방법 논문

포스터 공명 에너지 전달 (FRET) -force의 바이오 센서를 사용하는 프로토콜은 핵 LINC 단지에서 기계의 힘을 측정하는

DOI:

10.3791/54902

⸱

2017년 4월 11일

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Virginia Commonwealth University

이 논문에서

요약

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최근 많은 FRET 기반 힘 바이오센서가 개발되어 세포 내 힘의 단백질 특이적 분해능을 가능하게 합니다. 이 프로토콜에서는 LINC(nucleoskeleton-cytoskeleton) 복합 단백질 Nesprin-2G의 링커용으로 설계된 이러한 센서 중 하나를 사용하여 핵 LINC 복합체에 대한 액토마이신 힘을 측정하는 방법을 보여줍니다.

초록

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LINC 복합체는 세포골격에서 핵으로 기계적 힘의 전달을 중재하는 중요한 구조라는 가설이 세워져 있습니다. Nesprin-2G는 액틴 세포골격을 핵주위 공간의 막 단백질(SUN 도메인 단백질)에 연결하는 LINC 복합체의 핵심 구성 요소입니다. 이러한 막 단백질은 핵 내부의 라민(lamin)에 연결됩니다. 최근에는 Förster Resonance Energy Transfer(FRET) 힘 프로브를 mini-Nesprin-2G(Nesprin-TS(장력 센서))에 복제하여 살아있는 NIH3T3 섬유아세포에서 Nesprin-2G의 장력을 측정하는 데 사용했습니다. 이 논문은 Nesprin-TS를 사용하여 NIH3T3 섬유아세포에서 LINC 복합력을 측정하는 과정을 설명합니다. Nesprin-TS에서 FRET 정보를 추출하기 위해 원시 스펙트럼 이미지를 수용체 및 공여 형광 채널로 스펙트럼 혼합하는 방법에 대한 개요도 제시됩니다. 오픈 소스 소프트웨어(ImageJ)를 사용하여 이미지를 사전 처리하여 비율계량 이미지로 변환합니다. 마지막으로 Nesprin-TS의 FRET 데이터와 여러 실험 그룹 간의 데이터를 비교하는 방법에 대한 전략이 제시됩니다.

서론

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포스 성 유전자 부호화 FRET 센서 최근 생균 인장 계의 힘을 측정하는 단백질 1, 2, 3, 4에인가되는 방법을 기계적 힘에 대한 통찰력을 제공하기위한 중요한 도구로 떠오르고있다. 이러한 도구를 사용하여, 연구자들은 기존의 형광 현미경을 이용하여 살아있는 세포에서 비 침습적 영상 세포 내 힘 수 있습니다. 이러한 센서는 탄성 펩티드 (3)에 의해 분리 된 FRET 쌍 (도너와 억 셉터 형광 단백질, 자주 청색 공여체 및 수용체 노란색)로 구성된다. C- 또는 N- 말단 태그 대조적으로,이 센서는 분자 스트레인 게이지로서 행동하고,이 단백질에 걸쳐 전송되는 기계적인 힘을 측정 할 수있는 단백질의 내부 부위에 삽입된다. 프렛-P 사이의 증가 된 거리에서 센서 결과 걸쳐 기계적 장력을 증대공기 감소 FRET 3의 결과. 그 결과, FRET 반비례 인장력에 관한 것이다.

이러한 형광 기반 센서는 초점 접착 단백질 (vinculin 3 talin 4), 세포 골격 단백질 (α-티닌 5), 및 세포 - 세포 접합 단백질을 위해 개발 된 (E-cadherin의 6, 7, VE-cadherin의 8 및 PECAM 8). 이러한 바이오 센서에서 가장 자주 사용되는 잘 특징으로하는 탄성 링커 TSmod라고도하고 거미줄 단백질 flagelliform로부터 유도 된 40 개 아미노산 (GPGGA) (8)의 반복되는 시퀀스로 구성된다. TSmod은 인장력 3/5 PN 1 FRET에 응답하여 선형 탄성 나노 스프링처럼 행동하는 것으로 나타났다. flagelliform의 다른 길이는 동적 R을 변경하는 데 사용할 수 있습니다TSmod FRET 힘 감도 (9)의 플랜지. flagelliform 외에도 스펙 트린은 (HP35라고도 함) (5)와 villin 투구 펩티드 4는 유사한 포스 바이오 센서 (4) 사이의 FRET 쌍 탄성 펩티드로서 사용되어왔다를 반복한다. 마지막으로, 최근의 보고서는 TSmod는 압축력 (10)를 감지하는 데 사용할 수 있다는 것을 보여 주었다.

최근 TSmod 내생 비슷하게 동작 미니 Nesprin2G (도 2C)로 알려진 이전에 개발 된 절두 Nesprin2G 단백질 삽입 이용하여 nucleo - 골격 (LINC) 복합 단백질 Nesprin2G의 링커 힘 센서를 개발 Nesprin-2G (11). LINC 복합체는 핵에 얇은 골격을 연결하는 세포질, 핵의 외부에서 내부로 이끌어 다중 단백질을 포함한다. Nesprin-2G는 구조적 단백질에 결합되는 두세포질과 핵 주변 공간에 태양 단백질 액틴 세포 골격. 우리의 바이오 센서를 사용하여, 우리는 Nesprin-2G는 NIH3T3 섬유 아세포 2 액토 마이 오신에 의존 긴장 될 수 있음을 보여줄 수 있었다. 이것은 그 힘이 바로 핵 LINC 단지에 단백질을 통해 측정 한 처음, 그리고 제어 공학의 핵에 힘의 역할을 이해하는 중요한 도구가 될 가능성이 높습니다.

프로토콜은 아래 Nesprin-을 발현하는 세포의 FRET 화상의 포유 동물 세포에서 Nesprin 장력 센서 (Nesprin-TS)의 발현뿐만 아니라, 수집 및 분석을 포함하여 Nesprin-2G 힘 센서를 사용하는 방법의 상세한 방법을 제공한다 TS. 분광 검출기를 구비 한 반전 된 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용하여, 발광 증감을 측정하는 방법을 설명 unmixing 스펙트럼을 이용하여 비율 적 FRET FRET 및 촬상이 제공된다. 출력 이미지가 상대적 비율 적 ...로서 확인하는데 사용될 수있다ntitative 힘 비교. 이 프로토콜은 섬유 아세포 Nesprin-TS의 발현에 집중되는 반면, 세포주 및 일차 전지 모두 포함한 다른 포유 동물 세포에 쉽게 적응할 수있다. 또한, 이미지 수집 및 FRET 분석에 관련된 프로토콜이 용이 다른 단백질에 대해 개발 된 다른 FRET 기반 포스 바이오 센서에 적용될 수있다.

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프로토콜

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1. Nesprin-2G 센서 DNA 및 다른 플라스미드 DNA를 구합니다

  1. 상업적인 소스로부터 Nesprin 2G-TS (인장 센서) Nesprin HL-2G (헤드리스) 제어 mTFP1 금성 및 TSmod를 구합니다. 모든 DNA 플라스미드를 전파 이전 12,13 바와 같이, 이러한 DH5-α 표준 E. 콜라이 균주를 사용하여 정제.

Nesprin-2G 및 기타 플라스미드 DNA 2. 형질 세포

  1. 온도 (37 ° C) 및 CO 2 5 %로 규제 표준 세포 배양 인큐베이터에서 6- 웰 세포 배양 접시에 70-90 %의 합류점에 NIH 3T3 섬유 아세포의 세포 성장. 세포 성장 매체의 경우, 10 % 소 태아 혈청 둘 베코의 변형 이글 중간 (DMEM)을 사용합니다.
  2. 세포 배양 후드에서, 배지를 제거하고 감소 된 혈청 배지 세포의 약 1 mL로 각 웰을 씻어. 각 웰에 감소 혈청 세포 매체의 800 μL를 추가상기 인큐베이터에서 6- 웰 챔버를 배치했다.
  3. 지질 담체 용액 35 μL와 함께 1.5 ㎖의 튜브에 감소 된 혈청 세포 배지 700 μL 피펫은 "lipomix"를 형성한다. 피펫으로 섞는다. 에 "L."로 튜브 라벨
  4. 여섯 개 1.5 ㎖의 튜브를 수집하고, 각 관으로 감소 된 혈청 세포 배지 6 μL 피펫 (100)을 통해 1 라벨.
    1. mVenus 항 피펫 1 μg의 튜브에 튜브 (3) 및 제 피펫 1 mTFP의 μg의로 튜브 1 및 2 피펫 2 Nesprin-HL의 μg의 한 단계 1 피펫 2 Nesprin 2G-TS의 μg의으로부터 플라스미드 DNA의 농도를 사용하여 튜브 (6)에 다시 사용하지 마십시오 피펫 팁을 DNA의 다른 유형을 피펫 팅 할 때.
  5. 각 분류 관 (1-6)에 "L"튜브로부터 lipomix 100 μL 피펫 및 피펫 팅을 반복하여 혼합한다. 각 튜브에 대한 깨끗한 피펫을 사용합니다. 10 ~ 20 분 동안 품어.
  6. 70-90 % 합류로 6 웰 챔버의 웰에 각각 분류 관에서 200 μL를 추가세포. 해당 DNA와 각 웰의 상부에 라벨했다. 4-6 시간 동안 인큐베이터에서 6- 웰 챔버를 놓는다.
  7. 배지를 흡인하고 린스 감소 된 혈청 배지 셀 1-2 mL를 첨가. 상기 감소 된 - 혈청 배지를 세포 기음 각 웰에 트립신 2 mL를 첨가하고, 인큐베이터 (5-15 분)로 6 웰 접시를 배치했다.
  8. 세포 배양기에서 분리되지만, 피막 (6) 유리 바닥은 인산 완충 용액 (PBS)에 용해 된 20 ㎍ / ml의 농도에서 피브로넥틴의 층으로 요리를보고. 코팅하는 요리를 세포 배양 후드 (약 20 분)의 표면을 허용한다.
  9. 세포가 분리되면 DMEM 2 용액을 첨가함으로써 트립신을 중성화.
  10. 또한 표지 된 15 mL의 원심 분리 튜브에 각각의 콘텐츠를 전송하고 스윙 로터 원심 분리기에서 5 분 동안 90 XG에서 스핀 다운. 상등액을 흡인 피펫 혼합하여 DMEM 1000 μL의 각 세포 펠렛을 다시 일시.
  11. 로부터 피브로넥틴 혼합물 기음유리 접시 피펫 유리 접시 상에 각 세포 현탁액을 1000 μL.
  12. 세포가 유리 접시의 바닥 (~ 15 분)에 정착 한 후, 세포 배양기에서 잘 장소 각각 다른 DMEM 1 ㎖의 + 10 % FBS + 1 % 스트렙토 펜을 추가한다. 세포가 적어도 18 ~ 24 시간 동안 센서를 부착하고 표현 할 수 있습니다.
    참고 : 세포 상업 양이온 성 지질 형질 전환 시약 (재료의 표 참조)을 사용하여 형질 전환된다. 대안 적으로, 안정한 세포주는 독소에 대한 내성을 부여하는 유전자를 가진 플라스미드를 사용하여 선택 될 수있다 (Nesprin-TS와 -hl 대한 pcDNA 벡터 플라스미드 네티 신 내성을 발현하는 세포 (물질의 표를 참조)를 제공하는 DNA 저장소 사이트에서 사용할 ). 또한 바이러스 감염 방법 (렌티 바이러스, 레트로 바이러스 또는 아데노 바이러스)를 형질 어렵다 셀 센서를 표현하는데 이용 될 수있다.
  13. Nesprin-TS 외에도 Nesprin HL 제로위한 부가적인 세포를 형질CE 제어 2.1-2.12 단계에서 설명한 바와 같이, TSmod 또한 제로 - 힘 제어로 사용될 수 Nesprin HL-유사한 FRET을 발휘한다.
  14. mTFP1 금성로 형질 세포 스펙트럼 지문 (단계 4 참조)를 생성한다.
    참고 mTFP1 금성은 일반적 Nesprin-TS보다 높은 수준의 발현과 같은 DNA의 하부 양 유사한 발현 수준을 달성하기 위해 형질 전환 될 필요가있다.

3. 형질 전환 효율을 확인

  1. 대략 18-24 시간 형질을 마친 후,도 셀 (통상 5-30 %)의 총 수에 형광 세포의 수를 비교하여 형질 전환의 효율을 조사하기 반전 형광 현미경을 사용한다.
    1. 462 나노 미터 (mTFP1) 또는 525 나노 미터 (금성) 및 492 nm의 (mTFP1) 또는 525 나노 미터 (금성) 근처에 중심 발광 필터 근처의 여기 주파수가 장착 된 형광 현미경을 사용한다.
      참고 : 또는 GFP 필터 세트 mTFP1의 조합을 캡처했습니다 것NUS 배출량은 형질 전환 효율의 확인을 허용합니다.
  2. 형질 전환 후 48 시간 내에 이미지 살아있는 세포.
    1. 대안 적으로, 48 시간 후 8 PBS에서 5 분간, 상점, 볼 (칼슘 및 마그네슘과 PBS)에서 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 고정한다.
      참고 : 48 시간을 넘어, 신호 품질 및 강도는 붕괴. 세포를 고정하기 (8)로 표현되는 FRET 포함한 상태를 유지; 매체를 장착하여 FRET (14)에 영향을 미칠 수있다 그러나, 셀은, PBS에 이미징되어야한다. 표정의 변화가있을 수에 따라 고정 셀은 다른 셀에 고정 비교 될 수있다.
      주의 : 파라 포름 알데히드는 독성이있다. 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용 할 것.

스펙트럼 Unmixing에 대한 mTFP1과 금성 형광 발색단 4. 캡처 스펙트럼 지문

  1. 세포 배양 후드에서 촬상 mediu와 세포 배지를 교체10 % 소 태아 혈청 m (HEPES 완충).
  2. 온도 제어 (37 ° C) 공 초점 레이저 주사 현미경 단계에서 보는 요리를 놓는다.
  3. 1.4 개구 수 60X 배율 오일 대물 위에 mTFP1 형질 세포 유리 뷰잉 접시 놓는다.
    주 : 오일 밀접 유리 기판의 굴절률이 유사 할 60X 대물 렌즈에 레이저 스캐닝 현미경에 사용된다. 오일은 대물 렌즈의 상단에 배치하고 유리 커버 슬립과 직접 접촉한다.
  4. mTFP1는 458 nm의 여기 원 및 500 nm의 발광 중심 대역 통과 필터로 발현 세포를 찾아.
  5. 시야에서 형광 셀 (여기에서 사용되는 소프트웨어 "람다 모드") 스펙트럼 검출 모드를 선택하고, 분광 화상 (도 3-1)을 캡처; 10 개 나노 미터 단위 (도 3-3)을 이용하여 458 nm의 이후의 모든 주파수를 포함한다. 밝은 fluoresc를 선택셀 (20 화소 반경)에 ENT 영역 (ROI).
    참고 : mTFP1 발현 투자 수익 (ROI)의 스펙트럼 형태는 셀에 걸쳐 상대적으로 일정하게 유지해야한다. 형상이 현저하게 변화되면, 레이저를 재조정하고, 신호 대 잡음비를 개선하기 위해 설정을 얻는다.
  6. 클릭하여 스펙트럼 데이터베이스에, 형광 ROI 의미 정규화 강도를 추가 "데이터베이스에 스펙트럼을 저장합니다."
  7. 레이저 파워를 최적화하고 양호한 신호 대 잡음비가 성취되도록 얻는다. 설정은 다른 장비에 따라 다를 것입니다. 배경 기준으로 비 - 형광, 형질 감염되지 않은 세포를 사용하여, 그러나, 검출기 (포화)의 동적 범위를 넘어, 세포가 밝은 때까지 상기 이득과 전력을 증가시킨다. 배경 세포는 평균 후 감지 형광 없어야합니다.
  8. 다음을 제외 금성 - 형질 전환 된 세포의 과정을 반복합니다 :
    1. 여기 주파수가 515 nm에서인지 확인하고, 밴드 패스 필터는 CE라고금성 발현 세포를 찾을 때 530 나노 미터 근처 ntered.
    2. 의 "스펙트럼 모드"내지 515 대신 458 nm 인 여기 주파수를 사용한다.

5. 캡처 혼합하지 않은 이미지

  1. 에 캡처 모드 전환 "스펙트럼 Unmixing을."
  2. unmixing 채널로 (도 3, 화살표 2) 금성 mTFP1의 스펙트럼 지문을 추가한다.
  3. 다시 458 nm의 아르곤 소스 여진 레이저를 설정한다.
  4. 60X 오일 대물 위 Nesprin-TS 볼 접시 놓는다.
  5. 충분히 밝은 식 형광 세포에 집중하면, 신호 대 잡음비를 최적화하는 게인 및 레이저 파워를 조정한다.
    참고 Nesprin-TS의 FRET 효율은 20 % 가까이 있기 때문에, 혼합되지 않은 금성 화상이 섞이지 mTFP1 이미지보다 실질적으로 더 어둡게 될 것이다. 허용 전력 및 이득 설정이 반복적으로 결정되면, 이들 매개 변수는 모두 이미지 대위에 대한 일정하게 유지해야ured.
  6. (모든 포화 화소 화상 처리 동안 제거되는) 비교적 유사한 밝기 Nesprin-TS 셀 15-20 이미지 캡처 최소 화소 과도한 포화를 방지.
  7. 동일한 촬상 파라미터를 사용하여 HL-Nesprin 세포 촬상 처리를 반복한다.

6. 이미지 프로세싱 및 비율 이미지 분석

  1. 사용하여 오픈 소스 ImageJ에 (피지) 소프트웨어 (http://fiji.sc/), BioFormats Reader를 사용하여 열려있는 기본 형식 이미지.
  2. 전 과정을 이미지와는 이전에 설정된 프로토콜 15을 사용하는 비율 이미지를 계산한다.

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결과

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전술 한 프로토콜에 따라, 플라스미드 DNA는 DNA 저장소로부터 취득하고, 대장균에 형질 전환. 센서 DNA를 발현하는 대장균을 LB / 암피실린 플레이트로부터 선택 LB 액체 배지에서 증폭 하였다. 벡터의 증폭에 이어, 플라스미드 DNA는 표준 시판 DNA 분리 키트를 이용 TRIS-EDTA 버퍼로 정제 하였다. 분광 광도계를 사용하여, 정제 된 DNA는 ㎍ / ㎖ (도 1a, 1-2 일), 표준의 농도로 정량 하였다.

NIH3T3 섬유 아세포를 사용하여, 세포를 6- 웰 세포 배양 플라스틱 접시에 70-90 %의 합류로 성장시켰다. NIH3T3 세포로의 플라스미드 DNA를 삽입하기 위해, 지질 - 매개 형질 감염, 플라스미드 수행 하였다. 시판되는 형질 감염 시약 (물질의 표를<...

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토론

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방법 및 Nesprin-2G 핵 LINC 복잡 단백질 걸쳐 기계적 장력 생균 촬상 시연은 위에서 언급되었다. 이전이 연구에, 이러한 마이크로 피펫 흡인 세포 계측법, 자성 비드, 현미경 레이저 절제와 같은 다양한 기술들은, 세포핵에 변형을 적용하고, 벌크 물성 16, 17, 18을 측정하기 위해 사용되었다. 그러나, 최근의 작품까지, 어떤 연구는 직접 인장 힘은 살아있는 세포 2에 LINC 복잡한 단백질에 직접 전달되는 것을 보여 없었다.

이전에, 우리 실험실 미니 Nesprin2G라고도 Nesprin2G, 수정 된 버전 TSmod (도 2c) 2로 알려진 FRET 력 프로...

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 작품은 (DEC에) R35GM119617을 부여 토마스 F.와 케이트 밀러 제프리스 Memoria (DEC에) 신뢰와 NIH에 의해 지원되었다. 공 초점 현미경 영상은 VCU 나노 물질 특성 코어 (NCC) 시설에서 수행되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Nesprin-TS DNAAddgene68127https://www.addgene.org/68127/
Nesprin-HL DNAAddgene68128검색 https://www.addgene.org/68128/
mTFP1 DNAAddgene54613에서 검색 https://www.addgene.org/54613/
mVenus DNAAddgene27793에서 검색 https://www.addgene.org/27793/
TSmod DNAAddgene26021https://www.addgene.org/26021/
Competent CellsBiolineBIO-85026
액체 LB 매체ThermoFisher10855001
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001 고체 LB 세균 배양 플레이트Sigma-AldrichL5667
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en®ion=US AmpicillinSigmaA9518
분광 광도계Biorad273 BR 07335SmartSpec Plus
석영 큐벳Biorad1702504SmartSpec Plus용 큐벳
DNA 분리 키트Macherey-Nagel740412.5NucleoBond Xtra Midi Plus
6-웰 세포 배양 접시Falcon-Corning353046Multiwell 6-웰 폴리스렌 배양 접시
Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) 세포 배지Gibco11995-065DMEM(1x)
소 혈청Life Technologies16170-078
환원 혈청 세포 배지Gibco31985-070환원 혈청 배지, "optimem"
지질 캐리어 솔루션invitrogen11668-019지질 시약, "Lipofectamine 2000"
1.5 mL 멸균 플라스틱 튜브Denvillec2170
TrypsinGibco25200-0560.25% Trypsin-EDTA (1x)
유리 바닥 현미경 관찰 접시In Vitro ScientificD35-20-1.5-N35 mm 접시 20 mm 바닥 웰 #1.5 유리
FibronectinThermoFisher33016015피브로넥틴 인간 단백질, 플라즈마
인산염 완충 식염수 (PBS)Gibco14190-144Dulbecco의 인산염 완충형 식염수
15 mL 멸균 원심분리기 튜브Greiner bio-one188261
스윙 로터 원심분리기 Thermo electronCentra CL2스윙 로터 thermo electron 236
세포 배양 생물 안전성 후드Forma Scientific1284
기후 제어 세포 배양 인큐베이터ThermoFisher3596
도립 LED 광시야 형광 현미경Life TechnologiesEVOS FL
Clear HEPES 버퍼 이미징 매체분자 프로브
Fetal bovine SerumLife technologies10437-028
온도 제어-역 컨포칼 w/458 및 515 nm 레이저 소스 자이스  LSM 710-w/스펙트럼 META 검출기
Outgrowth MediaNewengland BiolabsB9020s
NIH 3T3 섬유아세포ATCCCRL-1658
에서 에서 검색 A14291DJ

참고문헌

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