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방법 논문

바이오 필름 제거 질소 제거하지 않고 이산화탄소 에어로졸을 사용하여

6.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/54827

⸱

2016년 11월 6일

 , 
1School of Mechanical and Nuclear Engineering, Ulsan National Institute of Science and Technology (UNIST)

이 논문에서

요약

표면의 생물막은 질소 퍼지 없이 주기적으로 이산화탄소 에어로졸 분사를 사용하여 효과적이고 신속하게 제거할 수 있습니다.

초록

생물막은 많은 응용 분야에서 심각한 문제를 일으킬 수 있습니다. 경제적 손실을 초래할 수 있을 뿐만 아니라 공중 보건에 위험을 초래할 수도 있습니다. 그러므로, 표면에서 생물막을 제거하는 것이 매우 바람직하다. CO2 에어로졸 세척에 대한 많은 연구에서는 세척 중에 발생하는 수분 응결을 줄여 생물막 제거 효율을 높이기 위해 질소 퍼지를 사용했습니다. 그러나 이 연구에서는 질소 퍼지 없이 CO2 에어로졸의 주기적인 제트를 사용하여 광택이 나는 스테인리스강 표면에서 슈도모나스 푸티다 생물막을 제거했습니다. CO2 에어로졸은 고체 및 기체 CO2 의 혼합물이며 고압 CO2 가스가 노즐을 통해 단열 팽창 할 때 생성됩니다. 이 고속 에어로졸은 24시간 동안 성장한 생물막에 적용되었습니다. 제거 효율은 90.36%에서 98.29% 범위였으며, 처리 시간이 16초에서 88초까지 다양함에 따라 생물막의 형광 강도를 측정하여 평가했습니다. 우리는 또한 질소 퍼지가 있는 경우와 없는 경우의 제거 효율을 비교하기 위한 실험을 수행했습니다. 측정된 생물막 제거 효율은 서로 유의하게 다르지 않았다(T-test, p > 0.55). 따라서 이 기술은 1분 이내에 다양한 생물 오염 표면을 청소하는 데 사용할 수 있습니다.

서론

생물막은 박테리아 세포가 세포 외 고분자 물질의 자체 생산 매트릭스 내에 내장되어 함께 유지되고 외부 환경으로부터 보호되는 복잡한 박테리아 군집 구조입니다. 생물막은 의료용 임플란트 재료 및 장치, 식품 가공 장비 및 열교환기를 포함한 다양한 표면에 형성될 수 있기 때문에 공중 보건 위험을 초래할 수 있으며 경제적 손실을 초래할 수 있습니다. 실제로, 생물막은 질병 통제 예방 센터에 따르면 인간에 있는 모든 세균성 감염병의 65%와 관련되기 위하여 발견되었습니다1.

오토클레이브와 염소와 같은 소독제는 일반적으로 생물막의 불활성화에 사용되었습니다. 그러나 오토클레이브의 사용은 고온의 증기를 견딜 수 없거나 오토클레이브에 배치할 수 없는 표면에 대해 제한됩니다. 소독제는 화학 처리에 민감하거나 독성 산화 생성물을 모으기 쉬운 표면에 적합하지 않습니다2. 또한, 생물막은 비활성화되어야 할 뿐만 아니라 표면에 새로운 세포가 부착되는 것을 방지하기 위해 제거되어야 하며, 이를 통해 새로운 생물막을 형성해야 합니다3. 그러나 표면 부근의 유속이 거의 0이고 전단력은 일반적으로 미크론 및 서브미크론 크기의 물질의 접착력을 극복할 수 없기 때문에 점성 유체 전단법을 기반으로 하는 방법을 사용하여 생물막을 제거하기 어렵습니다. 또한, 생물막 매트릭스는 물리적, 화학적 장벽으로 작용하는 것으로 알려져 있습니다1.

표면에서 생물막을 제거하기 위해 초음파 진동1, 전류4, 레이저 조사5, 고압 물 분무6 등 많은 물리적, 기계적 기술이 개발되었다. 각 기술에는 고유한 장단점이 있습니다. 초음파 진동 및 전류는 생물막 형성을 제어하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 각각 특정 구성과 전도성 표면이 필요하므로 추가 전단 응력1, 4가 필요합니다. 레이저 조사는 제한된 영역과 단단한 표면에 적용할 수 있습니다. 그러나 일부 살아 있는 세포와 죽은 세포는 표면에 남아 있습니다5. 고압 물 스프레이는 생물막을 효과적으로 제거합니다. 그러나 높은 운동량은 부드러운 기판6에 손상을 줄 수 있습니다.

CO2 에어로졸을 사용한 생물막 제거는 이전에 제안되었습니다. 단시간 내에 높은 제거 효율7-11로 유망한 결과를 보여주었습니다. CO2 에어로졸은 노즐을 통한 고압 CO2 가스의 단열 팽창에 의해 생성되며 생물막으로 오염된 표면에 적용됩니다. 이 세척 기술은 고체 CO2 입자의 운동량 전달과 용융된 CO2 액체의 용매 작용, CO2 가스12의 공기역학적 전단력을 활용합니다. 고압 N2 가스 제트와 비교할 때, 동일한 정체 압력에서 CO2 에어로졸 제트는 대장균 생물막을 제거하는 데 훨씬 더 효과적입니다7. 더욱이, 박테리아에 전달되는 고체CO2의 운동량은 상당히 높지만, 고체 표면에 가해지는 총 에어로졸 제트의 운동량은 물 제트의 운동량보다 상당히 낮습니다. 따라서 이 CO2 에어로졸 기술을 사용하여 손상 없는 청소가 가능합니다.

이 프로토콜에서는 광택이 나는 스테인리스강 표면에서 슈도모나스 푸티다 생물막을 제거하기 위해 질소 퍼지 없이 CO2 에어로졸의 주기적인 제트를 사용했습니다. 실제로, 질소 퍼지는 열판 또는 적외선 램프로 가열하고 드라이 박스를 사용하는 것도 채택되었음에도 불구하고 세척 중에 발생하는 수분 응결을 줄여 제거 효율을 높이기 위해 많은 CO2 에어로졸 연구에서 사용되었습니다12. 표면 생물막 형성 및 최적화된 세척 절차는 아래에 설명되어 있습니다. 제거 효율은 표면의 생물막의 형광 강도를 측정하여 평가했습니다.

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프로토콜

바이오 필름 형성을위한 표면의 1. 준비

  1. 기계적 커터 칩으로 304 1 mm 두께의 스테인레스 판 (10 × 10 mm 2)를 잘라.
  2. 10 분 각각 아세톤, 메탄올, 탈 (DI) 물 순차적 칩의 초음파 세척을 수행합니다. 유기 오염 물질을 제거하고, 유리와 같은 물질로 이루어진 제성 컨테이너를 사용한다.
  3. 3-5 초 동안 DI 물 흐르는 칩을 헹군다.
  4. 3-5 초 동안 N 2 가스 흐름을 이용하여 칩을 건조.

세균성 문화의 2. 준비

  1. P.를 타고 -80 ° C 깊은 냉동고에 저장 재고 (친절 교수 성 동국 리, UNIST, 한국에서 제공) 푸티 다 KT2440.
  2. 1 분 후 상온에서 해동 한 동결 스톡 용액의 상층에 슬러시집니다. 원액의 용융 층으로 루프를 담근다.
  3. 루리아에 행진에 세균이 루프를 사용하여1.5 % 한천을 포함 -Bertani (LB) 플레이트.
  4. 박테리아 식민지 성장을 30 ℃에서 하룻밤 접시를 품어.
  5. 새로운 루프를 사용하여 플레이트에서 하나의 식민지를 선택합니다.
  6. 단일 박테리아 콜로니를 함유하는 루프와 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 LB 배지 10 ㎖를 접종한다.
  7. 30 ° C에서 16 시간 160 RPM의 진탕 배양기에서 국물을 품어.

표면에 3 biofilm 형성

  1. 각 칩의 표면을 살균, 1-2 초마다 5 회 핀셋 제조 된 칩의 각각을 픽업 70 % 에탄올에 담갔다. 칩이 침지시 핀셋으로 개최되어 있는지 확인합니다.
  2. 남아있는 에탄올을 제거 멸균 된 DI 물과 LB 배지 순차적으로 각 칩, 1 ~ 2 초마다 5 번 찍어.
  3. 이 칩과 잘 당 5 ml의 LB 배지로 6 웰 배양 판에이 칩을 놓습니다.
  4. LB 배지에 도달의 농도까지 박테리아 문화를 희석8 × 108 세포 / ㎖ (파장 600nm에서의 광학 밀도 : 0.8 ~).
  5. 희석 세균 배양의 50 μl를 잘 각각 접종.
  6. 바이오 필름의 형성을위한 24 시간 동안 흔들림없이 30 ° C에서 접시를 품어.

4. CO 2 에어로졸 청소

  1. 10 mM의 초산 암모늄 버퍼에 바이오 필름 형성 칩을 찍어 (휘발성) 5 회 느슨하게 부착 플랑크톤 박테리아를 제거합니다.
  2. 공기가 온화하게 흐르는 바이오 안전성 캐비닛에이 칩을 건조시킵니다.
  3. 건조 직후, 제트의 축선을 따라 CO 2 노즐로부터 20mm 인로드 위치에 칩을 배치했다. 40 ° 각도로 분사 축을 기울입니다.
  4. 가스 압력 조절기를 사용하여, 각각 5.3 MPa의 0.7 MPa의에 CO 2와 N 2 가스의 정체 압력을 설정합니다.
  5. 칩의 중앙 부분에 에어로졸 젯을 적용합니다. (2)해야 고체 CO 포함 화이트 에어로졸볼 수 있습니다. 5 초 동안 CO 2의 솔레노이드 밸브 "의"를 켠 다음 3 초 동안 "OFF"전원을 켜 : 주기적으로 수동으로 제어 스위치를 사용하여 (사이클 8 초). 질소 퍼지를 이용해야하는 경우, N (2)의 연속 공급을위한 솔레노이드 밸브를 켜.
  6. 16, 40 CO 2 에어로졸을 칩을 치료하고와 질소 퍼지없이 88 초. 음성 대조군으로 처리없이 칩을 유지합니다.

제거 효율 5. 분석

  1. 제어 및 에어로졸 처리 칩 세균 세포를 염색하기 위해 DI 물 : 1 μM 녹색 형광 핵산 얼룩 (500분의 480 nm의 여기 / 방출 파장)을 준비한다.
  2. 염색 용액에 칩을 놓습니다.
  3. 30 분 동안 37 ° C에서 빛이없는 배양기에서 배양 한 칩.
  4. 배양 후, 부드럽게 과도한 형광 색소를 제거하는 DI 워터를 흐르는 칩을 헹군다.
  5. 칩 위스콘신을 건조제 N 2 가스 흐름.
  6. 표면 형광 현미경하는 40X 대물 렌즈와 CCD 카메라를 사용하여 각각의 칩에 대한보기의 5 랜덤 필드 (321 × 240 μm의 2)의 현미경 이미지를 형광 가져 가라.
  7. 이러한 ImageJ에 같은 화상 처리 소프트웨어를 사용하여 각 이미지에 대한 형광 강도를 얻었다. ImageJ에에서 "프로세스"메뉴에서 "빼기 배경"기능을 사용하고 "분석"메뉴의 "설정 측정"창에서 "통합 밀도"를 선택합니다. 형광 강도를 얻기 위해 "분석"메뉴에서 "측정"을 수행.
  8. 다음 식에 따라 생물막 제거 효율을 계산한다 : 100 % × (제어 칩 I를 - 처리 칩 Ⅰ) / I 계산 된 형광 강도이다 (제어 칩 I).
  9. 제거 효율과 표준 편차 평균을 구합니다. 에 사용각각의 경우에 대해 최소 4 칩입니다.

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결과

CO 2 에어로졸은 P.을 제거하는 데 사용 된 푸티은 SUS304 표면 (그림 1)에서 생물막. 표면의 대부분은 성장의 24 시간 후, 바이오 필름으로 덮여 있었다. 생물막의 대부분은 CO 2 에어로졸 (도 2)를 이용하여 제거 하였다. 예상대로,도 3은 증가 CO 2 에어로졸 처리 시간 등의 생물막 제거 효율의 증가를 나타낸다. 88 초의 처리 시간의 경우, 제거 효율은 97.74 %와 함께 각각 질소 퍼지없이 98.29 %로 높은 것으로 측정되었다. 공기 온도가 23 ~ 24 °의 C이고 세정 실험을 수행했을 때의 상대 습도는 26~50%이었다.

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토론

이전에 우리는 CO2 에어로졸 세척7에서 CO2 가스 압력, 제트 각도 및 고체 표면까지의 거리에 대한 최적화 연구를 수행했습니다. 이전 연구와 달리 본 연구에서는 에어로졸에 질소 퍼지가 포함되지 않았습니다(그림 1). 또한 304 스테인리스강은 가장 일반적인 스테인리스강 중 하나이며 식품 산업에서 널리 사용되기 때문에 이 프로토콜에 사용되었습니다. 연마된 표면은 균일한 초점 거리와 감소된 광 산란으로 인해 형광 분석에 유용합니다. 박테리아 종인 P. putida는 생물막 연구 분야에서도 일반적으로 사용됩니다. 형광 강도는 표면에 부착된 생물막의 양을 정량화하는 데 사용되었습니다. 2차원 형광 이미지를 사용하여 표면의 생물막의 양을 정량화했습니다. 이 방법은 24시간 성장한 얇은 생물막에 충분할 수 있습니다. 그러나 두꺼운 생물막에는 공초점 3D 이미지를 사용해야 합니다. 이 방법은 간단하고 박테리아 세포의 생물학적 인식을 ...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

본 연구는 미래창조과학부 연구지원(# 2015R1A2A2A01006446)을 지원한 한국연구재단(NRF)의 기초과학연구사업의 지원을 받았다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
304 스테인레스 스틸Steelni
(한국)		광택 및 깍둑썰기한 것들
초음파 세척기Branson
(미국)		5510E-DTH
Luria-Bertani (LB)Becton, Dickinson and Company
(미국)		244620500 g
AgarBecton, Dickinson and Company
(미국)		214010500 g
6-well culture plateSPL Life Sciences
(South Korea)		32006
Ammonium acetate bufferSigma-Aldrich
(미국)		66740410 mM
Dual gas unitApplied Surface Technologies
(USA)		K6-10DGCO2 gas
용 노즐 1개 & N2 가스용 노즐 8
SYTO9Thermo Fissher Scientific
(미국)		InvitrogenExcitaion: 480 nm
방출: 500 nm
Epifluorescence microscope Nikon(일본)Eclipse 80i
40X 대물 렌즈Nikon
(일본)		Plan FluorNA: 0.75
CCD 카메라 Photometrics
(미국)		Cool SNAP HQ2모노크롬
개

참고문헌

  1. Jain, A., Gupta, Y., Agrawal, R., Khare, P., Jain, S. K. Biofilms - A microbial life perspective: A critical review. Crit. Rev. Ther. Drug. 24 (5), 393-443 (2007).
  2. Bott, T. R. Biofouling control with ultrasound. Heat Transfer Eng. 21 (3), 43-49 (2000).
  3. Meyer, B. Approaches to prevention, removal and killing of biofilms. Int. Biodeterior. Biodegradation. 51 (4), 249-253 (2003).
  4. Hong, S. H., et al. Effect of electric currents on bacterial detachment and inactivation. Biotechnol. Bioeng. 100 (2), 379-386 (2008).
  5. Nandakumar, K., Obika, H., Utsumi, A., Ooie, T., Yano, T. In vitro laser ablation of laboratory developed biofilms using an Nd:YAG laser of 532 nm wavelength. Biotechnol. Bioeng. 86 (7), 729-736 (2004).
  6. Gibson, H., Taylor, J. H., Hall, K. E., Holah, J. T. Effectiveness of cleaning techniques used in the food industry in terms of the removal of bacterial biofilms. J. Appl. Microbiol. 87 (1), 41-48 (1999).
  7. Kang, M. Y., Jeong, H. W., Kim, J., Lee, J. W., Jang, J. Removal of biofilms using carbon dioxide aerosols. J. Aerosol Sci. 41 (11), 1044-1051 (2010).
  8. Cha, M., Hong, S., Kang, M. Y., Lee, J. W., Jang, J. Gas-phase removal of biofilms from various surfaces using carbon dioxide aerosols. Biofouling. 28 (7), 681-686 (2012).
  9. Dwidar, M., Hong, S., Cha, M., Jang, J., Mitchell, R. J. Combined application of bacterial predation and carbon dioxide aerosols to effectively remove biofilms. Biofouling. 28 (7), 671-680 (2012).
  10. Cha, M., Hong, S., Lee, S. Y., Jang, J. Removal of different-age biofilms using carbon dioxide aerosols. Biotechnol. Bioprocess Eng. 19 (3), 503-509 (2014).
  11. Singh, R., Monnappa, A. K., Hong, S., Mitchell, R. J., Jang, J. Effects of Carbon Dioxide Aerosols on the Viability of Escherichia coli during Biofilm Dispersal. Sci. Rep. 5, 13766(2015).
  12. Sherman, R. Carbon Dioxide Snow Cleaning. Particul. Sci.Technol. 25 (1), 37-57 (2007).

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