최근 많은 FRET 기반 힘 바이오센서가 개발되어 세포 내 힘의 단백질 특이적 분해능을 가능하게 합니다. 이 프로토콜에서는 LINC(nucleoskeleton-cytoskeleton) 복합 단백질 Nesprin-2G의 링커용으로 설계된 이러한 센서 중 하나를 사용하여 핵 LINC 복합체에 대한 액토마이신 힘을 측정하는 방법을 보여줍니다.
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방법 논문
포스터 공명 에너지 전달 (FRET) -force의 바이오 센서를 사용하는 프로토콜은 핵 LINC 단지에서 기계의 힘을 측정하는
이 논문에서
요약
초록
LINC 복합체는 세포골격에서 핵으로 기계적 힘의 전달을 중재하는 중요한 구조라는 가설이 세워져 있습니다. Nesprin-2G는 액틴 세포골격을 핵주위 공간의 막 단백질(SUN 도메인 단백질)에 연결하는 LINC 복합체의 핵심 구성 요소입니다. 이러한 막 단백질은 핵 내부의 라민(lamin)에 연결됩니다. 최근에는 Förster Resonance Energy Transfer(FRET) 힘 프로브를 mini-Nesprin-2G(Nesprin-TS(장력 센서))에 복제하여 살아있는 NIH3T3 섬유아세포에서 Nesprin-2G의 장력을 측정하는 데 사용했습니다. 이 논문은 Nesprin-TS를 사용하여 NIH3T3 섬유아세포에서 LINC 복합력을 측정하는 과정을 설명합니다. Nesprin-TS에서 FRET 정보를 추출하기 위해 원시 스펙트럼 이미지를 수용체 및 공여 형광 채널로 스펙트럼 혼합하는 방법에 대한 개요도 제시됩니다. 오픈 소스 소프트웨어(ImageJ)를 사용하여 이미지를 사전 처리하여 비율계량 이미지로 변환합니다. 마지막으로 Nesprin-TS의 FRET 데이터와 여러 실험 그룹 간의 데이터를 비교하는 방법에 대한 전략이 제시됩니다.
서론
포스 성 유전자 부호화 FRET 센서 최근 생균 인장 계의 힘을 측정하는 단백질 1, 2, 3, 4에인가되는 방법을 기계적 힘에 대한 통찰력을 제공하기위한 중요한 도구로 떠오르고있다. 이러한 도구를 사용하여, 연구자들은 기존의 형광 현미경을 이용하여 살아있는 세포에서 비 침습적 영상 세포 내 힘 수 있습니다. 이러한 센서는 탄성 펩티드 (3)에 의해 분리 된 FRET 쌍 (도너와 억 셉터 형광 단백질, 자주 청색 공여체 및 수용체 노란색)로 구성된다. C- 또는 N- 말단 태그 대조적으로,이 센서는 분자 스트레인 게이지로서 행동하고,이 단백질에 걸쳐 전송되는 기계적인 힘을 측정 할 수있는 단백질의 내부 부위에 삽입된다. 프렛-P 사이의 증가 된 거리에서 센서 결과 걸쳐 기계적 장력을 증대공기 감소 FRET 3의 결과. 그 결과, FRET 반비례 인장력에 관한 것이다.
이러한 형광 기반 센서는 초점 접착 단백질 (vinculin ....
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프로토콜
1. Nesprin-2G 센서 DNA 및 다른 플라스미드 DNA를 구합니다
- 상업적인 소스로부터 Nesprin 2G-TS (인장 센서) Nesprin HL-2G (헤드리스) 제어 mTFP1 금성 및 TSmod를 구합니다. 모든 DNA 플라스미드를 전파 이전 12,13 바와 같이, 이러한 DH5-α 표준 E. 콜라이 균주를 사용하여 정제.
Nesprin-2G 및 기타 플라스미드 DNA 2. 형질 세포
- 온도 (37 ° C) 및 CO 2 5 %로 규제 표준 세포 배양 인큐베이터에서 6- 웰 세포 배양 접시에 70-90 %의 합류점에 NIH 3T3 섬유 아세포의 세포 성장. 세포 성장 매체의 경우, 10 % 소 태아 혈청 둘 베코의 변형 이글 중간 (DMEM)을 사용합니다.
- 세포 배양 후드에서, 배지를 제거하고 감소 된 혈청 배지 세포의 약 1 mL로 각 웰을 씻어. 각 웰에 감소 혈청 세포 매체의 800 μL를 추가상기 인큐베이터에서 6- 웰 챔버를 배치했다.
- 지질 담체 용액 35 μL와 함께 1.5 ㎖의 튜브에 감소 된 ....
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결과
전술 한 프로토콜에 따라, 플라스미드 DNA는 DNA 저장소로부터 취득하고, 대장균에 형질 전환. 센서 DNA를 발현하는 대장균을 LB / 암피실린 플레이트로부터 선택 LB 액체 배지에서 증폭 하였다. 벡터의 증폭에 이어, 플라스미드 DNA는 표준 시판 DNA 분리 키트를 이용 TRIS-EDTA 버퍼로 정제 하였다. 분광 광도계를 사용하여, 정제 된 DNA는 ㎍ / ㎖ (도 1a, 1-2 일), 표준의 농도로 정량 하였다.
NIH3T3 섬유 아세포를 사용하여, 세포를 6- 웰 세포 배양 플라스틱 접시에 70-90 %의 합류로 성장시켰다. NIH3T3 세포로의 플라스미드 DNA를 삽입하기 위해, 지질 - 매개 형질 감염, 플라스미드 수행 하였다. 시판되는 형질 감염 시약 (물질의 표를<.......
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토론
방법 및 Nesprin-2G 핵 LINC 복잡 단백질 걸쳐 기계적 장력 생균 촬상 시연은 위에서 언급되었다. 이전이 연구에, 이러한 마이크로 피펫 흡인 세포 계측법, 자성 비드, 현미경 레이저 절제와 같은 다양한 기술들은, 세포핵에 변형을 적용하고, 벌크 물성 16, 17, 18을 측정하기 위해 사용되었다. 그러나, 최근의 작품까지, 어떤 연구는 직접 인장 힘은 살아있는 세포 2에 LINC 복잡한 단백질에 직접 전달되는 것을 보여 없었다.
이전에, 우리 실험실 미니 Nesprin2G라고도 Nesprin2G, 수정 된 버전 TSmod (도 2c) 2로 알려진 FRET 력 프로.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 (DEC에) R35GM119617을 부여 토마스 F.와 케이트 밀러 제프리스 Memoria (DEC에) 신뢰와 NIH에 의해 지원되었다. 공 초점 현미경 영상은 VCU 나노 물질 특성 코어 (NCC) 시설에서 수행되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Nesprin-TS DNA | Addgene | 68127 | https://www.addgene.org/68127/ |
| Nesprin-HL DNA | Addgene | 68128 | 검색 https://www.addgene.org/68128/ |
| mTFP1 DNA | Addgene | 54613 | 에서 검색 https://www.addgene.org/54613/ |
| mVenus DNA | Addgene | 27793 | 에서 검색 https://www.addgene.org/27793/ |
| TSmod DNA | Addgene | 26021 | https://www.addgene.org/26021/ |
| Competent Cells | Bioline | BIO-85026 | |
| 액체 LB 매체 | ThermoFisher | 10855001 | |
| https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001 고체 LB 세균 배양 플레이트 | Sigma-Aldrich | L5667 | |
| http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en®ion=US Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| 분광 광도계 | Biorad | 273 BR 07335 | SmartSpec Plus |
| 석영 큐벳 | Biorad | 1702504 | SmartSpec Plus용 큐벳 |
| DNA 분리 키트 | Macherey-Nagel | 740412.5 | NucleoBond Xtra Midi Plus |
| 6-웰 세포 배양 접시 | Falcon-Corning | 353046 | Multiwell 6-웰 폴리스렌 배양 접시 |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) 세포 배지 | Gibco | 11995-065 | DMEM(1x) |
| 소 혈청 | Life Technologies | 16170-078 | |
| 환원 혈청 세포 배지 | Gibco | 31985-070 | 환원 혈청 배지, "optimem" |
| 지질 캐리어 솔루션 | invitrogen | 11668-019 | 지질 시약, "Lipofectamine 2000" |
| 1.5 mL 멸균 플라스틱 튜브 | Denville | c2170 | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | 0.25% Trypsin-EDTA (1x) |
| 유리 바닥 현미경 관찰 접시 | In Vitro Scientific | D35-20-1.5-N | 35 mm 접시 20 mm 바닥 웰 #1.5 유리 |
| Fibronectin | ThermoFisher | 33016015 | 피브로넥틴 인간 단백질, 플라즈마 |
| 인산염 완충 식염수 (PBS) | Gibco | 14190-144 | Dulbecco의 인산염 완충형 식염수 |
| 15 mL 멸균 원심분리기 튜브 | Greiner bio-one | 188261 | |
| 스윙 로터 원심분리기 | Thermo electron | Centra CL2 | 스윙 로터 thermo electron 236 |
| 세포 배양 생물 안전성 후드 | Forma Scientific | 1284 | |
| 기후 제어 세포 배양 인큐베이터 | ThermoFisher | 3596 | |
| 도립 LED 광시야 형광 현미경 | Life Technologies | EVOS FL | |
| Clear HEPES 버퍼 이미징 매체 | 분자 프로브 | ||
| Fetal bovine Serum | Life technologies | 10437-028 | |
| 온도 제어-역 컨포칼 w/458 및 515 nm 레이저 소스 | 자이스 | LSM 710-w/스펙트럼 META 검출기 | |
| Outgrowth Media | Newengland Biolabs | B9020s | |
| NIH 3T3 섬유아세포 | ATCC | CRL-1658 |
참고문헌
- Conway, D. E., Schwartz, M. A. Flow-dependent cellular mechanotransduction in atherosclerosis. J Cell Sci. 126, Pt 22 5101-5109 (2013).
- Arsenovic, P. T., Ramachandran, I., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dep....
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