B 형 간염 바이러스 리포터 시스템 개발은 복제주기의 초기 단계를 모니터링하기

요약

여기서 우리는 HBV의 생활주기의 초기 단계를 모니터링하는 새롭게 개발 된 B 형 간염 바이러스 (HBV) 리포터 시스템을 설명한다. 시험 관내 시스템에서 간략화 이것은 높은 처리량 전략을 사용 항 HBV 에이전트 스크리닝 도울 것이다.

초록

현재 인간 면역결핍 바이러스 1(HIV-1) 및 C형 간염 바이러스(HCV)와 같은 게놈에 리포터 또는 마커 단백질과 같은 외부 유전자를 가지고 있는 다양한 바이러스의 재조합 형태를 구축할 수 있습니다. 이러한 재조합 바이러스는 일반적으로 감염된 세포에서 원래 바이러스의 수명 주기를 충실하게 모방하고 동일한 숙주 범위 의존성을 나타냅니다. 재조합 바이러스의 개발은 억제제의 효율적인 스크리닝과 특정 숙주 인자의 식별을 가능하게 합니다. 그러나 현재까지 재조합 B형 간염 바이러스(HBV)의 구축은 다양한 실험적 한계로 인해 어려웠습니다. 주요 한계는 HBV의 조밀한 게놈 크기와 1.3 게놈 크기를 초과하지 않는 상당히 엄격한 게놈 크기로, virions로 패키징되어야 합니다. 따라서, 게놈 DNA의 결실이 수행되지 않는 경우 삽입되는 외래 유전자의 크기는 0.4kb 미만이어야 합니다. 따라서 이러한 크기 제한을 극복하기 위해서는 일부 HBV DNA의 삭제가 필요합니다. 본 연구에서는 HBV pol 코딩 영역의 일부를 삭제하여 HBV 코어 코딩 영역의 일부를 리포터 유전자로 대체하여 HBV 복제 주기의 초기 단계를 모니터링하기 위해 리포터 유전자를 인코딩하는 재조합 HBV의 구축에 대해 보고합니다. 리포터 활동으로 모니터링한 재조합 HBV 감염 검출은 HBV 감염을 평가하기 위해 현재 사용 가능한 기존 방법을 사용한 검출보다 민감도가 높고 비용이 저렴했습니다. 이 시스템은 항 HBV 억제제, 숙주 인자 및 바이러스에 취약한 세포의 식별을 위한 고처리량 스크리닝을 포함한 여러 응용 분야에 유용할 것입니다.

서론

B 형 간염 바이러스 (HBV) 만성 감염은 만성 간 질환 ^(1)의 주요 위험 인자이다. 현재의 치료 전략은 인터페론 - 자극 된 유전자의 ^기능이 관통 HBV의 POL 기능 및 / 또는 감염된 개인에서 면역 반응을 활성화 타입 I 인터페론의 투여뿐만 아니라 간접적으로 억제 HBV의 증식을 억제 뉴클레오티드 유사체에 기반하지만, 이러한 치료는 HBV를 제거 할 수없는 DNA 완전히 ^3. 또한, 안티 폴 화제에 내성 HBVs의 출현 문제 ^4이다. 직접 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 또는 C 형 간염 바이러스 (HCV)의 라이프 사이클의 상이한 단계를 타겟팅 결합 항 바이러스제의 투여가 성공적으로 억제하거나 바이러스 (들)를 박멸 도시 하였다. 이 아이디어는 H의 상이한 단계에 직접 작용 항 HBV 제 (들)의 개발과 마찬가지로BV 라이프 사이클 미래 HBV 치료를 설정하는 것이 중요하다.

일반적으로, 대상 바이러스의 시험 관내 배양 시스템에서 간단한의 설립은 항 바이러스 제제의 개발을 용이하게한다. 그러나, 항 HBV 제를 선별 할

프로토콜

리포터 단백질을 코딩하는 재조합 HBV 1. 제조

1. 인 HepG2 세포의 제조
   1. 세포 배양 배지를 준비 (둘 베코 변형 이글 배지에 10 % 소 태아 혈청 (FBS로 보충 (DMEM)), 100 U / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신, 100 U / ㎖의 비 필수 아미노산).
   2. 배지 10 ml의 형질 전날에 10 cm 콜라겐 코팅 접시 플레이트 4 × 10 ⁶ 인 HepG2 세포. 가습 된 5 % CO ₂ 인큐베이터에서 37 ℃ 인 HepG2 세포를 인큐베이션.
      주 : 약 4 × ¹⁰⁶ 인 HepG2 세포 배양 배지 10 ㎖의 10cm 콜라겐 코팅 접시에 도금되는 경우, 그들은 70~90% 합류 다음날 것이다.
2. 형질
   1. pUC1.2HBV 델타 엡실론 ^(15)의 5 μg의 및 pUC1.2HBV / NL ^(15)의 5 μg의와 형질 인 HepG2 세포 형질을 사용하여제조업체의 지침에 따라 시약.
   2. 다음날, 배지를 제거하고 신선한 배지를 가하여 10.....

결과

도 1은 게놈에서 HBV 게놈의 RNA 전사는 바이러스 단백질 및 코딩 영역의 개략도를 도시한다. 게놈의 리포터 유전자 및 그 위치도 표시됩니다. 도 2는 리포터 유전자를 포함하는 HBV 리포터 플라스미드 및 헬퍼 플라스미드를 나타낸다. pUC1.2HBV / NL 기자는 pUC1.2HBV ^(16)의 preCore의 mRNA의 전사 개시 사이트에서 염기 위치를 223-811을 삭제 한 후 리포터 유전자를 삽입하여 제작 하였다. 이입의 신호 서열의 점 돌연변이와 pUC1.2HBVdelta은 부위 특이 적 변이 PCR에 의해 생성 하였다. 리포터 플라스미드 (pUC1.2HBV / NL) 및 헬퍼 플라스미드 (pUC1.2HBVdelta)는 힌 DIII 에코 RI로 분해 한 다음 전기 영동 하였다. 는 pUC 플라스미드 3.0 킬로바이트 및 1.......

토론

B 형 간염 게놈 코어, 폴리머, 표면 및 X의 ORF (그림 1) 등 4 차 오픈 리딩 프레임 (ORF를)가 있습니다. 이 네 HBV 개의 ORF의 전사가 단단히 네 프로모터에 의해 조절된다 다음 precore / 핵심 프로모터 인핸서 II를 포함, S1 프로모터, S2 프로모터 및 X 프로모터 인핸서 ⁽¹⁸⁾ I를 포함. 3.5 킬로바이트 및 3.4 킬로바이트의 mRNA는 각각 PreCore 및 핵심 단백질로 번역된다. 큰 봉투 단백질 (L)의 가장 큰 subgenomic mRNA를 (2.5 킬로바이트)에서 생산되며, 중간 (M) 작은 표면 단백질 (S)는 짧은 성적 증명서 (2.1 킬로바이트)로 변환됩니다. 0.8 킬로바이트 성적 증명서는 X 단백질 ^{19, 20의} 번역을위한 템플릿입니다. pregenomic RNA의 5 '및 3'말.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
나노-글로 루시페라제 분석 리젠	프로메가	N1110
페니실린-스트렙토마이신 혼합 용액	나칼라이 테스크	09367-34
MEM 비필수 아미노산 용액	Thermo Fisher Scientific	11140050
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11995065
Opti-MEM I 저감 혈청 Medium	Thermo Fisher Scientific	31985070
100mm/콜라겐 코팅 접시	Iwaki	4020-010
Lipofectamine 3000 Transfection 시약	Thermo 피셔 사이언티픽	L3000001
폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 6000	시그마-알드리치	81255
폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 8000	시그마-알드리치	89510
NaCl	Nacalai 테스크	31319-45
0.5 mol / L EDTA 솔루션	Nacalai tesque	06894-14
트리스 - HCl	Nacalai 테스크	35434-21
Millex-HP, 0.45 μ m, polyethethersulfone, 필터	Merck Millipore	SLHP033RS
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Collagen coated 96-well plate	Corning	NO3585
Passive Lysis 5x Buffer	Promega	E1941
GloMax 96 Microplate Luminometer	Promega	E6501
Sucrose	Nacalai tesque	30403-55
광도계 플레이트	Greiner bio-one	655075
HepG2-NTCP1-myc-clone22	-	-	Reference 15
pUC1.2HBV delta epsilon	-	-	Reference 15
pUC1.2HBV/NL-			-Reference 15
50 ml tube	Violamo	1-3500-02
Anti-Myc 항체	Sigma-Aldrich	C3956
HBIG	Japan Blood Products	Organization-IFN
-β	모치다 제약	14987224005413
헤파린	시그마-알드리치	H3393

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