제브라 피쉬의 interrenal 선은 포유 동물의 부신의 teleostean 대응이다. 효소 활성 분석, 개발 제브라 피쉬에서 차별화 된 steroidogenic 세포를 감지,이 프로토콜은 3-β-하이드 록시 탈수소 효소 (3β-HSD Δ 5-4 이성화 효소)를 수행하는 방법을 소개합니다.
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이 논문에서
요약
초록
이 프로토콜은 간단한 전체 마운트 효소 활성 분석을 통해 분화된 신간 스테로이드 생성 세포를 검출하는 방법을 소개합니다. 3-β-Hydroxysteroid dehydrogenase /Δ5-4 isomerase (3β-Hsd) 활성 양성 세포의 발색 조직화학적 염색을 통해 분화된 스테로이드 생성 조직을 식별하는 것은 포유류와 teleosts에서 각각 부신피질 및 신간 조직의 형태와 분화를 모니터링하는 데 중요합니다. 제브라피시 모델에서는 발달 중인 배아와 유충의 광학적 투명도와 조직 투과성으로 인해 3β-Hsd 활성의 전체 마운트 염색이 가능합니다. 발달 중인 신경계 세포와 내피 세포를 표시하는 형질전환 형광 리포터 라인에서 수행되는 이 염색 프로토콜은 신장 및 주변 혈관 구조 외에도 스테로이드성 신간 조직을 검출할 수 있습니다. 진동 절편, 면역조직화학 및 컨포칼 현미경과 함께 신장 내 스테로이드 생성 조직의 혈관 미세환경을 시각화하고 분석할 수 있습니다. 3β-Hsd 활성 분석법은 현재까지 제브라피시 스테로이드 생성 세포를 표지하는 데 사용할 수 있는 적절한 항체가 없기 때문에 제브라피시 신내선의 세포 생물학을 연구하는 데 필수적입니다. 또한, 이 분석법은 빠르고 간단하여 부신(신간) 유전 질환을 표적으로 하는 돌연변이 스크리닝을 위한 강력한 도구를 제공할 뿐만 아니라 제약 또는 독성학 연구에서 스테로이드 생성에 대한 화학 물질의 파괴 효과를 결정하기 위한 강력한 도구를 제공합니다.
서론
부신은 시상 하부 - 뇌하수체 - 부신 축의 중요한 구성 요소, 스테로이드를 분비하고 스테로이드 항상성과 스트레스에 대한 신체 반응을 조정한다. 부신은 카테콜아민을 합성 ㄱ 영역 별 방식으로 스테로이드를 분비 바깥 쪽 피질, 및 내부 수질를 포함한다. 경골 어류의 interrenal 선은 포유 동물의 부신의 상대이며, 부신 피질과 수질, 각각 1-3의 기능적 등가물이다 steroidogenic interrenal과 크롬 친화 세포로 구성되어있다. 제브라 피쉬 모델을 사용하여 수행 연구는 모두 steroidogenic 및 크롬 친화 세포의 계보가 매우 포유류 1, 2에서와 유사한 분자 및 세포 메커니즘에 의해 형성되는 것으로보고있다. 따라서, 제브라 피쉬는 유전 질환, 신경 내분비 조절하고, 시상 하부 - 뇌하수체 - 부신 (interrenal) 축 시스템 생물학 연구를위한 잠재적으로 강력한 모델이다.
, 3β-HSD는 데히드 4,5에서 17α-hydroxypregnelolone에서 프레 그네 놀론, 17α-hydroxyprogesterone에서 프로게스테론의 변환 및 안드로 스텐 디온을 촉매. 3β-HSD 호르몬 스테로이드, 즉 황체 호르몬, 글루코 코르티코이드, 무기질....
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프로토콜
윤리 정책 : 제브라 피쉬의 모든 실험 절차는 동해 대학의 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다 (IRB 승인 NO 101-12합니다.) 및 승인 된 지침에 따라 수행 하였다.
3β-HSD 효소 활성 염색 1. 재고 솔루션
- 트랜스 dehydroandrosterone [디메틸 술폭 사이드 (DMSO)에 10 ㎎ / ㎖]를 준비한다.
- β - 니코틴 아미드 아데닌 디 뉴클레오티드 수화물 (0.1 M 인산염 완충액에서 1.2 ㎎ / ㎖, pH를 7.2)을 준비한다.
- 니코틴 준비 (비타민 B3,을 50mg / ㎖의 H 2 O).
- 4- 니트로 블루 테트라 졸륨 (50 ㎎ / ㎖ 70 % 디메틸 포름 아미드)를 준비한다.
- -20 ° C에서의 미세 원심 분리 튜브에 나누어 저장하는 모든 이러한 구성 요소.
참고 : 우리의 경험, 반복 동결 모든 상기 용액의 분취 량의 해동에서 3β-HSD 활동 염색의 강도에 영향을주지 않습니다.
2. W홀 마운트 3β-HSD 활동 염색
참고 : 3β-HSD 효소 활성이 빠르면....
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결과
pronephric 신장 사구체 및 초기 혈관과 steroidogenic interrenal 조직 codevelops에서, 3β-HSD 효소 활성 분석은 이중 형질 전환의 Tg (wt1b : GFP)에서 수행 된 방법을 결정하려면 LI1, Tg는 (kdrl : mCherry) C15- 카르 배아를 34 HPF에서 (그림 1). 이 단계에서, 3β-HSD 활동을 양성 steroidogenic 조직을 바로 중간 선에 위치하고 있으며 일부 steroidogenic 세포가 중간 선에서 마이그레이션을 시작하고 지느러미보기에서 돌출 가장자리를 형성하는 반면 즉시 pronephric 신장 사구체에 꼬리 지느러미. steroidogenic 조직은 밀접하게 지느러미 대동맥 (DA) 및 후방 추기경 정맥 (PCV)와 연결되어 있습니다.
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토론
3β-HSD 활동의 신호 강도는 반응의 과정을 통해 증가. 3β-HSD 활동의 명확한 신호는 이후 28 HPF에서 단계에 대한 반응 4 시간 후에 발견되었다. 그러나, 반응 시간은 분석의 목적에 따라 경험적 결정이 필요하다. 염색 밤새 처리 요구의 경우, 약간 엷은 배경 샘플을 개발하는 경향이있다. 이 문제는 HSD-3β 활성 염색 전에 고정 지속 시간 (예를 들어, RT에서 4 % PFAT에서 4 시간)의 증가에 의해 극복 될 수있다. 이러한 실온에서 4 % PFAT와 밤새 고정으로 대비, overfixation에 의해, 매우 분명 배경에 연결됩니다. 그러나, 더 긴 시간은 상기 신호의 원하는 강도를 얻기 위해 요구된다. 우리는 3β-HSD 활동 염색하기 전에 밤새 2 %보다는 4 % PFAT와 샘플을 고정하는 것은 일반적으로 후속 형광 기자의 관찰 또는 I에서 더 바람직한 결과를 얻을 것으로 나타났습니다HC 분석. 그러나, 4 % PFAT와 배아를 고정하기 (1 일 이내에 완료)를 3β-HSD 활성의 신속한.......
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공개 사항
저자는 선언할 경쟁적인 재정적 이해관계가 없습니다.
감사의 글
S843 : LI1과의 Tg (EGFP kdrl) : 우리는 Tg가 (GFP wt1b)를 증여에 대한 교수 크리스토프 Englert 교수 디디에 Stainier 감사합니다 균주 각각과의 Tg (kdrl을 : mCherry) 제공하는 대만 Zebrafish의 핵심 시설 C15- 카르을. 이 연구는 102-, 과학 기술 (96-2628-B-029-002-MY3, 101-2313-B-029-001, 102-2628-B-029-002-MY3 대만의 정부에서 보조금에 의해 지원되었다 2321-B-400-018).
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 컨포칼 현미경 | Carl Zeiss | LSM510 | |
| DMSO | 시그마 | D8418 | |
| 글리세롤 | USB | US16374 | |
| Hyclone 태아 송아지 세럼 | GE Healthcare Life Sciences | SH30073 | |
| 니코틴아미드 | 시그마 | N0636 | |
| &베타;-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 수화물 | 시그마 | N1636 | |
| 4-니트로 블루 테트라졸륨 | Promega | S380C | |
| Nusieve GTG | Lonza | 50081 | |
| 파라포름알데히드 | 시그마 | P6148 | |
| 페닐티오우레아 | 시그마 | P7629 | |
| 인산염 완충 식염수 | 시그마 | P4417-100Tab | |
| PYREX 스폿 플레이트 | 코닝 | 7220-85 | |
| 암초 소금 | AZOO | AZ28001 | |
| 트랜스 디하이드로 안드로스테론 | 시그마 | D4000 | |
| 트리톤 X-100 | 시그마 | T8787 | |
| 트윈 20 | 시그마 | P9416 | |
| 비브라톰 | 라이카 | VT1000M |
참고문헌
- Hsu, H. J., Lin, G., Chung, B. C. Parallel early development of zebrafish interrenal glands and pronephros: differential control by wt1 and ff1b. Development. 130, 2107-2116 (2003).
- To, T. T., et al. Pituitary-interrenal ....
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재인쇄 및 허가
