선형 아가로 오스 채널을 사용하여 공부하기 초파리 애벌레 크롤링 동작

요약

초파리 유충 행동의 신경 제어를 연구하는 강력한 모델 시스템입니다. 이 책은 반복 크롤링 동작 중에 애벌레 구조의 역 동성을 정량화하는 선형 크롤링 및 방법의 지속적인 관찰을 유도하는 선형 아가로 오스 채널의 사용을 설명합니다.

초록

초파리 애벌레 크롤링는 감각 운동 행동의 신경 제어를 연구하는 강력한 모델로 부상하고있다. , 일시 중지 전환 및 사행 : 그러나, 평면 오픈 표면에 애벌레 크롤링 동작을 포함하여 복잡하다. 운동의 레퍼토리에서 이러한 복잡성은 단일 크롤링 보폭주기 동안 발생하는 이벤트의 상세한 분석을 방해한다. 이 장애물을 극복하기 위해, 선형 아가로 오스 채널은 직선, 유지, 리듬 크롤링에 애벌레 행동에 제약을가 하였다. 아가 채널 초파리 애벌레 본체 모두 광학적으로 투명하기 때문에 원리 적으로, 유전자 코드에 의해 표지 된 형광 프로브 유생 구조의 움직임을 그대로 자유롭게 움직이는 유충으로 모니터링 할 수있다. 과거에는, 유충은 선형 채널에 배치하고, 전체 유기체 세그먼트 레벨 크롤링 근육 ^1을 분석 하였다. 앞으로 채널에서 크롤 유충 신경을 모니터링 칼슘 이미징에 사용될 수최종 활동. 더욱이, 이러한 방법은 어떤 유전자형의 유충 및 연구원 설계된 채널로 사용될 수있다. 따라서 아래 제시된 프로토콜은 모터 제어를 이해하는 모델로서 초파리 유충을 사용하여 연구에 널리 적용 할 수있다.

서론

이 방법의 전반적인 목표는 세부에서 초파리 애벌레 크롤링을 연구하는 것입니다. 운동 실험 개발 및 모터 제어 이론 ² 테스트에서 중요한 역할을 해왔다. 전통적으로 운동은 수생 동물 (예를 들어, 거머리, 칠성 장어, 올챙이) ^3에서 연구되어왔다. 이러한 동물의 운동의 반복적 인 특성은 운동 구동 생물 물리학 이벤트 분석 및 운동에 수반 신경 소성 패턴 모니터링, rhythmogenesis 연구 허용했다.

용이 한 유전 특성이 잘 개발, 제 1 및 제 2 령기에서 광학적으로 투명 인 몸 전체의 진행을 투과형 전자 현미경 재구성 : 운동의 연구 초파리 유충의 사용은 다른 모델 시스템에 비해 이점의 독특한 조합을 제공한다 신경계 ^4-6. 그러나, 초파리 애벌레로 코평면 오픈 표면에 운동은, 일시 정지를 포함하는 다소 복잡한 회전 및 사행 ^7을 크롤링합니다. 이 공보는 유충이 직선 리듬 크롤링 동작을 유지하도록 실시합니다 초파리 유충의 전위의 동작을 안내하는 리니어 아가 채널을 사용하는 방법을 제시한다.

대신 평면 오픈 표면에 행동, 아가로 오스 채널에서 초파리 유충의 행동을 연구, 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 연구자들은 특히 애벌레 행동 레퍼토리의 일부인 많은 운동에서 동작을 크롤링 선택할 수 있습니다. 둘째, 유충의 신체 크기에 비해, 채널의 폭을 조정함으로써, 기어 속도를 조정할 수있다. 셋째, 채널 유충 유충로드 및 상기 채널 내에서 배향되는 방식에 따라 지느러미, 복부 또는 측면으로부터 볼 수 있도록 허용한다. 관심의 구조를 크롤링하는 동안 지속적으로 표시하는 애벌레 방향이 다재 다능 한 수 있습니다. 네번째,채널 현미경 목적의 다양한 사용하기위한 의무이다. 예를 들어, 선형 채널 / 또는 스피닝 디스크 공 초점 현미경 ^(1)의 고해상도 영상 및 밝은 필드 stereoscopes에서 저해상도 영상에 사용될 수있다. 다섯째, 이러한 방법은 임의의 유전 적 배경 optogenetic / thermogenetic 신경 조작과 함께 사용될 수있다. 제 (제 1 및 제 2 령충에서) 애벌레의 몸과 아가로 오스 채널 모두 광학적으로 투명하기 때문에 유전자 인코딩 된 형광 프로브에 의해 표시 애벌레 구조의 형광 강도의 동적 움직임, 또는 변화를 연구 할 때 마지막으로, 채널을 사용할 수있다.

기재된 방법은 제 1 및 제 2 령 유충 초파리 동작의 상세한 학적 연구에 적합하다. 이 출판물은 채널의 사용을 설명하기위한 순방향 유생 크롤링 동안 CNS의 형광 강도의 동적 변화를 분석하여 전구체 NEU 할RONAL 칼슘 이미징.

프로토콜

애벌레 1. 준비

1. 일주일 행동을 기록하기 전에, 크로스 (25 처녀 5 남성의 최소)을 설정합니다. 25 ° C에서 모든 십자가와 자손을 유지한다.
   주 : 배양 조건의 온도가 변경 될 수 있지만, 후술하는 타임 라인이 개발 속도의 변화를 고려하여 조절 될 필요가있다.
2. 오일 아침에 제일 먼저 녹음하기 전에, 한천 / 주스 캡과 한천 / 주스 캡의 중심에 효모 페이스트의 소량 (0.5 ml)로 수집 케이지에 십자가를 배치합니다.
   1. 컬렉션 케이지를 확인하려면 6온스에 구멍을 찌를. 광장 폴리에틸렌 초파리 병입니다.
   2. , 한천 / 주스 캡을 원뿔형 플라스크에 600 ml의 물과 한천 18g을 혼합합니다. 200 ml의 사과 주스와 별도의 플라스크 믹스 20g 자당합니다. 고체 때까지 전자 레인지 용해된다. 혼합물을 60 ℃로 냉각 할 수 있도록 결합하고 교반한다. 95 % 에탄올 20 ml의 10 % 메틸 -p- 디 하이드 록시 벤조 에이트를 추가하고 약동하십시오. 추가 ~ 735 X 10mm 라운드 페트리 접시의 바닥 절반 ml의. 한천 / 주스 실온에서 1 시간 동안 응고하도록 허용합니다. 4 ℃에서 보관하십시오.
   3. 효모 페이스트을 볼륨 드라이 이스트와 물에 의해 동일한 부품을 추가합니다. 4 ℃에서 보관하십시오.
3. 애벌레 컬렉션의 상태를 확인합니다.
   1. 아침에, 4 3 일 녹화 전에 캡을 제거하고 케이지에 신선한 캡을 배치합니다. 24 시간 계란의 수집 및 부화 유충을 얻기 위해 매일 같은 시간에 캡을 변경합니다.
   2. 각각의 캡이 제거 된 후, 크로스 누워 얼마나 계란 참조하여 검토한다. 500 ~ 2,000 개의 알을 기대합니다. 필요한 경우, 성인의 수를 조정합니다.
      주 : 몇 알이 유충으로 부화해야하고, 새로 부화 된 유충이 떨어져 효모 페이스트에서 발견됩니다.
   3. 24 시간 동안 각각의 캡을 나이. 애벌레 건강 여부를 결정하기 위해 뚜껑을 다시 검토한다.
      주 : 대부분의 알이 유충으로 부화해야하며, 유충은 너희로 크롤링해야AST 페이스트. 건강이 좋지의 징후는 면역 반응을 나타내는 복부에 상당한 어두운 패치와 깐 계란의 많은 수의, 멀리 효모 붙여 넣기에서 죽은 애벌레의 몸과 애벌레를 포함한다. 애벌레가 건강에 해로운 경우, 케이지를 변경 신선한 모자 / 효모 붙여 넣기를 확인하고 유전자형을 확인합니다.
   4. 기존의 캡을 폐기하십시오.
4. 행동 레코딩을위한 애벌레를 수집합니다.
   1. 녹화 전에 모두 2 일일에서, 캡을 제거하고 신선한 캡으로 교체합니다.
   2. 각각의 제거 캡 레이블을 25 ° C로 유지합니다. 이 행동 레코딩을위한 유충의 단계적 시리즈를 생성합니다. 두 번째 령 (24 ~ 48 시간의 부화)을 통해 (0-4 시간의 부화) 새로 부화에서 애벌레는 채널에서 사용할 수 있습니다. 일 연속에 레코딩을위한 모자를 저장합니다.
   3. 48 시간 후 모두 대문자를 폐기하십시오.
   4. 필요한 경우, 최대 5 추가 일 동안 1.4.1-1.4.3 단계를 반복합니다. 그 적은 후 수정란이 생성된다.

2. 채널의 준비

1. 선형 채널 PDMS (폴리 디메틸 실록산, 실리콘 엘라스토머) 주형 (도 1a)를 준비한다. 금형 주조 PDMS는 요청시 Heckscher 실험실에서 사용할 수 있습니다.
   1. 이소 프로필 알코올로 주조 금형을 청소합니다. 공기 건조, 소량 실험실 와이프 건조 또는 통조림 공기를 사용합니다.
   2. 10cm의 페트리 접시 뚜껑 또는 다른 용기에 주조 금형을 놓습니다.
2. 준비하고 아가로 오스 솔루션을 붓는다.
   1. 완전히 용해 될 때까지은 전자 레인지로 물에 3 % 아가로 오스 용액 (100 ㎖ 3 g)을 확인합니다.
   2. 55 ° C로 냉각, 기포가 표면으로 상승 할 수.
   3. 몰드 막 피복되도록 주형을 함유하는 페트리 접시로 오스 혼합물을 붓는다. 응고 될 때까지 아가로 오스 세트를 보자.
3. 주형에서 아가로 오스 채널을 제거합니다. 면도날 아가 디스크의 가장자리 트림.
   1. 채널을 넣어물에 침지 10cm 페트리 접시에의. 이들은 7 일 동안 4 ℃에서 유지 될 수있다.

기록 동작에 채널에 애벌레로드 (3)

참고 : 4 ° C에서 채널을 저장하는 경우, 채널 행동 기록을 위해 사용하기 전에 실온에 올 수 있습니다.

1. 2 단계 (그림 2A)에서 제조 한 것과 하나의 채널을 잘라 깨끗한 면도날을 사용합니다.
2. 유리 커버 슬립 (그림 2B)에 채널 홈 측 업을 배치 포셉 한 쌍을 사용합니다. 커버 슬립의 크기와 두께가 촬상에 사용 된 특정의 범위에 따라 달라진다.
3. 1 단계에서 제조 된 한천 / 주스 캡에서 유충을 선택하고 절단 된 채널 (그림 2C)에 배치하는 미세 집게를 사용합니다.
   1. 유충을 짜내하지 마십시오. 겸자 타인의 끝으로 가볍게을 선택합니다. 좋은 점과 붓으로 유충을 조작 할 수있다.
      참고 :이 중요하다 애벌레로 매우 센있다터치 sitive. 이들은 취급에주의하지 않으면, 통각 반응 실험의 처음 몇 초 동안 그 동작을 지배하는 것이다.
   2. 간단히 물을 잠수하여 유충을 씻으십시오.
   3. 절단 된 채널에 유충을 배치 한 후, 부드럽게 채널 숲에 유충을 애타게 겸자 타인의 팁을 사용합니다.
      참고 : 대부분의 응용 프로그램 유충의 폭과 채널의 폭이 일치해야합니다. 개발의 다른 단계에서 유충의 평균 폭은 다음과 같습니다 : 0 시간의 부화 - 140 μm의, 24 시간 부화 - 180 μm의, 48 시간의 부화 - 320 μm의, 72 시간의 부화 - 500 μm의 96 시간의 부화 - 750 μm의 ^8. 다음 폭 올 채널 : 100, 150, 200, 250, 300 μm의 모든 채널은 150 ㎛의 깊이이다.
   4. 채널 내의 유충의 위치를 ​​조정하는 셉 타인 또는 붓의 끝 부분을 사용합니다. 그것은 어떤 방향으로 배향 될 수있다 : 복부업, 복부 아래 복부 한쪽은, 어떤 구조에 따라서 묘화한다.
4. 집게를 사용하여 부드럽게 유충 커버 유리 지금되도록 통해 채널 플립. 그것을 물 (도 2D)를 채우도록 채널의 단부에 물을 한두 방울을 놓는다.
   1. 부드럽게 공기 방울을 제거하기 위해 채널의 측면을 들어 올립니다.
   2. 유충의 방향을 조정합니다. 이렇게하려면 부드럽게 채널이 아닌 유충을 롤 커버 유리를 슬쩍 찌르다. 이 방향을 변경하지 않는 경우, 커버 유리를 제거하고 유충의 위치를 ​​조정한다. 유충은 몇 군데 준비가되어 있습니다.
   3. 이미지 채널 / 거꾸로 현미경에 coverslip에. 직립 현미경 촬상 경우 단순히 채널 / 커버 슬립을 반전.

행동 기록에 대한 관심 4. 측정 기능

1. 관심의 구조 (예, 꼬리, CNS)가 관심의 기능을 측정 (예 :시간이 지남에, 형광 강도, 위치).
   참고 사항 : 머리와 꼬리 등의 구조는 수동으로 주석 할 수있다. 예를 들어, 헤드 어두운 H 형 입 고리를 함유하는 것으로 확인 될 수 있고, 꼬리 후방 spiricles 기관을 포함하는 것으로 식별 될 수있다. 이 논문은 신경 코드에 초점을 맞추고있다. 형광 중추 신경계 (CNS)를 레이블하는 UAS-MYR-GFP 유전자 (elav> GFP) ^9,10를 구동하기 위해 신경 GAL4 라인 elav-GAL4를 사용합니다. 중추 신경계는 후방 (그림 3) 확장 신경 코드에 부착이 앞쪽 뇌 로브가 포함되어 있습니다.
2. 각 시점 (t)에서의 신경 코드 (F _(NC))의 화소 강도를 측정한다. 아래 수동 주석 방법을 설명하지만,이 공정은 자동화 될 수있다.
   1. '분석'메뉴에서 피지 (또는 유사한 소프트웨어)에서 평균 회색 값과 SLIC를보고 "세트 측정 ..."대화 상자를 사용하여전자 위치입니다.
   2. 수동 동영상 (도 3)의 첫 번째 프레임에 신경 코드의 중앙에 박스를 그리는. 이 단계는 또한 이미지 분할 및 등록 알고리즘을 자동화 할 수 있습니다.
   3. 관심의 박스 영역의 평균 픽셀 강도를보고 '분석'메뉴에있는 "측정"명령을 사용하십시오. 이것은 "결과"창을 생성합니다.
   4. 다음 프레임에서, 수동 화살표 키를 사용하여 크기를 변경하지 않고 위치를 상자. 다시 "측정"명령을 사용하십시오. 업데이트 된 결과는 "결과"창에 표시됩니다. 관심의 각 프레임에 대해이 단계를 반복합니다.
   5. 파일 메뉴에서 상기 사용 "결과" '다른 이름으로 저장 ...'명령을 저장합니다. 결과는 .xls 파일로 내보낼 수 있습니다.

5. 측정 분석

1. <0과 1 (Z _(t 사이의 값 _{(NC) 값)마다} F 정상화/ EM>).
   1. 스프레드 시트 (또는 다른 프로그램)에서 Results.xls 파일을 엽니 다. 이 파일은 프레임 수와 평균 형광 강도를 나타내는 두 개의 열이있을 것이다.
   2. 새 열을 확인하고 _{([NC]를 F)} 정규화 된 형광 값을 생성하는 식 Z _(t) = F _{(NC [t])라는} 우수한 성능을 나타내었다 _{(F [NC])} / 최대 _{(F [NC])라는} 우수한 성능을 나타내었다를 사용 각 시점에 대응.
2. 기록의 각 걸음의 보폭 기간을 결정합니다.
   참고 : 보폭주기 앞으로에 대한 반복적 인 전신 운동의 단위이다 (그리고 역) 크롤링. 관례 등의 장 또는 CNS ^1과 꼬리, 머리 및 기타 내부 장기의 전진과 함께 앞으로 보폭 시작 (및 종료).
   1. 수동으로 각 스트라이드의 개시 시간 (i)를 기록하는 행동을 조사하고 기록 (I _{(보폭 사이클 [N])).}
      참고 : 아래의 예에서, 전진중추 신경계의 스트라이드 사이클의 시작은 (도 3)으로 사용 하였다.
   2. 각 보폭을 위해 기간 계산 : Δ의 t _{(보폭주기) =} I _{(보폭주기 [N + 1])} -i _{(보폭주기 [N]).}
3. 기록의 각 시점에 대한 경과 스트라이드 사이클의 비율을 계산한다.
   1. 스트라이드 사이클 (c)의 개시부터 경과 시간을 나타내는 스프레드 시트 파일에 추가 열을 만든다. 설정 시간 각 걸음의 시작에서 0으로 보폭 개시 이후 (C _{(보폭주기 [N])} = 0). 이에 따라 개시 후 시간을 조정합니다.
   2. . 경과 %의 보폭 사이클 (% 보폭 사이클) 경과 나타내는 스프레드 시트 파일에 추가 열을 확인 보폭 기간에 의해 조정 된 시간을 나누고 보폭주기의 비율로 변환 100을 곱 % 보폭주기 = (C _{(보폭주기 [N] ))} / (Δ의 t ₍보폭주기) * 100).

6. 극 크롤링주기에 걸쳐 관심의 구조 역학을 대표하는 플롯 좌표 생성

1. MATLAB에서, 업데이트 된 Results.xls을 가져 홈 탭의 '데이터 가져 오기'대화 상자를 사용합니다.
2. 확인 새로운 배열 "시타"를 포함 %의 보폭주기 값 (% 보폭주기). (VAR1는 % 보폭주기를 나타낸다 "세타 = VAR1").
3. 새로운 배열 "의 Rho는"표준화 된 형광 값 (Z _(t))를 포함합니다. (변수 2를 대입 할 때 변수가 Z _(t을 나타냅니다 "의 Rho = 변수 2를 대입 할 때 _변수")).
4. 각도와 퍼센트 보폭주기 및 반경 ( "polarplot (세타,의 Rho)")과 형광 극좌표 플롯을 만들기 위해 'polarplot'명령을 사용하십시오.

결과

이 문서를 이용하여 아가로 오스 채널 초파리 애벌레 동작을 안내하고, 탐색 사이클 동안 유생 구조 역학을 측정하는 방법을 설명한다. 선형 채널에서 애벌레는 리듬 크롤링 (그림 3)의 지속적인 관찰을 수행합니다. 애벌레와 채널 모두 광학적으로 투명하기 때문에, 채널이 유충이 관심있는 임의의 구조로 표현 된 형광 프로브를 발현에 사용될 수있다. 우리는 (elav-GAL4 / +, UAS - MYR - GFP / +) 모든 뉴런에 GFP를 표현 애벌레를 기록 크롤링 사이클에 신경 코드에서 형광 강도의 동적 변화를 모니터링. 우리는 CNS는 애벌레 머리와 꼬리 (그림 4A-B)로 앞으로 거의 같은 시간을 이동하는 것을 보여줍니다. 근육 수축의 물결이 본체 축 방향으로 통과 할 때, CNS가 이동하고 초점 평면으로부터 (도 4) 변화 신경 코드의 형광을하게...

토론

미세 유체 장치는 초파리 유충을 수용 할 수있는 선형 아가로 오스 채널 (그림 1)을 만들기 위해 지어졌다. 초파리 애벌레 이러한 선형 아가로 오스 채널에 배치되면 자신의 행동 레퍼토리는 크롤링 사이클에 애벌레 구조의 역학에 대한 자세한 관찰을 허용하는 크롤링 제한됩니다.

유충 (그림 3) 리듬 발전의 시리즈를 수행 할 때 성공적인 녹화가 발생합니다. 이것이 발생하지 않는다면, 상기 채널에 기포 등의 장애물에 대해 확인하고, 유충의 상태를 확인한다. 성공적인 기록의 또 다른 중요한 요소는 유충 관심 구조를 시각화하기 위해 최적으로 배향되어 있다는 점이다. 유충의 방향이 올바르게되어 있지 않은 경우 유충이 채널에서 크롤링하는 경우 또는, 단순히 커버 슬립을 제거하고 유충을 다시 마운트합니다. 우리의 경험에 의하면, ~ 유충의 20 %는 초기에 수율이 우수한 행동 녹음을 장착 withou...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
6oz 사각 초파리 병	Scimart	DR-103
한천	시그마	A1296
자당	시그마	S9378
사과 주스			농축액
Tegosept	Fisher	T2300	메틸 -p-하이드 록시 벤조 에이
35 × 10mm 원형 페트리 접시	Fisher	351008
베이커 효모
PDMS 주조 금형	FlowJem		은 저자로부터 요청할 수 있습니다
이소 프로필 알코올	Fisher	A417-1
실험실 물티슈	Fisher	06-666-11
통조림	공기 Fisher	18-431
10cm 페트리 접시	BioPioneer	GS82-1473-001
아가로스	Fisher	50-444-176
면도날	Fisher	12-640
집게	FST	11241-40
22 x 40 커버 유리, #1.5	Fisher	50-365-605
피지 (버전 1.51d)	NIH		fiji.sc
Excel 2016	Microsoft		www.microsoftstore.com
MATLAB R2016	Mathworks		www.mathworks.com