오징어 Doryteuthis pealeii 색소의 나노 입자에서 색소의 추출을위한 프로토콜이 표시됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
두족류는 감지, 의사소통, 방어 및 번식 목적으로 피부 착색의 빠르고 적응적인 변화를 겪을 수 있습니다. 이러한 능력은 크로마토포어(chromatophores)로 알려진 색소 기관의 영역 확장 및 수축에 의해 부분적으로 지원됩니다. 크로마토포어(chromatophores)는 착색된 과립의 테더링된 네트워크를 포함하는 것으로 알려져 있지만, 그 구조-기능 특성은 완전히 상세하지 않습니다. 우리는 오징어 Doryteuthis pealeii chromatophores에서 나노 구조 과립을 분리하는 방법을 설명하고 관련 색소가 산성 용매에서 어떻게 추출될 수 있는지 보여줍니다. 이를 달성하기 위해 진피층을 포함하는 크로마토포어는 먼저 표재성 해부를 사용하여 수동으로 분리하고 초음파 처리, 원심분리 및 세척 주기를 사용하여 색소 과립을 제거합니다. 정제된 과립 내에 갇힌 안료는 산성 메탄올 용액을 통해 추출되어 눈에 보이는 색상이 없는 더 작은 직경의 나노 구조를 남깁니다. 이 추출 절차는 과립에서 분리된 58%의 용해성 색소 수율을 생성합니다. 이 방법을 사용하여 크로마토포어 색소의 조성을 측정하고 두족류의 적응 착색 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하는 데 사용할 수 있습니다.
서론
오징어, 오징어, 문어와 같은 두족류는 동적으로 위장 및 신호에 대한 자신의 모양을 변경할 수있는 기능을 가지고있다. 1-6이 기능은 색소로 알려진 착색 기관의 선택 면적 확장에 의해 부분적으로 지원됩니다. 4,7-9 색소는 이들이 작동되면 근섬유로 방사상 고정되는 cytoelastic sacculus 내에 한정 나노 안료 입자의 네트워크를 포함 소프트 액츄에이터. 1,3, 색소는 장기에 걸쳐 입자를 분산되게 표면적을 500 %로 확대. 3,7-을 이 작업은 색소 세포의 수 이상으로 행한 경우, 10, 11는, 동물의 전체 착색이 변경됩니다. 이 색소 과립이 색의 변화에 기여하는 것으로 알려져 있지만, 이들 조성물은 알려지지 않았다. 우리는 분리 및 미래 연구를 조성하도록 구성 될 수있다 안료 색소 포를 정제하는 방법을 설명한다.
안료 입자의 분리는 다단계 추출, 균질화, 및 정제 과정을 포함한다. 3,12 색소 포 함유 조직은 두족류에서 조심 근절을 통해 수거된다. 소화 균질화 과정은 다음 색소 포 세포 주변 조직을 해리와 구분하기 위해 사용된다. 나노 구조 과립 반복 초음파 처리 및 원심 분리를 이용하여 남아있....
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프로토콜
미국에서 규제되지 않습니다 여기에 실시 무척추 동물 연구; 따라서 기관 동물 관리 및 사용위원회는 프로토콜의 검토에 대한 권한이 없습니다. 이러한 미국의 규제의 관할에 해당하지 않는 대신에, 저자는 이에이 연구는 진지한 윤리적 사용을 향해 노력, 관리, 및 동물의 치료, 개인의 수를 최소화하고, 이러한 노력으로 수행 하였다 상태 것을 바젤 선언과 실험 동물 과학을위한 국제위원회 (ICLAS) 윤리 지침과 일치한다.
1. Doryteuthis의 pealeii (D.의 pealeii) 해부
- 구매 참수 오징어 D. 우즈 홀, MA에있는 해양 생물 연구소의 해양 자원학과 또는 신선한 생선 시장에서 pealeii. 필렛 또는 이전에이 절차를 적용하기 위해 변경 한 시료를 사용하지 마십시오. 구체적으로는, 크로마tophore 층은 여전히 표본에 그대로 있어야합니다.
- 동물을 즉시 사용하지 않는 경우, 사용할 때까지 -20 ℃에서 보관. 시료를 해동하기 전에 절개 1 시간 동안 실온의 물에 넣습니다.
- 동물의 후방 측을 따라 절단 스테인레스 스틸 직선 미세 점 해부 가위를 사용. 복부 맨틀의 기지에서 시작하고, 핀 영역에서 끝난다.
- 집게를 해부 및 해부....
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결과
색소는 D.에서 해부하는 pealeii 등의 맨틀 (그림 1A, 1B). 그들은이 제거되면 색소 세포가 용해 및 색소 과립 (도 2A, 2B)를 밖으로 분리하는 원심 분리 및 세척주기를 사용하여 정제한다. 산성 메탄올 용액 (염산 - 메탄올)는 수용성 색소 추출물과 불용성 무색 안료 추출 과립을 산출, 과립 (그림 2C)에서 색소를 추출하는 데 사용됩니다.
추출 공정은 입자의 평균 직경을 감소시킨다. 이 작업은 주사 전자 현미경 (SEM)을 사용하여 관찰된다. (도 3A N = 100, 에러 표준 편차) 과립 염산 - 메탄올에 노출되기 전에, 그들은.......
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토론
우리는 오징어 색소 포 과립에서 색소를 추출하는 방법을 설명했다. 특히 과립을 대상으로, 우리의 목표는 적응 착색을 매개의 역할을 결정하는 것입니다. 이 방법은 대량 조직 샘플 (14) 또는 동결 건조 피부 (15)를 사용하여 두족류 안료의 특성을 설계 이전 보고서에서 다르다.
이 프로토콜은 색소 포 안료를 추출하는 데 효과적이지만, 이것은 작은 반응 규모로 제한된다. 한 오징어 수확량을 해부 ~ 정제 된 과립의 11 mg을. 약이 질량의 58 %는 염산 - 메탄올 용액을 사용하여 추출 된 수용성 안료를 포함한다. (12)을 시작 색소 포 조직의 순도는 직접 한 해부에서 제품 수율에 영향을 미친다. 샘플을 초과 표피 또는 해부 동안 수집 iridophore 조직에 의해 오염 나타날 경우, 샘플의 내용을 별도의 추가 버피에서 그들을 재현 탁하는 것이 가장 좋습니다FER, 그리고 균질화가 또 다시 단계를 시작합니다. 색소.......
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공개 사항
우리는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
저자는 University Instrumentation Center를 포함한 University of New Hampshire의 시설을 사용한 것에 대해 감사하는 마음으로 인정합니다. 이 연구는 뉴햄프셔 대학교 화학과의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 콜라겐 분해 효소 | Alfa Aesar | 9001-12-1 | 무해 |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 3482-12-3 | 자극성, 급성 독성 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | 가벼운 자극성 |
| 염산 | EMD 화학 물질 | 7647-01-0 | 부식성 |
| k-아스파르테이트 | Sigma-Aldrich | 1115-63-5 | 반응 산화제로 격렬하게 |
| 마그네슘 염화물 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | 약한 눈 자극제 |
| 메탄올 | Pharmco-AAPER | 67-56-1 | 고인화성 |
| 미니 정제 prtoease 억제제 | Sigma-Aldrich | 469315-90-01 | 금속과 피부에 부식성 |
| Papain | Sigma-Aldrich | 9001-73-4 | 자극제 |
참고문헌
- Bell, G. R. R., et al. Chromatophore radial muscle fibers anchor in flexible squid skin. Invertebr Biol. 132 (2), 120-132 (2013).
- Crookes, W. J., et al. Reflectins: The unusual proteins of squid reflective tissues. Science. 303 (5655), 235-238 (2....
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재인쇄 및 허가
