설치류의 심근경색(MI)에 대한 사후 평가는 염색된 심장 절편에 대한 경색의 정량화를 기반으로 합니다. 우리는 적출된 쥐 심장의 기저부에서 정점까지의 체계적인 샘플링과 삼색으로 염색된 조직학적 절편의 이미지 분석을 사용하여 경색 크기를 정량화하는 정확한 방법을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
심근경색은 장기간의 허혈로 인한 심근세포 폐사로 정의되며, 허혈성 손상에 따른 염증 반응 및 흉터 형성(섬유화)이 발생합니다. 초기 급성기 이후, 좌심실(LV)의 만성 재형성은 심장의 구조와 기능을 수정합니다. 작은 동물의 영구적 관상동맥 결찰술은 MI의 만성 모델에 대한 참조 모델로 널리 사용되어 왔습니다. 경색된 벽의 얇아짐은 점진적으로 경벽성 섬유증으로 발전합니다. 경색 크기에 대한 조직학적 평가가 일반적으로 수행됩니다. 그럼에도 불구하고 정량화 방법의 표준화는 누락되어 있습니다. 실제로, 분석된 섹션의 수, 표본 추출 및 정량화 방법과 같은 중요한 방법론적 측면은 일반적으로 설명되지 않으므로 조사 간의 비교를 배제합니다. 너무 자주, 정량화는 유두 근육 수준에서 얻은 단일 절편에 대해 수행됩니다. 경색 확장 및 리모델링을 줄이기 위한 새로운 전략이 연구 중이기 때문에 정확한 심장 샘플링 프로토콜의 표준화가 중요하게 필요합니다. 우리는 채취된 쥐 심장의 체계적인 샘플링과 기저부에서 정점까지 얻은 삼색 염색 조직학적 절편의 이미지 분석을 사용하여 경색 크기를 정량화하는 정확한 방법을 설명합니다. 또한 확장 지수(EI)를 계산하면 리모델링 전반에 걸쳐 좌심실의 변화를 고려하여 경색 크기를 평가할 수 있다는 증거를 제공합니다.
서론
심근 경색 (MI)는 전 세계적으로 사망과 장애의 주요 원인이다. 관상 동맥 심장 질환의 주요 원인이며; MI는 폐색과 같은 관상 동맥 사건에 연속 허혈의 결과. 재관류는 제 6 시간 내에 수행되지 않는 경우, 허혈 비가역 심근 괴사를 유도한다. 환자에서 MI의 특성은 임상 증상, 심전도, 바이오 마커, 심 초음파, MRI 영상의 혈장 수준의 평가 등 다양한 진단 도구에 의존하고, 조직 학적 1을 분석합니다. 급성 및 만성 MI는 관상 동맥 폐색시에 심근 괴사의 타이밍에 따른 손상의 두 가지 단계로 분류된다. 처음 7 일 동안 발생하는 급성 단계는, 상기 심근의 손실, 광범위한 염증 및 섬유 아세포의 채용과 연결됩니다. 심장 조직과 흉터의 형성 치유 특징 서브 급성기가 발생1 ~ 4-6주. 경색, 심실 벽이 얇아 및 뇌실 팽창의 확장은 만성 단계의 특징. 좌심실의 광범위한 개조 점진적 중증 심부전이 초래한다.
영구 왼쪽 앞쪽에 하강 동맥 (LAD) 결찰에 의해 유도 된 MI는 만성 심근 경색의 표준 설치류 모델을 나타냅니다. 관상 합자 모방 관상 동맥 폐색. 경색의 크기는 합자의 위치에 따라 달라집니다. 설치류 모델에서 심근 허혈의 특성은 이러한 고전 트로포 같은 바이오 마커의 플라즈마 수준을 사용하여 수행된다 I와 T (3), 심 초음파 검사, MRI 및 조직학 4,5-. 바이오 마커 레벨은 심근 죽음의 정도와 상관 관계가있다. 심장 초음파 검사는 국소 벽 운동 이상으로 인한 좌심실 기능 장애를 평가합니다. 이러한 또는 MRI와 같은 고해상도 또한, 비 침습성 영상화 기술에서심장 초음파 검사는 벽 운동의 감소 평가를 허용 감소 관류 가능한 심근 및 감육과 흉터 영역의 볼륨. LV 치수 경색 크기의 정확한 평가를 허용한다. 마지막으로, 가능한 죽은 심근의 정량화 수확 마음의 조직 학적 섹션의 특정 얼룩을 사용하여 사후을 수행 경색 크기 (IS)의 검증을 허용 할 수 있습니다. 또 다른 중요한 특징은 경색 팽창 지수 (EI) (6)의 평가이다. EI는 처음 3 일 이내에 전층 경색과 시작과 연관됩니다. EI는 벽 두께의 점진적인 감소는 LV 캐비티 대형화 및 LV 형상 그에 변경을 특징으로한다.
신규 한 치료의 치료 효과를 평가하기 위해 - 특히, 회생 전략 세포 행렬에 기초하고, 설치류 MI의 유전자 전달 정확한 평가는 가장 중요하다.유두근 레벨에서 획득 한 단면에서 측정 할 때, IS 크기 LAD 결찰 다음 경색 개발에 존재하는 큰 변화로 인해 편향 될 수도있다; 정점 경색은 occulted 될 수 있습니다. 중요한 결정 MI 크기보다 정확한 방법은 마우스 또는 래트 7-9 10에 대해 기재되어있다. 그럼에도 불구하고, IS 정확하게 LV 개조 또는 리모델링의 치료 유도 감소 (또는 preventions)를 정량화하기에 충분하다. 실제로, 일반적으로 심장의 단면으로 평가 LV 총 체적의 백분율로 표시된다. 이 방법은 급성 MI에 대한 유효하지만, 리모델링시 발생하는 좌심실 벽의 숱은 11, 12 평가에서-남아있다. 경색 크기 및 구조 변경의 완전한 형태 학적 정량은 내막과 외막 길이와 직경뿐만 아니라, 경색 건강 분야 등 여러 가지 파라미터를 정량화한다. 우리는 방법 론적 appr를 설명oach 정확하게 만성 쥐 모델에서 MI 및 리모델링을 평가합니다.
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프로토콜
모든 동물은 동물 관리에 관한 유럽 협약을 준수 인도적인 치료를 받았다. 수술 절차는 스위스 연방 수의학 사무실, 스위스의 승인을 국가 수의학 사무실, 프리 부르의 허가를 얻은 후 스위스 동물 보호법에 따라 수행 하였다.
1. 심장 수확
참고 : 모든 수술 개입은 이소 플루 란 마취하에 시행 하였다. 노력은 동물의 고통을 감소하기 위해 만들어졌다. 특히, 모든 동물은 0.1 ㎎ / ㎏ 프레 놀핀 예비 마취의 피하 주사를 받았다. 심근 경색을 영입하기위한 수술 프로토콜은 이전에 다른 곳에서 13 설명 하였다.
- 마취 (삽관 동물, 2.5 %의 이소 플루 란, 발 핀치 반사에 의해 확인 적절한 마취) 아래 myocardially 경색 동물에 흉골 절개를 수행합니다.
- 다음 근육을 피부를 절단하여 동물을 엽니 다수술 가위로. 왼쪽과 오른쪽에있는 갈비뼈를 절단 한 다음 가슴을 제거합니다.
- 이전 수술 (LAD 결찰) 후 남은 유착을 제거합니다. 대동맥을 잘라 마음을 제거합니다. (PBS)에 1 M의 KCl의 조직을 넣어, 다음 PBS로 씻는다.
2. 조직 준비
- 아크릴 쥐의 심장 매트릭스에 길이 방향으로 경색 마음을 넣습니다. 1 시간 동안 -20 ° C에서 보관하십시오.
- 횡으로 면도날을 사용하여 매트릭스 직접 중심을 잘라. 각 조각을 확인하는 2mm 두께입니다. (리모델링 수준에 따라) 각각의 심장 7 슬라이드 - 약 5 컷 이 체계적인 샘플링이라고합니다.
- 이 단계에서, 2,3,5- 트리 페닐 테트라 졸륨 클로라이드 (TTC) 염색을 수행하는 단계 (심장 슬라이스베이스 - 정점의 방향을 유지하는) 선택 사항이다.
- 37 ° C에서 50 분 동안 PBS에 1 % TTC에 품어. 1 시간 20 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)에서 부화. betwee 섹션을 넣어n은 2-mm 스페이서와 두 개의 유리판과는 15 배 배율로 카메라와 결합 stereological 현미경으로 사진을 찍을.
주의! 파라 포름 알데히드는 독성이있다.
- 37 ° C에서 50 분 동안 PBS에 1 % TTC에 품어. 1 시간 20 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)에서 부화. betwee 섹션을 넣어n은 2-mm 스페이서와 두 개의 유리판과는 15 배 배율로 카메라와 결합 stereological 현미경으로 사진을 찍을.
- 슬라이드 동결 (1 차 옵션)
- (몰드의 바닥 아래 부분의 정점 중심쪽에 배치)의 방향을 유지 cryotomy 용 배지 (최적 절단 온도 OCT를) 실장과 플라스틱 몰드 (10 × 10 × 5mm)의 각 슬라이드를 넣는다. 15 분 - 10 냉각액 질소 하에서 2- 메틸 부탄 증기와 블록 동결. 마지막으로, -80 ° C에서 조직을 저장합니다.
- Paraffinization (2 차 옵션)
- 24 시간 동안 4 % PFA에서 각 카세트 삽입에 슬라이드 (아래 카세트의 하단에있는 부분의 정점 지향적 인 측면을 배치하여 방향을 유지)과 놓습니다. 조직 프로세서 기계 하룻밤에 넣어.
- 2 시간 동안 에탄올 70 %에 품어. 이단에 품어2 시간 동안 95 %를 올 실시. 3 시간 동안 100 % 에탄올에 부화. 4 시간 동안 크 실롤에 품어. 5 시간 동안 (오븐에서 60 ℃에서 용융) 파라핀을 부화. 마지막으로, 파라핀의 각 심장 슬라이드를 삽입하여 블록을 확인합니다.
- 24 시간 동안 4 % PFA에서 각 카세트 삽입에 슬라이드 (아래 카세트의 하단에있는 부분의 정점 지향적 인 측면을 배치하여 방향을 유지)과 놓습니다. 조직 프로세서 기계 하룻밤에 넣어.
3. 메이슨 - Goldner 트리 크롬 염색
- (5 μm의 두께) 또는 -18 ℃로 설정 저온 유지 장치와 간섭 단층 블록에서 (두께 : 7 μm의) 수동 마이크로톰으로 파라핀 블록에서 조직 섹션을 확인합니다.
- 메이슨 - Goldner와 - (슬라이드 당 4 횡단 섹션 3) 트리 크롬 염색 (부록 참조) 각 쥐에 대한 각각의 심장 부분에서 하나의 슬라이드를 얼룩.
참고 : 파라핀 섹션에 대해이 단계에서 시작합니다.- 오븐에서 60 ° C에서 슬라이드 녹아. 흄 후드에서 10 분 각각에 대해 두 번 크 실롤에서 그들을 deparaffinize. 3 분마다 100 % 에탄올, 95 % 에탄올, 70 % 에탄올 및 증류수을 재수.
참고 : 동결 절단 (Cryosections)에 대해이 단계에서 시작에스. - Bouin 용액에 하룻밤을 수정합니다. 15 분 - 그 후, 10 수돗물을 실행에 그들을 씻어. 증류수를 씻어. 3 분 마이어의 헤 마톡 실린에서 그들을 품어.
- 슬라이드를 제거하고 5 분 동안 증류수를 둡니다. 그런 다음, 5 분 동안 산 푹신-개양귀비 빛에서 그들을 품어. 1 분 동안 1 % 아세트산을 씻어.
- 다음, 1 분 동안 몰리브덴 산 오렌지 G에서 그들을 품어. 1 분 동안 1 % 아세트산을 씻어 10 분 동안 밝은 녹색 염료에서 그들을 품어, 1 분 동안 1 % 아세트산을 헹군다.
- 70 % 에탄올 (30 초), 95 % 에탄올 (30 초), 100 % 에탄올 (5 분)에서 그 탈수. , 조직 섹션에 수지 장착 매체의 한 방울을 넣고 된 커버로를 커버하고 건조 할 수 있습니다.
- 오븐에서 60 ° C에서 슬라이드 녹아. 흄 후드에서 10 분 각각에 대해 두 번 크 실롤에서 그들을 deparaffinize. 3 분마다 100 % 에탄올, 95 % 에탄올, 70 % 에탄올 및 증류수을 재수.
4. 경색 크기 분석
- 카메라와 결합 된 실체 현미경 (15 배 확대)에 각 슬라이드에서 하나의 이미지를 획득. 같은 설정으로 통치자를 촬영에스.
- 경색, 격벽 두께, 좌심실 (LV) 공동 영역 경색 영역 및 사용 LV 조직 영역의 중간에 흉터 두께를 측정하는 이미지 분석 소프트웨어를 사용한다.
- 눈금자 사진 (그림 1A)와 규모를 설정합니다.
- 다음 설정 변환 계수를 선택 측정을 클릭합니다. 교정 줄에 선을 그립니다. 오른쪽 사진을 클릭하고 최종 교정을 클릭합니다. 바 값을 참고 한 다음 확인을 클릭합니다.
- 스테인드 심장 사진 (그림 1B)에서 LV를 선택합니다. 다중 세그먼트 도구를 사용합니다. 좌심실 지점별로 포인트를 선택하고 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭 복사 / 어디든지 붙여 넣습니다.
- 단일 세그먼트 측정 도구를 사용하여 흉터 및 격벽 두께를 측정 (도 1C ).
- 자동 LV 캐비티 경색을 검출하고, LV 영역은 RGB 모드 (도 1D)의 자동 면적 측정 도구를 사용.
- 도구를 클릭합니다. 활성화 만 테두리 및 RGB 모드에서 연속. 마지막으로 검출하는 관심 영역 내부를 클릭. 필요한 경우, 정밀 도구를 사용합니다.
- 눈금자 사진 (그림 1A)와 규모를 설정합니다.
- 좌심실 면적에 대한 경색 면적의 비율로서 경색 크기를 계산한다.
- 다음 팽창 지수를 계산 : LV 캐비티 면적 / 전체 LV 영역] / [경색 두께 / 격벽 두께 같이, LV 캐비티와 LV 조직 영역을 모두 포함하는 전체 LV 면적.
- 마지막으로 다음과 같이 각각의 마음에 대한 "평균"계산 : [경색 슬라이드에서 확장 인덱스의 평균] * [경색 슬라이드 번호 슬라이드 / 총].
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결과
6 주 후 LAD 내고는, 마음은 루이스 쥐에서 수확했다. 2 mm 조직 섹션은 정점에서베이스를 얻었다. TTC 염색 절차는 흰색에 나타나는 경색 영역, 그리고 빨간색으로 표시되는 건강한 심근, (그림 2) 시각화 하였다. LAD의 결찰의 위치에 따라 경색 크기가 달라집니다. 큰 MI를 들어, 전층 경색베이스 (그림 2A)로 정점에서 관찰되었다. 작은 경색은 심장 (그림 2B)의 중간 부분에 정점에서 볼 수 흰색 경색 조직을 발표했다. 작은 비 전층 경색의 경우, 섬유 성 조직 정점 (도 2C)로부터 하나 또는 두 섹션에서 관찰되었다.
각각의 심장 조각에서 얇은 5 μm의 섹션 잘라 메이슨 - Goldner의 트리 크롬으로 염색 하였다. 심...
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토론
프로토콜 내에서 중요한 단계
섬유 성 조직이 정확하게 수확 마음과 이미지의 계통 추출법을 사용하여 만성 MI 쥐 모델에서 평가 될 수는 정점에베이스에서 얻은 삼색 염색 조직 학적 섹션으로 분석합니다. 두 단계는 성공적인 프로토콜 구현에 특히 중요하다. 먼저, 심장 수확의 KCl 사용은 심장 근육이 이완 된 상태로 유지 될 수있다. 이 단계는 서로 다른 마음에서 경색 크기의 비교를 위해 중요하다. 둘째, Bouin 용액 섹션의 하룻밤 고정 밝은 트리 크롬 염색을 수득하는 것이 중요하다.
수정 및 문제 해결
염색의 부재는 감소 배양 시간 등 Bouin 용액의 섹션의 고정 동안 어려움 때문일 수 또는 Bouin 솔루션을 만료 할 수 있습니다. TTC의 얼룩은 선택과 coul입니다급속하지만 비 정량적 방식으로 경색 크기를...
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 스위스 국립재단[SNF 310030-149986 to MNG], 프리부르 대학, 프리부르 병원의 지원을 받았다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 아크릴 쥐 심장 매트릭스 2mm | 72-5015 | Harvard Appartus | |
| Inspira 고급 볼륨 제어 인공 호흡기 | 하버드 장치 | 557058 | |
| 카테터 Insyte 14 G | BD | 381267 | |
| O.C.T | BDHA361603E | VWR | |
| TTC | T8877-10G | 시그마 Aldrich | |
| Mayer hematoxylin | MHS32-1L | 시그마 알드리치 | |
| 애시드 푹신 CI 42685 | F8129-50G | 시그마 알드리치 | |
| 폰소 Xylidin CI 16150 | P2395-25G | 시그마 알드리치 | |
| 오렌지 G CI 16230 | O3756-100G | 시그마 알드리치 | |
| 라이트 그린 CI 42095 | L5382-25G | 시그마 알드리치 | |
| KCl | P9333-500G | 시그마 알드리치 | |
| 자일롤 | 10315083 | 허니웰 | |
| 에탄올 앱솔루트 | 10303990 | 허니웰 | |
| 2-메틸부탄 | M32631-1L | 시그마 알드리치 | |
| 입체 현미경 | SM2800 | 니콘 | |
| 포름알데히드 | 99340 | 리액톨랩 | |
| 임베딩 카세트 | K113.1 | Carl Roth | |
| Bersoft 이미지 측정 소프트웨어 | Bersoft.com | 라이선스 소프트웨어 |
참고문헌
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재인쇄 및 허가
