방법 논문

신경 화학적 마커에 대한 Biocytin 충전 및 가공 섹션의 면역 염색

DOI:

10.3791/54880

⸱

2016년 12월 31일

 ,  ,  , 
1Graduate School of Biomedical Sciences, Rutgers New Jersey Medical School, 2Department of Pharmacology, Physiology and Neuroscience, Rutgers New Jersey Medical School

이 논문에서

요약

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이 프로토콜은 biocytin 충전 및 후속 면역 후 처리를 사용하여 전기 생리 녹음하는 동안 패치 신경 세포의 형태 학적 복구를위한 방법을 제시한다. 우리는 염색 coverslipped 된 두꺼운 biocytin 채워진 부분은 나중에 두 번째 차 항체 일 개월 restained 될 수 있음을 보여줍니다.

초록

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패치 클램프 기술을 이용하여 세포의 전기 생리 학적 기록 소성 패턴에 따라 다른 유형의 연결의 식별을 허용했다. 기록 전극의 biocytin / neurobiotin의 포함은 수지상 arborization 및 기록 된 신경 세포의 축삭의 대상 지역을 결정하는 데 필요한 형태 세부 사항의 사후 복구를 허용합니다. 그러나, 별개의 신경 화학적 정체성과 기능, 세포 형 특정 단백질에 대한 면역 조직 화학 염색과 형태 학적으로 유사한 신경 세포의 존재 주어진 결정적으로 신경 세포를 식별하는 데 필수적이다. 네트워크 연결성을 유지하기 위해, 기록 용 생리 뇌 절편을 300㎛ 이상의 두께로 제조된다. 그러나,이 두께는 종종 조직의 resectioning을 필요로 인해 항체 침투 문제에 면역 조직 후 처리를 방해한다. 조각의 Resectioning 종종 있습니다 END_STRONG_1, 도전적인 예술이다조직 및 세포 형태의 손실이 팅되는 전기 생리 데이터를 사용할 수 없게 된 데이터를 렌더링을 얻었다. 신경 마커의 선택에서의 데이터 손실과 가이드를 제한 할 형태의 복구 이후, 우리는 보조 면역이어서 제 1 셀 형태를 회수하는 전략을 채택 하였다. 우리는 생리 녹음 및 신경 화학적 정체성을 결정하는 섹션의 restaining 다음 형태의 회복에 대한 후속 직렬 면역 염색 동안 충전 biocytin하는 실용적인 접근 방식을 소개합니다. 우리는 (PFA) 파라 포름 알데히드로 고정 스테인드 및 coverslipped biocytin으로 가득 차 있었다 섹션을 제거하고 나중에 두 번째 차 항체 일에 restained 될 수 있음을보고한다. 이 restaining은 커버 슬립을 제거, 완충액 섹션 세정 및 신경 화학적 신원을 공개하는 일차 및 이차 항체의 배양을 수반한다. 상기 방법은 DAT를 제거하는 것이 유리하다형태를 복구 할 수 없기 때문 및 신경 화학적 마커를 좁혀에 대한 손실은 형태에 따라 시험한다.

서론

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뇌는 개별의 연결 요소의 구조적 및 기능적 특성의 다양성 알려져있다. 뇌 기능과 병리에 뚜렷한 신경 세포 유형의 역할을 이해하는 것은 특성화 및 신경 세포의 명확한 식별이 필요합니다. 축삭 arborization의 패턴이 잠재적 인 시냅스 대상을 식별하는 동안 구조적으로, somato-수지상 위치에 의해 정의 된 형태 학적 특징은, 특정 신경 세포가받는 잠재적 입력을 결정합니다. 신경 세포의 구조적 다양성은 라몬 Y Cajal의 정액 조직 학적 연구 1 일부터 평가되고있다. 단일 셀에 기록하는 기술의 출현은 구조적으로 구별되는 신경 또한 소성 패턴 및 시냅스 특성의 차이를 보여주는 것으로 나타났다. 구조와 생리의 다양성은 GABA 성 억제 신경 2,3에 특히 분명하다. 또한, structurall 것이 점차 명백되었다Y 유사한 신경 기능의 차이 4 해당하는 다른 신경 화학적 마커와 쇼를 표현할 수 있습니다. 마찬가지로, 동일한 신경 화학적 마커 뉴런은 별개의 구조와 기능 5-10을 가질 수 있습니다. 따라서, 실제로, 네트워크 내의 뉴런의 기능적 특성 분석 및 그들의 역할은 두 형태 학적 및 신경 화학적 ID를 정의 수반한다. 비록 특정 신경 화학적 마커 타겟팅 리포터 마우스 라인의 출현으로는 면역 조직학

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프로토콜

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전기 생리학 중 1 Biocytin 필링

참고 : 독자가 여기에 정교하지 않는 기본적인 패치 클램프 녹음 기술과 계측 19-22, 대체 소스를 참조 할 수 있습니다. 여기에 설명 된 단계는 패치 클램프 녹음 용 장비 및 절차가 이미 설치되어 있다고 가정하고 설명을 biocytin-작성하고 사후 면역 염색 관련 세부 사항에 제한됩니다. 이 원고에 설명 된 모든 실험 쥐에서 수행되었다.

  1. 350 μm의 23 - vibratome를 사용하여, (300)의 두께로 원하는 영역의 실제 뇌 섹션을 준비한다.
  2. 내부 솔루션 (6) 1 ㎖에 biocytin 2 mg을 추가하여 0.2 % biocytin을 포함하는 내부 솔루션을 준비합니다. biocytin이 완전히 용해 될 때까지 15 분 - 최상의 결과를 얻으려면, 10 내부 용액을 초음파 처리. 다음에, 0.2가 장착 된 1 mL의 주사기의 내부 용액로드# 160; μm의 기공 크기의 폴리 프로필렌 필터 팁은 microloader에 연결합니다. 내부 용액에서의 Mg-ATP와 나-GTP의 안정성을 유지하기 위해 차가운 ​​팩이 로딩 주사기를 유지합니다.
    참고 : 내부 솔루션을 포함하는 칼륨 글루코 네이....

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결과

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성공적으로 완료되면, 섹션은 biocytin 채우기와 immunolabeling 2 단계에서 수행 공 촛점 또는 표면 형광 현미경을 사용하여 이미지화 할 수있다 유지한다. 또한, 처리 된 부분도 그림 2 절에서 3 단계에서 후속 처리하는 동안 표시된 항원에 대한 면역 염색을 보여줍니다, 두꺼운 부분 (300 μm의)에서 biocytin 가득한 신경 세포의 형태는 스트렙 타비 딘을 사용하여 밝혀졌다 빨간색과 첫 번째 주 (CB (1) R)으로 시각화 녹색으로 시각화. 첫 번째 면역 염색은 PFA 고정의 7 일 이내 내에서 수행되었다. 슬라이스는 CCK 항체에 대한 재 염색 전에 공 초점 레이저 주사 현미경을 이용하여 묘화하고, 2 개월 동안 저장되고, 수성 매질 장착 장착 하였다. 축삭의 아버 (그림 2E)을 포함하여 기록 된 신경 세포의 형태를, 주, 공 초점로 이미지로부터 재구성 된첫 번.......

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토론

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프로토콜 내에서 중요한 단계

biocytin으로 패치 된 셀을 작성하는 형태의 완전한 복구를 보장 할 수있는 가장 중요한 단계입니다. 셀의 전체 복구를 들어, 슬라이싱하는 동안 프로세스의 절단을 최소화하는 최적의 슬라이스 방향을 선택하는 것이 필수적이다. 이 방향은 시험중인 회로 및 세포 유형에 따라 다를 수 있습니다. 다음으로, 상기 biocytin가 축삭 돌기 및 확산에 대한 충분한 시간을 허용하기 위해 필수적이다. 이러한 neurobiotin 같은 몇몇 염료는 또한 간극 연접 통해 기록 셀에 연결된 뉴런을 관통 할 수있다. 피펫 팁의 크기는 소마 개구부가 크고 피펫 팁이 너무 적 으면 biocytin로드가 손상 될 때 인출하는 경향으로 최적화 될 필요가있다. 또한, 적절한 절차 전체 세포 모드로부터 이탈하면서 소마 복구에 필수적이다. 24 시간 동안 기록, 이후 배양 한 후PBS이어서 4 % PFA의 슬라이스의 조직의 가교 결합은 면역 중요.......

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공개 사항

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저자는 공개 아무것도 없어.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 VS.에 NIH / NINDS R01 NS069861 및 NJCBIR CBIR14IRG024의 지원을 인정하고 싶습니다

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
NaClSigmaS7653면역염색
KClFluka60129면역염색
Na2HPO4 시그마S7907면역염색
KH2PO4 Sigma229806면역 염색
Triton X-100SigmaT8787면역 염색
기니피그 항 CB1 SigmaAf530-1면역염색
마우스 anti CCKCURE,UCLA 제공, G. OhningImmunostaining
Rabbit anti ParvalbuminSwantPV27Immunostaining
Streptavidin, Alexa Fluor conjugateMolecular ProbesS11227Immunostaining
Normal goat serum (NGS)SigmaG9023Immunostaining
벡타쉴드 Vector LabsH-1000면역염색
2차 항체Invitogen 분자 프로브Alexa Fluor 접합 염료면역염색
Labnet 궤도 저속 쉐이커BioexpressS-2030-LS면역염색
겸자Dumont11231-30면역염색
슬라이드 폴더EMS71520면역염색
Vibratome VT 1200 SLeica14048142066전기생리학
Multiclamp 700B 증폭기분자 장치Multiclamp 700B전기생리학
pCLAMP 10 소프트웨어분자 장치pCLAMP 10 전기생리학
디지타이저Molecular DevicesDigidata 1440 디지타이저전기생리학
필터 팁Nalgene171-0020전기생
리학Sonicator Fisher Scientific15-335-100전기생리학
마이크로로더Eppendorf930001007Electrophysiology
BiocytinSigmaB4261전기생리학

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Garcia-Lopez, P., Garcia-Marin, V., Freire, M. The histological slides and drawings of cajal. Front Neuroanat. 4, 9(2010).
  2. Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885....

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재인쇄 및 허가

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