이 보고서는 특히 포유 동물 세포에서 표적 유전자의 스 플라이 싱을 조절하는 신규 한 인공 접합 인자 (ASFs)를 설계하고 구성하는 생명 공학 방법을 설명한다. 이 방법은 RNA 대사의 다른 측면을 조작하는 다양한 인공 요소를 엔지니어에게 확장 할 수 있습니다.
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방법 논문
인공 요소 엔지니어 것은 특히 인간 세포에서의 스 플라이 싱을 조작 할
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이 논문에서
요약
초록
대부분의 진핵 생물 RNA의 프로세싱은 pre-mRNA target과 effector domain을 특이 적으로 결합시키는 RNA 인식 모듈을 포함하여 모듈 형 배열을 갖는 RNA Binding Protein (RBP)에 의해 매개된다. 이전에 우리는 인간 Pumilio 1의 PUF 도메인의 고유 한 RNA 결합 모드를 이용하여 RNA 신진 대사를 조작하기 위해 다양한 인공 RBP를 설계하는 프로그래밍 가능한 RNA 바인딩 스캐 폴드를 생성했습니다. 여기에는 세부적인 프로토콜이 구체적으로 표적 유전자의 선택적인 접합을 조절하도록 설계된 공학적 접합 인자 (ESF)를 구축하기 위해 기술되어있다. 이 프로토콜에는 특정 RNA 표적을위한 맞춤화 된 PUF 스캐 폴드를 설계하고 구성하는 방법, 디자이너 PUF 도메인과 이펙터 도메인을 융합시켜 ESF 발현 플라스미드를 구축하는 방법 및 ESF를 사용하여 표적 유전자의 접합을 조작하는 방법이 포함됩니다. 이 방법의 대표 결과에서, 우리는 또한 일반적인 assays를 설명했다스 플라이 싱 리포터를 사용한 ESF 활동, 배양 된 인간 세포에서의 ESF의 적용 및 스 플라이 싱 변화의 후속 효과. 이 보고서의 상세한 프로토콜을 따르면, 다른 유형의 Alternative Splicing (AS)의 조절을위한 ESF를 설계하고 생성 할 수 있으며, 접합 조절 및 다른 접합 이형의 기능을 연구하기위한 새로운 전략을 제공합니다. 또한, 설계된 PUF 영역과 다른 기능 영역을 융합시킴으로써 연구원은 RNA 공정의 다양한 단계를 조작하기 위해 특정 RNA를 표적으로하는 인공 인자를 설계 할 수있다.
서론
대부분의 인간 유전자는 스 플라이 싱 (AS)가 크게 게놈 (1, 2)의 부호화 복잡도를 증가 구별 활동 여러 이성체를 제조 겪는다. AS는 유전자의 기능을 조절하는 주요 메커니즘을 제공하며, 밀접 다른 셀룰러 및 발달 단계 3, 4에서 다양한 경로를 통해 조절된다. 접합 misregulation 인간의 질병 5, 6, 7, 8의 일반적인 원인이기 때문에, 접합 규제를 대상으로하는 것은 매력적인 치료 경로가되고있다.
주로 접합 촉진제 또는 대체 엑손 소음기로서 기능 mRNA의 사전에 규정 -Elements 시스 접합 (SRES)에 의해 제어되는 바와 같이, 스플 라이스 규제의 간략화 모델에 따라. 목SREs는 스 플라이 싱 반응을 촉진 또는 억제하는 다양한 트랜스 - 작용 ....
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프로토콜
사용자 정의와 PUF 비계 1. 건설 PCR 겹치는에 의해 특이성을 RNA가 결합
- 즉 각 위치 (12) (: PUF 인식 코드 프라이머 서열은 표 1을 참조하고, RNA는 그림 1 A 참조) 다른 RNA 뉴클레오티드를 인식 PUF 서열을 포함하는 PCR 프라이머를 디자인 시리즈. 각 PUF 반복, 디자인 네 가지 프라이머는 각각의 위치에 다른 기본을 인식합니다.
주 : 이들 프라이머 접합 (도 1 B)된다 PUF 단편을 생성하기 위해 PCR 반응의 네 라운드의 연속 사용한다. - 대체 스플 라이스 사이트 근처의 표적 유전자의 인식 사이트를 선택합니다.
참고 :이 사이트는 사용자가 결정 될 수 있으며, 그것은 일반적으로 10에서 선택 - NT를 대체 스플 라이스 사이트에서 (50). - 1 라운드 : 시퀀스를 코딩 생성4 PUF 반복, 유니버설 브릿지 프래그먼트 및 캡 프래그먼트가 필요합니다.
- 대상 사이트를 사용하여 사용자 정의 된 PUF의 각 반복에 대한 인식 코드....
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결과
이 보고서는 ESF 및 접합 기자의 설계 및 구성을위한 전체 프로토콜을 설명합니다. 또한 내인성 유전자의 AS 조작에있어 ESF의 추가 적용에 대해 설명한다. ESF 매개 스 플라이 싱 변경의 전형적인 결과를 설명하기 위해 이전 연구의 데이터를 예로 사용합니다. 상이한 기능성 영역을 갖는 ESF는 표적 카세트 엑손 ( 도 1D 및 E )의 포함을 촉진 또는 억제하는데 사용될 수있다. ESFs는 또한 리포터 시스템의 대체 5 '및 3'스플 라이스 사이트의 사용에 영향을 미칠 수 있습니다 ( 그림 1 F & G ).
내인성 유전자의.......
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토론
이 보고서는 구체적으로 표적 유전자의 대체 스 플라이 싱을 조작 할 수있는 인공 접합 요소의 설계 및 구성에 대한 상세한 설명을 제공한다. 이 방법은 사용자의 특이성을 갖는 RNA 결합 골격을 생성하기 위해 반복 PUF의 고유 모드 RNA 결합을 이용한다. 그것은 중 하나를 활성화하거나 접합을 억제하는 데 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜의 핵심 단계는 ESFs의 특이성을 정의 reprogramed PUF 도메인의 생성이다. PCR을 봉합 프로토콜 개발 및 PUF 지지체의 빠른 생성을 위해 최적화되었습니다. 1 : 성공을위한 열쇠는 1 서로 다른 중첩 템플릿의 비율을 조정하는 일. 정제되지 않은 제품은 마지막 라운드에서 프라이머 오염이있을 수 있으므로 각 라운드 후 PCR 제품의 정화도 중요하다. 다른 중요한 단계는 반 - 정량적 RT-PCR을 이용하여 접합 비율을 분석하는 것이다. 일반적으로, 너무 사람y 증폭주기는 PCR 반응을 포화시킬 수 있으므로 피해야합니다. 스 플라.......
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공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
이 작품은 NIH 보조금 R01-CA158283 및 NSFC에 의해 ZWYW에 31,400,726는 젊은 천 인재 프로그램 및 국립 자연 과학 중국의 재단 (보조금 31471235 및 81422038)에 의해 자금 지원 허용 지원되었다. XY 중국의 박사후 과학 재단 (2015M571612)에 의해 지원된다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| PCR 완충액이 있는 High-fidelity DNA 중합효소(Phusion High-Fidelity) | New England Biolabs | M0530L | |
| DNA 리가제(T4 DNA 리가제) | New England Biolabs | M0202L | |
| 리포솜 형질주입 시약(Lipofectamine 2000) | Invitrogen | 11668-019 | |
| 환원된 혈청 배지(Opti-MEM) | Gibco | 31985-062 | |
| RNA 추출 완충액(TRIzol Reagent) | 앰비온 | 15596018 | TRIzol 시약에는 화상을 유발할 수 있는 페놀이 포함되어 있습니다. |
| PBS 취급 시 장갑 착용 (1x) | Life Technologies | 10010-031 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase (RT) | Invitrogen | 18080044 | |
| Caspase-3 항체 | 세포 신호 전달 기술 | 9668 | |
| PARP 항체 | 세포 신호 기술 | 9542 | |
| Bcl-x 항체 | BD Bioscience | 610211 | |
| beta-actin 항체 | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| 알파-튜불린 항체 | Sigma-Aldrich | T5168 | |
| FLAG 항체 | Sigma-Aldrich | F4042 | |
| 니트로셀룰로오스 멤브레인 | Amersham-Pharmacia | RPN203D | |
| ECL Western Blotting detection 시약 | Invitrogen | WP20005 | |
| Cy5-dCTP | GE 헬스케어 | PA55021 | |
| 형광 활성화 세포 분류기 (FACS) | BD Bioscience | FACSCalibur | |
| 둘베코' 의 변형된 독수리' s Medium (DMEM) | GE Healthcare | SH30243.01 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 26140079 | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma | P4170 | |
| 소 혈청 알부민 (BSA) | Sigma | A7638-5G | |
| Triton-X100 | Promega | H5142 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P-4832 | 필터 살균 및 보관 4°C; C |
| Vector pWPXLd | Addgene | 12258 | |
| Vector pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Vector psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| DNase I (RNase-free) | New England Biolabs | M0303S | |
| Oligo(dT)18 Primer | Thermo Scientific | SO131 | |
| 항-마우스 2차 항체 (Anti-mouse IgG, HRP-linked 항체) | 세포신호전달 기술 | 7076S |
참고문헌
- Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456 (7221), 470-476 (2008).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcri....
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