계	Biorad	1702525
SDS PAGE 겔 장치	Thermo Fisher	EI0001
Novex 4-20% Tris-Glycine Mini Gels	Novex	XV04200PK20
Gel 염색 시약	Sigma Aldrich	G1041
염기서열분석 등급 변형 트립신	Promega	V5111
SpeedVac Concentrator	Thermo Fisher	SPD131DDA
인간 애넥신 A5에 대한 항체	Abcam	ab14196
인간 젖산 탈수소효소 B 사슬에 대한 항체	Abcam	ab53292
그래프 및 통계 소프트웨어	Systat	시그마플롯	또는 GraphPad 프리즘
정량적 단백질체학 소프트웨어 제품군	Max Planck Institue of Biochemistry	Maxquant
소프트웨어 및 데이터베이스	Various Vendors		자세한 내용은 본문을 참조하십시오.

L-Lysine-2HCl, SILAC Thermo Fisher 88431 HIV-1 NL4-3 NIH AIDS 시약 프로그램