질량 조직학은에 신경 퇴행을 정량화하기 초파리

기대 수명의 증가와 함께, 알츠하이머 나 파킨슨 병 같은 신경 퇴행성 질환은 일반 인구 증가 건강에 위협이되고있다. 국립 보건원에 따르면 115 만명 전세계 기본 상당한 진전이 많은 분야에서 이들 질환의 적어도 일부에 관여하는 유전자와 위험 요인을 식별 하였지만 2050 치매에 의해 영향을받을 것으로 예상되는 분자 메커니즘은 여전히 ​​알 수없는 여부를 잘 이해한다.

예쁜 꼬마 선충과 초파리 melanogaster의 같은 간단한 무척추 동물 모델 생물은 짧은 라이프 사이클, 자손의 많은 수의, 잘 설립 때로는 독특한 유전 및 분자 방법 ^1의 가용성을 포함한 신경 퇴행성 질환의 메커니즘을 연구하는 실험 다양한 장점을 제공합니다 ^-12. 또한, 이러한 유기체는 편견 의무가 있습니다신경 퇴행성 표현형에 자신의 악화 또는 의한 개선 효과에 의해 이러한 질병에 기여하는 요인을 식별 할 수있는 상호 작용 화면.

이러한 유전자의 상호 작용을 분석하고 노화 효과를 평가하는 신경 퇴행을 검출하고 그 심각도를 측정하는 정량적 프로토콜을 필요로한다. 숫자 성능 값 ^{13-21을 제공하는} 등 후각 학습, 부정적인 geotaxis, 또는 빠른 phototaxis으로 초파리의 행동 측면을 측정 할 때이 평가는 비교적 쉽게 수행 할 수 있습니다. 이는 뉴런을 카운트함으로써 신경 세포의 생존에 대한 효과를 결정하는 것도 가능하다. PD의 영향, 그리고 심지어 그 후, 결과는 ^22-24 논란 한 도파민 뉴런 같이 명확하게 식별되는 특정 인구 집중 그러나이 경우에만 가능하다.

여기에 설명 된 프로토콜 파라핀 직렬 섹션을 수행 칼라 방법을 사용하는 방법즉 원래 초파리 ²⁵ 해부학 뇌 돌연변이를 분리하여 사용하고 Böhl 하이젠 베르크에 의해 개발되었다. 칼라 방법의 사용은 다음에 저온부, vibratome 부, 비닐 부 ^26-28에 포함하도록 구성되었다. 여기서,이 방법은 퇴행성 신경 표현형 ^{16,21,29-32에} 파리 발전 액포를 측정하는 데 사용할 수있는 전체 플라이 헤드의 직렬 부분을 얻기 위해 사용된다. 이러한 측정들은 특정 뇌 영역에서 수행 될 수 있거나 뇌 전체를 커버 할 수있다; 후자의 방법은 노화 동안 관찰 한도 약한 퇴행성 표현형을 식별 할 수 있습니다. 칼라를 사용하는 경우 마지막으로, 20 파리에는 하나 준비로 처리 할 수 ​​있습니다뿐만 아니라 적은 시간이 소요되지만 인해 약간의 변화에 ​​아티팩트를 최소화 제어와 같은 준비 실험 파리의 분석 가능 준비.

1. 칼라의 머리를 고정하고 파라핀에 임베드

주 : 정착 프로세스의 모든 단계는 흄 후드에서 수행되어야한다. 건강 위험 포즈를하지 않으면 서 메틸 벤조 에이트는, 흄 후드에서 처리되지 않는 경우에 압도 될 수있는 매우 독특한 냄새를 가지고있다.

1. 파리를 마취 전에 클로로포름 15 ㎖의 99 % 에탄올 30 ㎖에 빙초산을 5 ㎖ (클로로포름 및 아세트산을 혼합하지 않음)에 추가하여 Carnoy 용액 50 ㎖를 구성한다. 칼라 평면 놓을 수 완전히 솔루션이 적용되는 것을 보장하기 위해, 이러한 crystalizing 접시 같은 평평한 바닥과 유리 용기에 붓는다.
2. CO ₂ 또는 에테르와 함께 파리를 마취.
3. 집게를 사용하여 칼라로 목에 의한 스레드 파리 (최대 대부분의 칼라와 20). 그림 1A에서와 같이, 같은 방향으로 머리를 모두 맞춘 손상 머리 나 눈에 발생하지 않도록 부드럽게해야합니다.
4. 파리의 순서가 쉽게 부분에서 식별 될 수 있도록 임의의 위치에서 사인 oculis 파리 (화살표,도 1a)를 포함한다. 실험 파리는 빛 또는 흰색 눈 색깔이있는 경우 또한, 같은 야생형 같은 일부 빨간색 파리, 스레드 그들 사이에 충분한 안료 슬라이드를 염색하는 존재 확인 할 수 있습니다. 하나 이상의 칼라를 사용하는 경우, 칼라 번호와 함께 프로토콜 시트 파리의 순서를 기록한다.
5. 4 시간 - 칼라가 완료되면, 3.5에 대한 준비 Carnoy 용액에 넣습니다.
6. 적절한 폐기 용기에 Carnoy 솔루션을 덤프 및 에탄올 세척을 시작합니다. 컨테이너 칼라의 배치를 방해하지 않도록 천천히 부어해야합니다.
7. 두 번 99 % 에탄올에 30 분 동안 칼라를 씻으십시오.
8. 1 시간 동안 100 % 에탄올 칼라를 씻으십시오. overdehydration을 방지하기 위해 시간에 세척을 변경해야합니다.
9. 메틸 벤조 에이트의 칼라를 넣어O / RT에서 N. 메틸 벤조 에이트의 증발을 방지하기 위해 파라 필름으로 밀봉 용기.
10. 흄 후드의 적절한 일회용 용기에 methylbenozate을 따르십시오. (- 57 °의 C 56) 파라핀 왁스 및 메틸 벤조 에이트 (1) 저 융점 : 1의 이전에 제조 된 혼합물을 추가합니다. 이 시점에서, 칼라는 파라핀이 경화되지 않는 것을 확인하기 위해 65 ° C에서 인큐베이터에 보관해야합니다.
11. 적절한 일회용 용기에 methylbenozate과 파라핀 혼합물을 붓고, 용융 순수 파라핀 왁스를 부어 칼라에, 65 ° C로 유지.
12. 30 분 후 파라핀을 변경하고이 적어도 5 번 반복한다. 적어도 6-8 세척을 수행해야합니다.
13. 세척이 완료되면, 약 슬롯 칼라의 크기의 고무 아이스 큐브 트레이에 칼라를 배치합니다. 완전히 덮여 때까지 그들을 녹은 파라핀을 붓고는 O를 강화 할 수 있도록 / N은 (공기 방울을 피하려고).
14. 파라핀 블록 contai를 제거닝 아이스 큐브 트레이에서 목걸이. 부드럽게 칼라를 깨고, 면도날을 사용하여 칼라에서 파라핀 블록을 분리합니다. 몸이 칼라에 남아있을 것입니다 동안 머리는 파라핀 블록에있을 것입니다. 블록이 실온에서 유지 될 수있다.
15. 칼라를 청소하려면, 빛 세정 깨끗한 파라핀을 제거하고 재사용하기 전에 에탄올 세척 65 ° C에서 deparafinization 에이전트에서 그들을 흡수.

2. 단면 및 설치

1. 50 ° C까지 가열 플레이트를 따뜻하게. 접시에 개체 소유자 (또는 금속 장착 블록) 및 면도날을 놓고 그들을 따뜻하게 할 수 있습니다.
2. 절편의 원하는 방향에 따라 파라핀 (수평 섹션에 대한) 측을 향해 머리와 두 블록 또는 (간단히 접촉 측의 블록을 용융) 가열 장착 블록 (정면 부분에 대한) 위쪽으로 향하도록 연결합니다. 가열 플레이트에서 블록을 제거하고 적어도 10 마일을 위해 냉각 할 수 있도록n은 파라핀이 장착 블록 상에 적절한 시일 충분히 경화되어 있는지 확인합니다. 단차를 방지 할 수만큼 블럭의 표면과 평행하게 정렬 헤드의 열을 유지한다.
3. 면도날을 가지고 포함 된 머리와 단지 작은 행이 유지되도록 멀리 비행 헤드에서 과잉 파라핀 트림 (면도날은 쉽게 다듬을 워밍업 할 수있다). 파라핀은 (절편 동안 수행 할 수 있습니다 더 트리밍) 절편 동안 중단되지 않도록 너무 많이 잘라 내지 않도록주의하십시오.
4. 마이크로톰의 물체 홀더에 장착 블록을두고 머리의 행의 배향 블레이드의 에지에 가능한 한 평행하도록 보장한다.
5. 폴리 -L- 리신 (PLL) 솔루션의 얇은 층을 덮어 현미경 슬라이드를 준비하고 5 분 동안 그들을 건조 할 수 있습니다. 직전에 사용하는 물을 커버.
6. 7 μm의 섹션을 잘라 물에 떠있는 슬라이드에 부분의 리본을 전송합니다. <BR /> 참고 : 수평 섹션에 대한 전체 뇌를 얻으려면, 우리는 머리가 완전히 절단 될 때까지 (뇌에 코에서 절단) 눈으로 절단하기 시작할 때부터 리본을 수집합니다. 하나 이상의 슬라이드 전체 머리 필요할 수있다.
7. 37 ° C에서 열판에 슬라이드를 놓고 리본이 약 1 분 동안 확장 할 수 있습니다.
8. (그것을 떨어져 쏟아져 또는 조직을 사용하여) 과잉의 물을 제거하고 슬라이드 O / N을 건조.
9. deparafinization 에이전트 (완전히 섹션을 포함)으로 가득 높이, 수직 슬라이드 염색 항아리에 슬라이드를 배치하여 슬라이드에서 파라핀 왁스를 제거합니다. 60 분 각각 - 30 분의 3 세척을 수행합니다.
10. 최종 세척에서 슬라이드를 제거합니다. 슬라이드에 삽입 미디어 2 방울을 놓고 큰 커버 슬립으로 커버.

3. 섹션을 사진 촬영 및 분석

1. 2 일 - 준비된 슬라이드 1 건조하도록 허용합니다. 그리고, 형광 microsc 그들을 검토푸른 빛 아래 OPE.
2. 파리의 방향을 결정하고, 특정 영역에 집중하는 경우 관심 영역을 찾는 저배율를 사용한다.
   참고 : SWS 파리 (그림 2 참조)의 경우, 우리는 큰 접합면이 들어있는 부분을 찾아 (일반적으로 40 배 배율) 이미지를 촬영합니다. (그림 3에서와 같이) 전체 뇌를 분석 할 때, 우리는 머리에서 모든 섹션을 스크롤하여 가장 심각한 표현형 또는 공포를 보여 모든 섹션과 섹션을 촬영 중.
3. 이중 맹검 분석을 위해 취하고 번호 이미지 유전자형 모르게 이상을 식별하는 행에있는 칼라 수와 헤드의 위치를 ​​기록한다.
4. 화상이 촬영 된 후에 촬상 소프트웨어를 사용하여 분석한다.
5. 섹션 별 또는 머리 당 공포의 수를 계산합니다. , 액포의 크기를 측정하는 소프트웨어 프로그램에서 이미지를 열고도 선택과 액포를 선택하려면엘. 선택된 액포 화소의 크기를 결정한다.
6. ² μm의 변환을 위해, 포토 취득에 사용되는 확대 한 스테이지 마이크로 미터 교정 슬라이드의 사진을 촬영. 변환 계수를 계산하기 위해 100 ㎛의 ² 픽셀의 양을 결정한다.
7. 상기 단계에서 계산 된 변환 계수가 픽셀 수를 분할하여 ² ㎛로 총 화소 수를 변환한다.

전체 플라이 헤드를 포함 눈 안료 (33)에 의해 스테인드 시리얼 섹션에 설명 된 방법의 결과를 사용. 이것의 일부는 각각의 헤드의 부분이 위로부터 아래로 도시되어도 1b에 도시된다. 다른 파리에서 섹션이 예에서 왼쪽에서 오른쪽으로 볼 수 있습니다. 방향과 파리의 식별을 용이하게하기 위해, 눈이없는 비행 (사인 oculis)의 위치 3 (화살표, 그림 1B)에서 마커로 삽입됩니다.

신경 퇴행을 정량화하기 위해,이 부분에서 검출 할 수 액포의 형성을 측정한다. 액포가 라운드로 정의된다, 녹색 형광 neuropil 내에서 (그림 2의 화살촉 3) 또는 피질과 어두운 반점은 즉시 뇌의 이상이 연속 섹션에서 볼 수 있습니다. 에 의해 신경 퇴행을 정량화측정 공포는 어느 특정 뇌 영역에 초점을 맞춤으로써 또는 전체 뇌를 분석하여 수행 할 수 있습니다. 뇌의 특정 영역에 분석을 한정하는 것은 돌연변이 만 돌연변이 34 OLK futsch '의 후각 로브 같이 특정 지역에 영향을 미치는 경우에 유용하지만, 모든 또는 많은 심각한 변성가있을 때 또한 사용될 수있다 뇌의 영역. 후자의 예는 모든 공포를 측정하는 것은 너무 많은 시간이 소요 될 것 스위스 치즈 (SWS) 돌연변이 (그림 2)입니다. 그러므로 우리는 측정이 항상 같은 수준에서 수행되었는지 확인하기 위해, 하나의 이미지를 가지고 가고, 우리는 하나 또는 두 개의 섹션에 포함 된 큰 접합면 (GC, 그림 2A)의 수준에서 모든 이미지를했다. 우리는 (데이터 미도시) 1 일된 SWS '1 파리에서 액포 형성을 검출하지 않은 반면하는 기능 상실 형질 35 일부 액포가 검출 I이었다n은 7 일 된 SWS '1 파리 (화살촉, 그림 2A). 14 일 (그림 2B) 21 D (그림 2C)에 파리를 노화 더 진보적 인 성격을 보여주는,이 표현형 증가했다. 전술 한 방법을 사용하여 deutocerebral neuropil (DN)에 액포의 수를 카운트하는 나이 액포의 수가 크게 증가를 확인했다. 또한, 액포에 포함 결합 된 영역은 크게 (그림 2D)을 노화로 증가 하였다.

그러나, 모든 돌연변이 SWS 같은 심각한 표현형을 보여주고, 이러한 경우에는 변성에 차이가 작은 영역에 집중 될 때를 결정하기가 어렵다. 마찬가지로, 노화 중에 발생하는 변성 (그림 3A - C) 아주 가벼운이며,이 표현형을 정량화 할 때 따라서, 우리는 전체 뇌를 분석 하였다. 계시 뇌 모든 액포의 합을 결정이 액포 (도 3d)의 결합 된 영역을 측정 할 때 상당한 연령 증가시키고, 또한이 경우였다.

1. 파라핀 직렬 섹션 그림. A) 칼라 방법을 사용하여, 실험 및 제어 파리 한 칼라 상을 나사에 의해 하나의 샘플과 같이 처리 될 수있다. 눈이없는 사인 oculis 파리는 방향 (화살표)을 위해 삽입됩니다. 칼라의 플라이 헤드의 방향을 나타내는 B) 회로도. C)이 이미지에서 다른 비행 헤드에서 섹션은 슬라이드의 왼쪽에서 오른쪽으로 지향하고 있습니다. 슬라이드 위에서 아래로, 동일한 플라이 헤드로부터 시리얼 섹션을 볼 수 있습니다. 이 경우, 사인 oculis 플라이는 위치 세 (화살표)에 삽입 하였다. 섹션은 이상 씻어 형광 눈 안료로 염색 절단 후 섹션. A = 5mm과 C = 0.5 mm의 스케일 바. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

스위스 치즈 돌연변이 2에 진보적 인 신경 퇴행 그림. 7 기념일 (A), 14 기념일 (B) 21-기념일 (C) 이전 SWS '1 파리에서 파라핀 머리 부. 화살촉은 노화와 개발 액포를 가리 킵니다. 연령 - 관련 퇴행성 액포의 수를 카운트하고 그들의 결합 영역 (D)를 측정함으로써 정량한다. 주사 전자 현미경 분석 파리의 번호가 표시됩니다. 스케일 바는 25 μm의 =. *** p <0.001.csource.jove.com/files/ftp_upload/54809/54809fig2large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3. 신경 퇴행은 나이가 발생합니다. 10 기념일 (A), 30 기념일 (B) 60-기념일 (C) 이전 야생형 초파리로부터 파라핀 머리 부. 화살촉은 세 파리에서 개발 한 공포를 가리 킵니다. 연령 - 관련 퇴행성 액포의 수를 카운트하고 그들의 결합 영역 (D)를 측정함으로써 정량한다. 주사 전자 현미경 분석 파리의 번호가 표시됩니다. 스케일 바는 25 μm의 =. *** p <0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <가 />

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