방법 논문

원심 중력에 의해 지방이 유래 줄기 세포의 연골 분화 유도

DOI:

10.3791/54934

⸱

2017년 2월 24일

 ,  , 
1CiSTEM Laboratory, Convergent Research Consortium for Immunologic Disease, Division of Rheumatology, Seoul St. Mary’s Hospital, College of Medicine, The Catholic University of Korea

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

기계적 스트레스는 줄기세포의 연골형성 분화를 유도하여 손상된 연골 복구를 위한 잠재적인 치료법을 제공할 수 있습니다. 원심 중력(CG)을 사용하여 지방 유래 줄기세포(ASC)의 연골 분화를 유도하는 프로토콜을 제시합니다. SOX9의 CG 유도 상향 조절은 연골 형성 표현형의 발달을 초래합니다.

초록

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손상된 연골은 자연적으로 치유될 수 없습니다. 현재 연골 결손증에 대한 가장 발전된 치료법은 사이토카인을 사용하여 줄기세포에서 분화된 연골세포를 이식하는 것입니다. 안타깝게도, 사이토카인에 의한 연골형성 분화는 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요되며 in vitro 분화 중 오염 위험이 높습니다. 그러나 생체역학적 자극은 연골 형성에 대한 중요한 조절 요인으로도 작용합니다. 예를 들어, 기계적 스트레스는 줄기세포의 연골형성 분화를 유도할 수 있으며, 이는 손상된 연골을 복구하기 위한 잠재적인 치료법을 제시합니다. 본 연구에서는 원심분리에 의해 쉽게 가해지는 기계적 응력인 원심중력(CG, 2,400 × g)이 지방 유래 줄기세포(ASC)에서 성 결정 영역 Y(SRY)-box 9(SOX9)의 상향 조절을 유도하여 연골 생성 표현형을 발현하도록 한다는 것을 입증했습니다. 원심분리된 ASC는 아그레칸(ACAN), 콜라겐 유형 2 알파 1(COL2A1) 및 콜라겐 유형 1(COL1)과 같은 연골 형성 분화 마커의 수치가 더 높았지만, 비후성 연골 세포의 마커인 콜라겐 유형 10(COL10)의 수치는 더 낮았습니다. 또한, 연골형성의 전제 조건인 연골형성 응집체 형성이 원심분리된 ASC에서 관찰되었습니다.

서론

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관절 연골의 결함은 자연적으로 치유되지 않습니다. 따라서, 세포 이식이 손상 연골의 수리를 위해 유망한 방법으로 제안 된 줄기. 그러나,이 방법은 줄기 세포의 충분한 수의 취득 및 연골 분화를 받아야하는 이러한 세포의 유도를 모두 요구한다. 골수 (BM)은 널리 줄기 세포의 공급원으로서 사용되었지만, BM 세포의 분리는 두 가지 단점이있다 : 침입 불충분 수율. 때문에 취득 용이성, 지방 조직에서 줄기 세포의 바람직한 소스이다. 이전의 연구는 지방 조직으로부터 줄기 세포를 분리 및 TGF-β1 (1, 2)과 같은 사이토 카인을 사용하여 이들 세포의 연골 분화를 유도하는 가능성을 입증 하였다. 이러한 방법은 효과가 있지만 비싸다.

사이토킨에 대한 저비용 대안으로서, 기계적 응력에 사용될 수있다연골 분화를 유도한다. 기계적 부하는 관절 연골 (3)의 상태를 유지하는데 중요한 역할을하고, 여러 가지 세포의 연골 세포 표현형을 유도 할 수있다. 예를 들어, 수압은 MAP 키나아제 / JNK 경로 4를 통해 활막 유래 전구 세포의 연골 세포 표현형을 유도하고, 기계 압축비는 연골 세포의 유전자 5 상승 조절하여 인간 중간 엽 줄기 세포 (MSC들)에서 연골을 유도한다. 또한, 전단 응력은 인간 중간 엽 줄기 세포의 연골 6 관련된 세포 외 기질 (ECM)의 발현에 기여한다. 원심 중력 (CG)를 원심 분리에 의해 용이하게 생성 된인가 제어 기계적 응력은 셀 7에서 차등 유전자 발현을 유도 할 수있다. 예를 들어, 폐 상피 암종 세포에서 인터루킨 (IL) -1b의 발현을 원심 분리 (8)에 의해 상향 조절된다. 티herefore, 실험적으로 유도 기계적 응력으로서, CG는 줄기 세포의 연골 세포에서 유전자 발현을 유도 할 수있다. 그러나, CG는 줄기 세포의 연골 분화를 유도 할 수 있는지 불분명.

본 연구에서는 CG가 연골 세포 유전자의 과발현의 결과로, 인간의 ASC에서, SOX9의 상향 조절, 연골의 마스터 레귤레이터를 유도 한 것으로 나타났습니다. 또, TGF-β1의 것과 연골에 CG의 효과, 성장 인자는 가장 일반적으로 줄기 세포에서 시험 관내 연골을 유도하는 데 비해.

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프로토콜

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이 연구 프로토콜은 NIH 지침에 따라 가톨릭 대학교 (KC16EAME0162)의 기관 검토위원회의 승인을 수행 하였다. 모든 조직은 서면 통보 동의를 얻었다.

1. 원심 중력로드 및 펠렛 문화

  1. 세포 배양 및 수확
    1. 배양의 ASC (P2-P3, 자재 목록 참조), 37 ℃에서 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S)이 보충 된 둘 베코 변형 이글 배지 낮은 글루코즈 (DMEM-LG)에서 5 % CO 2를 포함하는 가습 인큐베이터있다.
    2. 세포가 80 % 합류에 도달했을 때, 배지를 버리고 1X 인산 완충 생리 식염수 5 ㎖ (PBS)으로 세포를 세척 하였다.
    3. PBS 함유 1mM의 EDTA 1 ㎖를 첨가하고, 5 % CO 2를 포함하는 가습 인큐베이터에서 37 ℃에서 2 분간 배양한다.
    4. 에 세포를 전송, 부드럽게 문화 판을 눌러 새로운 배지 4 mL를 넣고15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기 실온에서 2 분 (RT) 250 × g에서 세포.
  2. 원심 중력 하중
    1. 원심 분리 (단계 1.1.4) 후, 펠렛을 교란시키지 않고 상층 액을 제거하고, 10 % FBS와 DMEM-LG 10ml에 펠렛을 재현 탁. 혈구 세포를 사용하여 계산.
    2. CG로드를 들어, 15 분 동안 2,400 × g에서 새로운 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에 2.5 × 10 5 세포를 전송합니다.
  3. 펠렛의 문화
    1. 즉시 원심 분리 후, 상등액을 흡인하고 정의 연골 분화 배지 500 μL를 추가 (CDM은 고 글루코스 DMEM는 1 % FBS, 1 % ITS + 프리믹스, 100 나노 덱사메타손, 1X MEM 비 필수 아미노산 용액, 50 μg의 보충 / ㎖ L - 프롤린, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신). 모든 매체 변화에 새로 제조 된 L- 아스 코르 빈산 2- 인산의 50 μg의 / ML을 추가합니다. 양성 대조군으로, 연골 유도 differentiati추가하여 원심 분리하지 않은 세포에 CDM은 10 NG / mL의 TGF-β1을 포함.
    2. 서 위치 펠렛을 함유하는 튜브를 캡핑 느슨하게 삽입하고, 5 % CO 2를 포함하는 가습 인큐베이터에서 37 ℃에서 배양한다.
    3. 삼주 위해 매일 매체를 변경합니다.
  4. Micromass 문화
    1. 즉시 원심 분리 (단계 1.2.2 15 분 동안 2,400 ×의 g) 후, 뜨는을 대기음 및 CDM의 10 μL에 펠렛을 재현 탁.
    2. micromass을 형성하기 위해, 24- 웰 플레이트의 웰의 중앙에 재현 탁하고 세포를 배치했다.
    3. 2 시간 후, 조심스럽게 micromass을 방해하지 않도록 접시의 벽에 잘 피펫에 CDM 1 mL를 넣어. 양성 대조군으로, 10 NG / ㎖ TGF-β1을 포함하는 CDM을 첨가하여 원심 분리하지 않은 세포와 micromass 배양을 수행한다.
    4. 5 % CO 2를 포함하는 가습 인큐베이터에서 37 ° C에서 배양 한 micromass.
    5. 매체 EV 변경삼주에 대한 다른 일 ERY.

2. 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR)을 연골 세포 분화 마커 전사 상향 조절을 검출하도록

  1. 14 일에, 1X PBS에서 그들을 새로운 1.5 ML의 튜브에 회전 타원체 펠렛을 전송하고 씻어 피펫을 사용합니다.
  2. 구 아니 디늄 티오 시아 네이트 페놀 - 클로로포름 추출 방법 (9)를 사용하여 펠렛에서 총 RNA를 추출합니다.
  3. 제조사의 프로토콜에 따라 역전사 효소를 이용하여 총 RNA로부터 2 μg의 cDNA의 합성 (1 시간 동안 42 ° C에서 부화 한 다음 5 분 동안 70 ℃에서 효소를 실활).
  4. 연골 분화 마커 (10)에 대한 특정 프라이머로 PCR을 수행합니다.

3. 염색은 연골 분화 마커 단백질의 과발현을 감지하는

  1. 파라핀 포함 세포 펠렛
    1. 21 일에,회전 타원체 펠렛을 수확하고 1X PBS로 씻어 피펫을 사용합니다.
    2. 24 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드의 침수에 의한 회전 타원체의 알약을 수정합니다.
      주의 : 파라 포름 알데히드는 매우 독성이다. 눈, 피부 또는 점막과의 접촉을 피하십시오. 노출을 최소화하고 준비하는 동안 흡입을 피하십시오. 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오.
    3. 정착액을 취소하고 탈 이온수 (DW)와 세포 펠렛을 씻어.
    4. 카세트에 거즈의 한 층을 삽입하고 피펫을 사용하여 고정 된 펠렛을 전송합니다. 거즈를 접어 펠렛을 덮고 카세트 뚜껑을 닫습니다.
    5. 펠렛을 탈수.
      1. RT에서 5 분 동안 70 % 에탄올 (EtOH 중)의 펠릿을 담근다.
      2. RT에서 5 분 동안 80 % EtOH로의 알약을 담가.
      3. RT에서 5 분 동안 95 % EtOH로의 알약을 담가.
      4. RT에서 5 분 동안 100 %의 EtOH의 알약을 담가. 두 번 반복합니다.
      5. 실온에서 15 분 동안 100 % 크실렌의 알약을 담가. 반복 트위어가전.
    6. 금형에 56 ° C에서 파라핀에 고정 된 세포 펠렛을 포함; 펠릿 전문 자동화 조직 처리 시스템을 사용하여 파라핀에 매립 될 수있다.
    7. 회전 마이크로톰을 이용하여 파라핀 세포 펠릿으로부터 두께 5㎛의 부분을 잘라.
    8. 50 %의 EtOH의 섹션 플로트 다음 슬라이드를 사용하여 50 ℃의 수조로 옮긴다.
    9. 슬라이드에 떠있는 섹션을 배치합니다.
  2. Safranin O 및 알 시안 블루 염색
    1. 파라핀 섹션 재수.
      1. 15 분 동안 크실렌의 슬라이드를 담가. 두 번 반복합니다.
      2. 5 분 동안 100 % EtOH 중 슬라이드를 담근다. 두 번 반복합니다.
      3. 5 분 동안 90 %의 EtOH에 슬라이드를 담근다.
      4. 5 분 동안 80 %의 EtOH에 슬라이드를 담근다.
      5. 5 분 동안 70 % EtOH로의 슬라이드를 담가하고 1X PBS에서 그들을 씻는다.
    2. 1 % Safranin O 솔루션 3 % 알 시안 블루 용으로 재수 섹션을 얼룩30 분.
    3. 염색 솔루션을 취소하고 DW와 섹션을 씻어.
    4. 1 분 동안 헤 마톡 실린 / 에오신 용액 (Counterstain과)와 섹션을 얼룩.
    5. 염색 솔루션을 취소하고 DW와 섹션을 씻어.
    6. 잔여 물을 제거 한 후 커버 슬립에 장착 매체의 드롭을 놓습니다. 조심스럽게 장착 매체를 포함하는 커버 슬립에 슬라이드 (아래 셀 측)을 배치합니다.
    7. 슬라이드는 실온에서 2 ~ 3 시간 동안 건조하도록 허용합니다.
    8. 밝은 필드 현미경 (자동화 직립 현미경, 50X 및 200X)를 사용하여 이미지를 캡쳐.
  3. 면역 형광 분석
    1. 섹션 3.2.1에 설명 된대로 섹션을 재수.
    2. 시트르산 나트륨 완충액에서 슬라이드 (10 mM의 시트르산 나트륨, 0.05 % 트윈 20, pH를 6.0)에 담가하고, 마이크로파를 이용하여 10 분 동안 서브 끓는 온도들을 유지한다.
    3. 실온에서 20 분 동안 슬라이드를 냉각 한 후 수돗물로 씻어.
    4. 3 %에서 슬라이드를 부화H 2 O 다음 15 분 동안 (1X PBS)에 2, 15 분 11 수돗물로 씻는다.
    5. 1 시간 동안 완충액 (PBS 중 10 % 정상 염소 혈청)을 차단와 슬라이드 블록.
    6. 블로킹 용액을 흡인하고 슬라이드 상 5 % 정상 염소 혈청으로 희석 차 항체를 적용한다.
    7. 4 ℃에서 밤새 슬라이드를 품어.
    8. 5 분마다 1X PBS에서 슬라이드를 세 번 씻으십시오.
    9. 어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안 5 % 정상 염소 혈청으로 희석하고, 형광 접합 된 이차 항체의 슬라이드를 부화.
    10. 어둠 속에서 5 분마다 1X PBS에서 슬라이드를 세 번 씻으십시오.
    11. 10 분 동안 DAPI (1 μg의 / mL)으로 슬라이드를 품어하고 5 분마다 1X PBS에서 그들에게 두 번 씻는다.
    12. 잔여 물을 제거 한 후 커버 슬립에 장착 매체의 드롭을 놓습니다. 조심스럽게 설치 매체에 슬라이드 (아래 셀 측)을 배치합니다.
    13. 슬라이드 2-3에 대한 건조하도록 허용실온에서 어둠 속에서 시간.
    14. 형광 현미경을 사용하여 슬라이드를 시각화 (594 nm의 DAPI : 루비로드 340 nm의, 60X 및 200X 배율) 12.

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결과

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원심 중력 지방 유래 줄기 세포의 연골 세포 분화 마커의 과다 발현을 유도한다.

연골 분화를 유도하기에 적합한 원심 중력의 정도를 결정하기 위해,의 ASC는 15 분 동안 다른 CG의도 (0, 300, 600, 1,200, 2,400 XG)로 자극 하였다. 자극 후, ASC를 배양 플레이트에 다시 접종하고 24 시간 동안 배양 하였다. 도 1a에 도시 된 바와 같이, SOX9 mRNA 발현은 현저히 2400 XG 증가시켰다 이 약 (의 ASC는 CG로드되지 않음) 제어에 비해 2,400 XG에서 높은 1.5 배이었다. CG는 연골 분화를 유도 여부를 확인하기 위해, 우리는 CG로드 또는 TGF-β1 처리에 의해의 ASC를 자극. 음성 대조군으로는 ASC를 자극하지 않고 배양 하였다. 샘플은 14 일에 수확하고, QRT-PCR을 실...

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토론

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세포의 stemness 상태는 SOX9의 CG에 의한 과잉 발현에 매우 중요합니다. 우리의 연구에서, SOX9 표현은 아니지만 나중에-통로의 ASC에서, 초기 통로의 ASC (2-3)에서 CG에 의해 유도 될 수있다. 배양 동안의 ASC 3 통로 (16)까지 CD34 + 세포를 포함하는 것으로보고되었다. 의 ASC는 세포가 CG로 낮은 반응의 결과로 계대 CD34의 발현을 상실하는 경향이있다.

원심 중력으로, 수압은 CG 자극하는 동안 세포에로드 할 수 있습니다. 따라서, 매질의 부피 SOX9의 유도에 영향을 미치는 하나의 요인 일 수있다. 각 실험에 대한 짝수 정수압 환경을 유지하기 위해, 배지 1 ㎖를 15 ㎖의 튜브에 1 × 105 세포 당 사용 하였다. 또한, 스윙 버킷 로터가 균일 (직각을 형성함으로써) 세포에 CG를 적용 하였다.

TGF-β1에 비해 C...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 이 작업과 관련된 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 연구는 보건복지부(보조금번호: HI14C2116)의 지원을 받은 한국보건산업진흥원(KHIDI)의 한국보건기술연구개발사업(Korea Health Technology R&D Project)의 지원금과 가톨릭대학교 서울성모병원 연구기금의 지원을 받았다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Plasticware
100 mm 접시TPP93100
60 mm 접시TPP93060
50 mL Cornical 관SPL50050
15 mL Cornical 관SPL50015
10 mL 일회용 피펫Falcon7551
5 mL 일회용 피펫Falcon7543
ASC Culture Media Materials
DPBSLife Technologies14190-144
DMEM 저당Life Technologies11885-084성장 기반 매체
Penicilin StreptomycinSigma AldrichP43331%
Fetal Bovine SerumLife Technologies16000-04410%
PBS/1 mM EDTALife Technologies12604-039
Chondrogenic Differentiation Media Materials
DMEM High glucoseLife Technologies11995연골 생성 분화 기본 매체
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)Life Technologies11140-050
덱사메타손시그마 알드리치D2915100 nM
페니실린 스트렙토마이신생명 기술P43331%
태아 소 혈청생명 기술16000-0441%
아스코르베이트-2-인산염시그마 알드리치A896050 μ g/mL
L-프롤린시그마 AldrichP560750 μ g/mL
ITSBD1%
Human TGFβ 1Peprotech100-2110 ng/mL
Materials
18 mm 커버 유리우수한HSU-0111580
4% 파라포름알디히드Tech & 혁신BPP-9004
Tween 20BIOSESANGT1027
소 혈청 알부민벡터 랩SP-5050
안티콜라겐 II 항체abcam ab347121:100
염소 anti-Rabbit IgG (H+L) 2차 항체, Alexa Fluor 594 conjugateMolecular ProbeA-110371:200
DAPIMolecular ProbeD1306
Prolong gold antifade reagentInvitrogenP36934
Slide Glass, 코팅현일 Lab-MateHMA-S9914
TrizolInvitrogen15596-018
클로로포름시그마 알드리치366919
이소프리필알코올밀리포어109634
에탄올Duksan64-17-5
RevertAid First Strand cDNA 합성 키트Thermo ScientficK1622
Taq DNA 중합효소iNtRON BIOTECH25021
UltraPure 10x TBE BufferLife Technologies15581-044
로딩 스타Dyne BioA750
AgaroseSigma-Aldrich9012-36-6
1 kb (+) DNA 래더 마커효소학DM003
인간 지방 유래 줄기 세포 (ASC)카톨릭 마스터 세포
354352

참고문헌

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