방법 논문

양적 3D 인 실리코 모델링 (q3DISM)

DOI:

10.3791/54868

⸱

2016년 12월 26일

 ,  , 
1Zilkha Neurogenetic Institute, University of Southern California (USC)

이 논문에서

요약

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우리는 알츠하이머 병의 쥐 모델에서 단핵 식세포에 의해 대뇌 아밀로이드 β (Aβ) 식균 작용의 실리코 모델링 (q3DISM)의 양적 3D에 대한 방법론을 개발했다. 이 방법은 생체 내에서 거의 모든 식세포 이벤트의 정량화를 위해 일반화 될 수있다.

초록

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신경 염증은 이제 신경 퇴행성 질환의 주요 병인 요소로 인식되고 있습니다. 단핵 식세포는 식균 작용 및 파편과 이물질의 통관에 대한 책임 선천성 면역 세포이다. 이 세포들은 주변에서 침투 미세 아교 세포로 알려진 CNS 상주 식세포 및 단핵 식세포를 포함한다. 광학 현미경은 일반적으로 쥐 또는 인간의 두뇌 표본 식세포를 시각화하는데 사용되었다. 그러나 질적 방법은 생체 내 식균 작용의 결정적인 증거를 제공하지 않았습니다. 여기, 우리는 실리 모델링 (q3DISM), 설치류 알츠하이머 병 (AD) 모델에서 단핵 식세포에 의해 아밀로이드 β (Aβ) 식균 작용의 진정한 3D 정량을 가능하게하는 강력한 방법 양적 차원을 설명합니다. 이 방법은 형광 Aβ는 쥐의 뇌 섹션 phagolysosomes 내에서 캡슐화 시각화하는 것을 포함한다. 대형 Z 차원 공 촛점 데이터 세트는 3D는 A & 정량을 위해 재구성# 946; 공간적으로 phagolysosome 내에서 colocalized. 우리는 마우스 및 래트의 뇌에 q3DISM의 성공적인 적용을 설명하지만,이 방법은 모든 조직에서의 거의 모든 식세포 이벤트에 확장 될 수있다.

서론

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알츠하이머 병 (AD), 가장 일반적으로 노인성 치매 1 "치매"β 아밀로이드 플라크 만성 낮은 수준의 신경 염증, 타우 병증, 신경 세포의 상실,인지 장애이 대뇌 아밀로이드 β (Aβ)의 축적을 특징으로 . AD 환자의 뇌에서 신경 염증이 성상 세포와 단핵 식세포 반응에 의해 책정되어 주변 Aβ 예금 3 (자신의 주변 기원은 불분명 대 중앙 있지만, 미세 아교 세포로 함). 중추 신경계의 선천성 면역 파수꾼으로, 미세 아교 세포는 중앙 뇌 Aβ을 취소 위치한다. 그러나, Aβ 플라크에 소교 모집이있는 경우, 약간의 Aβ의 식세포 작용 4,5 동반한다. 하나의 가설은 미세 아교 세포가 Aβ의 작은 어셈블리를 phagocytozing에 의해 초기에 신경 있다는 것입니다. 그러나 결국 이러한 세포는 압도적 인 Aβ 부담 및 / 또는 연령 관련 기능 D와 같은 신경 독성이 될ecline, 신경 독성과인지 기능 저하 (6)에 기여, 기능 장애 염증성 표현형에 미세 아교 세포를 불러 일으킨다.

최근 게놈 넓은 협회 연구 (GWAS)는 식균 작용 8-11을 조절하는 핵심 선천성 면역 경로 (7)에 속하는 AD 위험....

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프로토콜

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연구 윤리의 진술 : 여기에 설명 된 동물을 포함한 모든 실험은 남부 캘리포니아 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 대학에 의해 승인 및 연구소의 평가 및 인증을위한 협회 국민 건강 지침의 연구소 및 권장 사항을 엄격히 준수 수행 하였다 동물 관리 국제.

1. 쥐의 뇌 분리 및 면역 염색을위한 준비

DAY 1 :

  1. 세 TgF344-AD 쥐를 놓습니다 (14 개월) 또는 연속 깊은 이소 플루 란 마취 (4 %)에서 APP / PS1 마우스 (12 개월). 발가락 핀치에 의해 마취의 깊이와 철수 반사의 부재를 평가합니다.
  2. 흉곽의 양쪽을 잘라 마음을 노출 올립니다. 심장의 좌심실로 23 G 바늘을 삽입하고 우심방에 작은 절개를합니다. 얼음처럼 차가운 인산 완충 식염수로 transcardial 관류하여 방혈로 진행연동 펌프 (마우스 30 mL를 150 - 쥐에 대한 200 ㎖)을 사용하여 (PBS).
  3. 피부로 꼬리 정중선 절개를 확인하고 옆으로 피부와 근육을 이동합니다. 정중선을 따라 두개골 상부를 통해 상기 눈 사이 잘라. 뼈 플레이트를 제거하고 두개골에서 뇌 전체를 격리.
  4. 코로나 쥐 뇌 매트릭스로 뇌를 놓고는 분기에 슬라이스. 4 ℃에서 파라 포름 알데히드....

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결과

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q3DISM 위에서 상세히위한 다단계 방법을 사용하여, 우리는 APP / PS1 마우스 (도 1) 및 TgF344-AD 래트 (도 2)의 뇌에서 단핵 phagolysosomes으로 Aβ 흡수를 정량화 할 수있다. 따라서, q3DISM 방법론은 AD의 마우스 및 쥐 모델에서 단핵 식세포의 분석을 사용할 수있다. 흥미롭게도, CD68 + phagolysosomes가 차지하는 체적은 크게 두 APP / PS1 마우스 (도 1b, C) 및 TgF344-AD 래트 (도 2B, C)의 플라크로부터 떨어진 비교와 연관된 Iba1 + 단핵 식세포에서 증가된다. 이러한 데이터는 플라크 근처 단핵 식세포가 떨어져 플라크에서있는 세포에 비해 식균 작용을위한 태세 것으로 나타났다. 다른 Aβ 이형태 염색 데이터의 범위를 예시하기 위.......

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토론

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우리는 단핵 식세포에 의해 생체 내에서 Aβ의 식세포 작용의 진정한 3D 정량이 보고서에서 설명하는 프로토콜은 특정 세포와 세포 내 구획의 표시뿐만 아니라 Aβ 예금에 의존한다. 특히, 우리는 Iba1 (이온화 된 칼슘이 어댑터 분자 1 바인딩), 세포 활성화 (18, 19)에 막 파동 운동과 식균 작용에 관여하는 단백질이 뇌 단핵 식세포를 염색하는 데 사용. Iba1 + 세포는 일반적으로 뇌의 미세 아교 상주 간주되는 반면, 말초 단핵 식세포 침윤이 immunolabeled 셀의 서브 세트를 포함 할 가능성이 남아있다. 램프 1 20 CD68 21 : 세포 내 phagolysosomes 항체가 리소좀 / 엔도 솜 관련 막 당 단백질 (LAMP) 가족의 구성원 인식에 공개됩니다. 후자는 주로 작은 분수가 셀 s의 순환과, 리소좀과 엔도 좀에 지역화urface. 램프 1과 CD68 항체는 모두 성.......

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공개 사항

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저자는 공개 아무것도 없어.

감사의 글

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M-V입니다. 지에스. BrightFocus Foundation Alzheimer's Disease Research Fellowship Award(A2015309F)와 Alzheimer's Association, California Southland Chapter Young Investigator Award의 지원을 받고 있습니다. T.M.W.는 ARCS 재단과 John Douglas French Alzheimer's Foundation Maggie McKnight Russell-JDFAF Memorial Postdoctoral Fellowship의 지원을 받습니다. 이 연구는 미국 국립신경장애질환연구소(National Institute on Neurologic Disorders and Stroke, 1R01NS076794-01, to T.T.), 알츠하이머협회 제니스 펠로우상(Alzheimer's Association Zenith Fellows Award, ZEN-10-174633, to T.T.), 미국노화연구연맹(American Federation of Aging Research)/엘리슨 의학재단(Ellison Medical Foundation)의 줄리 마틴 미드 커리어 어워드(Julie Martin Mid-Career Award in Aging Research, M11472, to T....

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
IsofluraneAbbottNDC 0044-5260-05
해부 가위VWR82027-582
해부 가위 무딘 팁VWR82027-588
핀셋VWR94024-408
23 G 바늘VWRBD305145
연동 펌프 FH10Thermo Scientific72-310-010
PBS 10xBioland ScientificPBS01-02인산염 완충 식염수; 작업 집중력 1x
어른용 마우스 뇌 매트릭스, 코로나 슬라이스, 스테인레스 스틸 1 mm 켄트 사이언티픽RBMS-200C
성인 랫 브레인 매트릭스, 코로나 슬라이스, 스테인리스 스틸 1 mm 켄트 사이언티픽RBMS-305C 
32% 파라포름알데히드 수용액(PFA)EMS15714-S주의: 독성. 작업 농도: PBS
에탄올VWR89125-188다양한 농도, 프로토콜 참조
Tissue-Tek Uni-cassettes SakuraVWR25608-774
임베딩 및 침투 파라핀VWR15147-839
마이크로톰 Leica RM2125Leica Biosystems
일회용 마이크로톰 블레이드 VWR25608-964
수조 Leica HI 1210Leica Biosystems
마이크로 슬라이드 Superfrost plusVWR48311-703
XyleneSigma-Aldrich534056-4X4L주의: 독성 
Target Retrieval Solution 10xDAKOS1699작업 농도 1x
KimWipesVWR21905-026
소수성 PAP 펜VWR95025-252
Triton X-100VWR97062-208
Normal Donkey Serum (NDS)Jackson Immuno017-000-121
CoverslipsVWR48393081
DAPILife TechnologiesP36935
유리 슬라이드 랙VWR100492-942
Iba1 항체 (다클론, 토끼)Wako019-19741 작업집중도 1:200
Iba1 항체 (polyclonal, goat)LifeSpan BioscienceLS-B2645작업농도 1:200
rat CD68 [KP1] 항체 (monoclonal, mouse)Abcamab955작업농도 1:200
mouse CD68 [FA-11] 항체 (monoclonal, rat)Abcamab53444작업농도 1:200
mouse CD107a (LAMP1) 항체 (monoclonal, rat)Affymetrix14-1071작업농도 1:100
베타-아밀로이드, 17 - 24 (4G8) 항체 (단클론, 마우스)CovanceSIG-39220작업농도 1:200
베타-아밀로이드, 1 - 16 (6E10) 항체 (단클론, 마우스)CovanceSIG-39320작업농도 1:200
OC 항체 (다클론, 토끼)D. H. Cribbs and C. G. Glabe (UC Irvine)의 재능작업농도 1:200
Alexa Fluor 488 마우스 2차 항체InvitrogenA-11001작동 농도 1:1,000
Alexa Fluor 488 쥐 2차 항체InvitrogenA-11006작동 농도 1:1,000
Alexa Fluor 594 토끼 2차 항체InvitrogenA-11037작동 농도 1:1,000
Alexa Fluor 594 염소 2차 항체InvitrogenA-11080작동 집중 1:1,000
Alexa Fluor 647 마우스 2차 항체InvitrogenA-21235작동 집중 1:1,000
Alexa Fluor 647 토끼 2차 항체InvitrogenA-21443작동 집중 1:1,000
침수 오일Nikon 
A1 컨포칼 현미경Nikon 
NIS Elements Advanced Research 소프트웨어Nikon 
Imaris:Bitplane 소프트웨어 버전 7.6Bitplane"coloc" 및 "supass" 모듈을 사용합니다.  또는 오픈 소스 프리웨어  ImageJ는 공동 국소화에 사용할 수 있습니다  공초점 Z-스택 데이터 세트 분석.
에서 4%

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brookmeyer, R., et al. National estimates of the prevalence of Alzheimer's disease in the United States. Alzheimers Dement. 7 (1), 61-73 (2011).
  2. Selkoe, D. J. Alzheimer's disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (7), (2011).
  3. Heneka, M. T., G....

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