방법 논문

선형 아가로 오스 채널을 사용하여 공부하기 초파리 애벌레 크롤링 동작

DOI:

10.3791/54892

⸱

2016년 11월 26일

 , 
1Committee on Development, Regeneration, and Stem Cell Biology, University of Chicago, 2Department of Molecular Genetics and Cell Biology, University of Chicago

이 논문에서

요약

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초파리 유충 행동의 신경 제어를 연구하는 강력한 모델 시스템입니다. 이 책은 반복 크롤링 동작 중에 애벌레 구조의 역 동성을 정량화하는 선형 크롤링 및 방법의 지속적인 관찰을 유도하는 선형 아가로 오스 채널의 사용을 설명합니다.

초록

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초파리 애벌레 크롤링는 감각 운동 행동의 신경 제어를 연구하는 강력한 모델로 부상하고있다. , 일시 중지 전환 및 사행 : 그러나, 평면 오픈 표면에 애벌레 크롤링 동작을 포함하여 복잡하다. 운동의 레퍼토리에서 이러한 복잡성은 단일 크롤링 보폭주기 동안 발생하는 이벤트의 상세한 분석을 방해한다. 이 장애물을 극복하기 위해, 선형 아가로 오스 채널은 직선, 유지, 리듬 크롤링에 애벌레 행동에 제약을가 하였다. 아가 채널 초파리 애벌레 본체 모두 광학적으로 투명하기 때문에 원리 적으로, 유전자 코드에 의해 표지 된 형광 프로브 유생 구조의 움직임을 그대로 자유롭게 움직이는 유충으로 모니터링 할 수있다. 과거에는, 유충은 선형 채널에 배치하고, 전체 유기체 세그먼트 레벨 크롤링 근육 1을 분석 하였다. 앞으로 채널에서 크롤 유충 신경을 모니터링 칼슘 이미징에 사용될 수최종 활동. 더욱이, 이러한 방법은 어떤 유전자형의 유충 및 연구원 설계된 채널로 사용될 수있다. 따라서 아래 제시된 프로토콜은 모터 제어를 이해하는 모델로서 초파리 유충을 사용하여 연구에 널리 적용 할 수있다.

서론

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이 방법의 전반적인 목표는 세부에서 초파리 애벌레 크롤링을 연구하는 것입니다. 운동 실험 개발 및 모터 제어 이론 2 테스트에서 중요한 역할을 해왔다. 전통적으로 운동은 수생 동물 (예를 들어, 거머리, 칠성 장어, 올챙이) 3에서 연구되어왔다. 이러한 동물의 운동의 반복적 인 특성은 운동 구동 생물 물리학 이벤트 분석 및 운동에 수반 신경 소성 패턴 모니터링, rhythmogenesis 연구 허용했다.

용이 한 유전 특성이 잘 개발, 제 1 및 제 2 령기에서 광학적으로 투명 인 몸 전체의 진행을 투과형 전자 현미경 재구성 : 운동의 연구 초파리 유충의 사용은 다른 모델 시스템에 비해 이점의 독특한 조합을 제공한다 신경계 4-6. 그러나, 초파리 애벌레로 코평면 오픈 표면에 운동은, 일시 정지를 포함하는 다소 복잡한 회전 및 사행 7을 크롤링합니다. 이 공보는 유충이 직선 리듬 크롤링 동작을 유지하도록 실시합니다 초파리 유충의 전위의 동작을 안내하는 리니어 아가 채널을 사용하는 방법을 제시한다.

대신 평면 오픈 표면에 행동, 아가....

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프로토콜

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애벌레 1. 준비

  1. 일주일 행동을 기록하기 전에, 크로스 (25 처녀 5 남성의 최소)을 설정합니다. 25 ° C에서 모든 십자가와 자손을 유지한다.
    주 : 배양 조건의 온도가 변경 될 수 있지만, 후술하는 타임 라인이 개발 속도의 변화를 고려하여 조절 될 필요가있다.
  2. 오일 아침에 제일 먼저 녹음하기 전에, 한천 / 주스 캡과 한천 / 주스 캡의 중심에 효모 페이스트의 소량 (0.5 ml)로 수집 케이지에 십자가를 배치합니다.
    1. 컬렉션 케이지를 확인하려면 6온스에 구멍을 찌를. 광장 폴리에틸렌 초파리 병입니다.
    2. , 한천 / 주스 캡을 원뿔형 플라스크에 600 ml의 물과 한천 18g을 혼합합니다. 200 ml의 사과 주스와 별도의 플라스크 믹스 20g 자당합니다. 고체 때까지 전자 레인지 용해된다. 혼합물을 60 ℃로 냉각 할 수 있도록 결합하고 교반한다. 95 % 에탄올 20 ml의 10 % 메틸 -p- 디 하이드 록시 벤조 에이트를 추가하고 약동하십시오. 추가 ~ 735 X 10mm 라운드 페트리 접시의 바닥 절반 ml의. 한천 / 주스 실온에서 1 시간 동안 응고하도록 허용합니다. 4 ℃에서 보관하십시오.
    3. 효모 페이스트을 볼륨 드라이 이스트와 물에 의해 동일한 부품을 추가....

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결과

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이 문서를 이용하여 아가로 오스 채널 초파리 애벌레 동작을 안내하고, 탐색 사이클 동안 유생 구조 역학을 측정하는 방법을 설명한다. 선형 채널에서 애벌레는 리듬 크롤링 (그림 3)의 지속적인 관찰을 수행합니다. 애벌레와 채널 모두 광학적으로 투명하기 때문에, 채널이 유충이 관심있는 임의의 구조로 표현 된 형광 프로브를 발현에 사용될 수있다. 우리는 (elav-GAL4 / +, UAS - MYR - GFP / +) 모든 뉴런에 GFP를 표현 애벌레를 기록 크롤링 사이클에 신경 코드에서 형광 강도의 동적 변화를 모니터링. 우리는 CNS는 애벌레 머리와 꼬리 (그림 4A-B)로 앞으로 거의 같은 시간을 이동하는 것을 보여줍니다. 근육 수축의 물결이 본체 축 방향으로 통과 할 때, CNS가 이동하고 초점 평면으로부터 (도 4) 변화 신경 코드의 형광을하게.......

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토론

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미세 유체 장치는 초파리 유충을 수용 할 수있는 선형 아가로 오스 채널 (그림 1)을 만들기 위해 지어졌다. 초파리 애벌레 이러한 선형 아가로 오스 채널에 배치되면 자신의 행동 레퍼토리는 크롤링 사이클에 애벌레 구조의 역학에 대한 자세한 관찰을 허용하는 크롤링 제한됩니다.

유충 (그림 3) 리듬 발전의 시리즈를 수행 할 때 성공적인 녹화가 발생합니다. 이것이 발생하지 않는다면, 상기 채널에 기포 등의 장애물에 대해 확인하고, 유충의 상태를 확인한다. 성공적인 기록의 또 다른 중요한 요소는 유충 관심 구조를 시각화하기 위해 최적으로 배향되어 있다는 점이다. 유충의 방향이 올바르게되어 있지 않은 경우 유충이 채널에서 크롤링하는 경우 또는, 단순히 커버 슬립을 제거하고 유충을 다시 마운트합니다. 우리의 경험에 의하면, ~ 유충의 20 %는 초기에 수율이 우수한 행동 녹음을 장착 withou.......

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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원고에 대한 의견과 기술적 도움을 주신 Chris Wreden과 Michelle Bland에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
6oz 사각 초파리 병ScimartDR-103
한천시그마A1296
자당시그마S9378
사과 주스농축액
TegoseptFisherT2300메틸 -p-하이드 록시 벤조 에이
35 × 10mm 원형 페트리 접시Fisher351008
베이커 효모
PDMS 주조 금형FlowJem은 저자로부터 요청할 수 있습니다
이소 프로필 알코올FisherA417-1
실험실 물티슈Fisher06-666-11
통조림공기 Fisher18-431
10cm 페트리 접시BioPioneerGS82-1473-001
아가로스Fisher50-444-176
면도날Fisher12-640
집게FST11241-40
22 x 40 커버 유리, #1.5Fisher50-365-605
피지 (버전 1.51d)NIHfiji.sc
Excel 2016Microsoftwww.microsoftstore.com
MATLAB R2016Mathworkswww.mathworks.com
트

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature. J Neurosci. 32 (36), 12460-12471 (2012).
  2. Marder, E., Calabrese, R. L. Principles of rhythmic....

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