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방법 논문

전혈로부터 인간 단핵구 유래 수지상 세포의 생성

20.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/54968

⸱

2016년 12월 24일

 ,  , 
1Division of Hygiene and Medical Microbiology, Medical University of Innsbruck

이 논문에서

요약

여기에서는 인간 항응고 혈액의 밀도 구배 원심분리 후 말초 혈액 단핵 세포에서 자기 비드 분리에 의해 단핵구를 분리하는 방법을 보여줍니다. 5일 동안 배양한 후 인간 단핵구는 미성숙 수지상 세포로 분화되고 비임상 환경에서 실험 절차를 수행할 준비가 됩니다.

초록

수지상 세포(DC)는 세포 표면에 발현되는 다양한 패턴 인식 수용체(PRR)를 통해 바이러스, 박테리아 및 곰팡이와 같은 다양한 병원체의 외부 구조를 인식하여 면역을 활성화하고 조절합니다.

DC의 주요 기능은 MHC I 및 MHC II 분자를 통해 순진한 T 림프구에 항원을 제시하여 림프절에서 적응 면역을 유도하는 것입니다. 따라서 DC는 감염 부위에서 병원체를 인식한 후 주변부에서 림프절로 이동해야 합니다. 체외 실험 또는 DC 백신 접종 전략의 경우 단핵구 유래 DC가 일상적으로 사용됩니다. 이 세포는 생리학, 형태 및 기능에서 기존 골수성 수지상 세포와 유사합니다. 이들은 건강한 공여자로부터 분리된 단핵구의 인터루킨 4(IL-4) 및 과립구-대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF) 자극에 의해 생성됩니다. 여기에서는 밀도 구배 원심분리에 의한 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 농축 후 항응고된 인간 혈액에서 단핵구를 분리하고 자극하는 방법을 보여줍니다. 인간 단핵구는 미성숙 DC로 분화되며 배양 5일 후 비임상 환경에서 실험 절차를 수행할 준비가 됩니다.

서론

수지상 세포 (DCS)는 우리의 면역 시스템의 중요한 전문 항원 제시 세포이다. 미성숙 수지상 세포 (이 iDCs)는 피부 또는 점막 조직에 상주하며 침입 병원체와 상호 작용하는 제 면역 세포 중에서 따라서이다. 그들은 병원체 검출 이후에 T-와 B 세포 반응을 활성화 할 수 있기 때문에 수지상 세포는 선천성 및 적응성 면역 체계 1 사이의 다리를 나타냅니다. 또한, 그들은 때문에 이러한 IL-1β, IL-6, IL-12 사이토 카인의 다량의 분비 염증성 면역 반응에 기여한다. 수지상 세포는 NK 세포의 활성화 및 주 화성에 의한 감염 부위에 다른 면역 세포를 끈다.

미성숙 수지상 세포는 수지상 세포 (이 iDCs) 및 형태와 기능에 기초하여 성숙 수지상 세포 (MDCS) 2로 나누어 질 수있다. 많은 패턴 인식 수용체의 하나 (예를 들어, 수신자 같은 수용체, C 형에 의한 외국 항원의 인식 후렉틴 또는 다량 세포 표면에 발현) 수용체를 보완이 iDCs는 큰 변화를 겪는 성숙한 시작한다. 항원 제시에 필수적인 분자가 3 상향 조정되는 반면이 성숙 과정에서, 항원 캡처 수용체는, 아래로 조절된다. 성숙한 DC가 주요 조직 적합성 복합체 I 및 II (MHC I과 II)를 상향 조절, T 림프구의 항원 제시 및 활성화에 필수적인 CD80 및 CD86와 같은 공동 자극 분자. 또한, 세포 표면의 케모카인 수용체 CCR7의 발현은 림프절 말초 조직에서 수지상 세포의 이동을 가능하게하는 유도된다. 마이그레이션은 림프절 4-6로 케모카인 리간드 19 (CCL19 / MIP-3B)과 케모카인 리간드 21 (CCL21 / SLC) 그라데이션을 따라 수지상의 "구름"에 의해 촉진된다.

마이그레이션 후, MDC에 따라서 INI, CD4 +와 CD8 + T 세포를 순진하기 위해 처리 된 항원을 제시침입 병원균 7에 대한 적응 면역 반응을 tiating. 림프절에서 T 세포와의 상호 작용이도 8 바이러스의 확산과 관련된다. 다른 시험관 연구는 DC가 효율적으로 캡처하고 활발한 감염 9-12이 전송 결과 T 세포 것을 HIV를 전송하는 것으로 나타났습니다. 이 실험은 림프절에 주변에서 셔틀로 그 생체 내 HIV의 공격의 수지상를 강조 표시합니다. 항원 제시 중에 DCS는 이펙터 T 헬퍼 세포의 분화를 형성하고, 따라서, 미생물에 대한 전체 면역 반응의 결과가이 상호 작용에서 매우 중요한 판단 인터루킨 분비. 별도로 1 형 (받은 Th1)과 제 2 형에서 (TH2) 이펙터 T 세포, CD4 + T 헬퍼 세포 (예를 들어, 유형 17 (Th17) 및 유형 22 (Th22) T 세포)에 설명 된 다른 부분 집합, 그들의 유도 기능은 충분히 조사하고있다. 수지상은 또한에 관여T 조절 세포 (Tregs) (13, 14)의 생성. 이 세포들은 면역 억제하고 중지하거나 또는 유도 이펙터 T 세포의 증식을 하향 조절함으로써 면역 관용 개발 중요하다 할 수있다.

인간 기존의 DC (CDCS)는 골수 기원 세포의 여러 하위 집합을 포함한다 (즉, 랑게르한스 세포 (LCS)과 피부 및 간질 DC가) 또는 림프 기원 (즉, 형질 DC가 (올라가고)). 시험 관내 실험 또는 DC 예방 접종 전략의 경우, 단핵구 유래 수지상 정기적으로 피부 수지상의 모델로 사용된다. 이 세포들은 기존의 골수 수지상 세포 생리학, 형태 및 기능의 유사성을 보여줍니다. 이들은 건강한 공여자로부터 단리 12,15-18 단핵구에 인터루킨 4 (IL-4), 과립구 대 식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)의 첨가에 의해 생성된다. 수지상 세포는 또한 직접적으로 피부 또는 점막 생검으로부터 분리, 또는 B 수 가능E는 CD34 + 전 자궁 획득 탯줄 혈액에서 분리 한 조혈 전구 세포에서 개발 하였다. 여기서는 단핵구 절연 및 밀도 구배 원심 분리에 의해 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 농축 한 후 항 - 인간 혈액 응고 촉진하는 방법을 보여준다. 5 일간 배양 한 후, 특정 조건 하에서 인간 단핵 세포는이 iDCs로 분화하고 비 임상 설정에서 실험 절차에 대한 준비가되어 있습니다.

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프로토콜

윤리 문 : 동의 글은 수혈 및 면역 부서, 오스트리아 인스 브루 크의 중앙 연구소 참여하는 모든 혈액 기증자로부터 얻은 것입니다. 과학적 목적을 위해 익명 남은 표본의 사용은 인스 브루 크의 의과 대학의 윤리위원회에 의해 승인되었다.

말초 혈액 단핵 세포의 1. 농축 (PBMC를)

  1. 원심 분리하여 PBMC를의 농도.
    1. 수신 된 혈액의 양에 따라 멸균 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 혈액 팩 분할 혈액을 연다.
    2. 필요한 경우, 멸균 둘 베코 인산염 완충 식염수 (D-PBS)와 각 튜브에 대한 50 ㎖로 볼륨을 조절합니다.
    3. 원심 분리기에 튜브를 삽입하고, 브레이크없이, 실온 (RT)에서 15 분 동안 400 × g으로 그들을 회전.
    4. boundar두고 멸균 10 ㎖ 혈청 피펫을 사용하여 혈장과 혈소판을 포함하는 상층을 그린다Y 층 흐트러.
      주 : FCS 대신의자가 혈장이 배지를 보충하기 위해 사용되는 경우, 플라즈마가 수집되어야하며,이 단계에서 열이 불 활성화.
    5. 이 50 ㎖ 원심 분리기 튜브에서 단핵 세포 (경계층)를 수집하고 멸균 10 ㎖의 혈청 학적 피펫을 사용하여 하나의 멸균 50 ML 튜브로 전송할 수 있습니다.
    6. 멸균 D-PBS를 사용하여 각 튜브 50ml로 볼륨을 조절합니다.
    7. 원심 분리기에 튜브를 놓고 브레이크없이 실온에서 15 분 동안 400 XG에 그들을 스핀.
    8. 교란 경계층을 떠나 멸균 10 ㎖ 혈청 피펫을 사용하여 혈장과 혈소판을 포함하는 상층을 그린다.
    9. 50 ㎖의 원심 분리기 튜브에서 단핵 세포 (경계층)를 수집하고 멸균 10 ㎖의 혈청 학적 피펫을 사용하여 두 멸균 50 ㎖ 수집 튜브로 전송할 수 있습니다.
    10. 멸균 D-PBS 각 튜브 50ml로 볼륨을 조절합니다.
  2. 분리밀도 구배 원심 분리 한 PBMC의 (도 1).
    1. 각 튜브에 밀도 구배 매질 네 50 ㎖ 튜브에 피펫 15ml의 준비.
    2. 포집 관 (단계 1.1.10)에서 풀링 된 세포 / 혈액 25 mL를 취하여 조심스럽게 밀도 구배 매체를 오버레이.
    3. 원심 분리기에 튜브를 삽입하고, 브레이크없이 RT에서 30 분 동안 700 × g으로 그들을 회전.
  3. 수집 및 PBMC를 정화.
    1. 멸균 10 ㎖ 혈청 피펫을 사용하여 혈장, 혈소판, 방해받지 PBMC 층을 떠나는 함유 상부층을 그린다.
    2. 모든 튜브에서 PBMC의 계면를 수집하고 멸균 25 ㎖의 혈청 학적 피펫을 사용하여 두 멸균 50 ㎖ 튜브에 세포를 풀.
    3. 멸균 D-PBS 각 튜브 50ml로 볼륨을 조절합니다. 원심 분리기에 튜브를 놓고 브레이크와 4 ° C에서 15 분 동안 400 XG에 그들을 스핀.
    4. 뜨는을 대기음하고 다시 중단멸균 D-PBS에있는 세포. 두 튜브에서 세포를 수영장과 멸균 D-PBS로 50 ㎖로 볼륨을 조절합니다.
    5. 원심 분리기에 튜브를 놓고 브레이크 4 ° C에서 10 분 동안 400 XG에 그들을 스핀.
    6. 뜨는을 기음과 멸균 D-PBS의 세포를 다시 일시 중지합니다. D-PBS 450 μl를 포함하는 1.5 ML 튜브에 멸균 D-PBS 50 ml를 피펫 50 μL에 볼륨을 조정합니다.
    7. 소용돌이 1.5 ML 튜브 적극적와 노이 바 우어 챔버 또는 다른 세포 계수 장비의 셀을 계산합니다.
    8. 원심 분리기에 50 ㎖ 튜브를 놓고 브레이크 4 ° C에서 10 분 동안 400 XG에 그들을 스핀.

반대로 인간 CD14 자성 입자에 의해 단핵구 2. 분리

  1. 자성 입자와 PBMC를의 레이블.
    1. 차단 완충액을 사용하여 8 × 107 세포 / ml로 PBMC 농도를 조정한다.
    2. 와동 항 인간 CD14 자성 입자 thoroughlY마다 1 × 10 7 PBMC를 위해 입자의 50 μl를 추가합니다.
    3. 철저히 셀 입자 현탁액을 혼합하고 실온에서 30 분 동안이를 부화.
  2. 양극과 음극 분수의 분리.
    1. 절연 버퍼를 사용하여 12 ml의에 볼륨 업을 조정합니다.
    2. 각 튜브에 세포 입자 현탁액의 여섯 멸균 둥근 바닥 튜브 및 피펫 2 ml의를 준비합니다.
    3. 즉시 자석에 튜브를 배치합니다. RT에서 10 분 동안이를 부화.
    4. 자석에 튜브를 유지하고 조심스럽게 상층 액을 그립니다. 상층 액은 부정적인 부분이 포함되어 있습니다.
    5. 자석에서 튜브를 제거하고 분리 버퍼 2 ㎖를 추가합니다.
    6. 부드럽게 피펫 팅 아래로 세포를 다시 일시 중지합니다.
    7. 다시 자석에 튜브를 놓습니다. RT에서 5 분 동안 인큐베이션.
    8. 자석에 튜브를 유지하고 조심스럽게 상층 액을 그립니다. 상층 액은 부정적인 부분이 포함되어 있습니다.
    9. 자석에서 튜브를 제거하고 각 튜브를 분리 버퍼 2 ㎖를 추가합니다. 부드럽게 피펫 팅 아래로 세포를 다시 일시 중지합니다.
    10. 멸균 50 ML 튜브에 긍정적 인 부분을 전송하고 멸균 D-PBS를 사용하여 50ml로 볼륨을 조절합니다.

IL-4와 GM-CSF와 격리 된 단핵구의 3 자극

  1. 원심 분리기에 튜브를 놓고 브레이크 4 ° C에서 10 분 동안 400 XG에 그것을 회전.
  2. 대기음 뜨는 D-PBS 50 ㎖로 세포를 재 - 보류.
  3. D-PBS 450 μl를 함유하는 1.5 ㎖의 튜브에 피펫 50 μL. 소용돌이 1.5 ML 튜브 적극적와 노이 바 우어 챔버 또는 다른 세포 계수 장비의 셀을 계산합니다.
  4. 원심 분리기에 50 ML 튜브를 놓고 브레이크 4 ° C에서 10 분 동안 400 XG에 그것을 회전.
    주 : 말초 혈액 림프구 (PBL들)를 함유하는 네가티브 분획, 또한 필요하면 세정을 수행하고 카운팅을 t 유사한 단계긍정적 인 부분의 호스 (3.1-3.5 단계).
  5. 미리 예열 문화 매체 (RPMI 1640 10 % 열 - 불 활성화 FBS와 1 % L - 글루타민 용액을 보충 매체) 및 피펫 3 ㎖ / 잘 6 웰 플레이트에 1 × 106 / ㎖의 세포 농도를 조정합니다.
    참고 : 열 불 활성화자가 플라즈마를 사용하는 경우, 실험 셋업에 따라, 1-5%자가 플라즈마로 10 % FCS를 교체합니다.
  6. 배양액으로 직접 피펫 팅하여 사이토 카인의 재조합 인간 IL-4 (250 U / ml) 및 재조합 인간 GM-CSF (1,000 U / ㎖)으로 단핵구를 자극한다. 37 ° C에서 품어 5 % CO 2.
  7. 배지에 직접 사이토킨 피펫 팅하여 48 시간 후 IL-4 (250 U / ml) 및 GM-CSF (1,000 U / ㎖)와 함께 세포를 재 자극한다.
    주 : 배지의 pH를 지표로 나타낸 산성화의 흔적이 있다면, 예열 배양액 배지의 절반을 교체한다.
  8. 수확을 위해 하루 5 수지상 세포를 미 숙다운 스트림 6 웰 플레이트에서 그리고 50 ml의 원심 분리기 튜브에 최대 배지를 피펫 팅 후 몇 번 아래로 배양 된 세포를 피펫 팅으로 실험.
  9. 세포를 세어 CD11b를, 중 CD11c에 대한 항 인간 항체와 격리 된 단핵 세포의 샘플을 얼룩과 함께 세포 생존 염료와 DC-SIGN / CD209. 표면 오염시 항체의 비특이적 결합을 방지하기 위해, 시약 또는 소 혈청 알부민 (BSA) 버퍼를 차단 Fc 수용체의 사용이 추천된다.
  10. 생성이 iDCs의 순도 및 생존력을 평가하기 위해 유세포 수행하여, 제조자의 프로토콜에 따라, 세포 생존 성 염료를 사용하여 샘플을 분석한다.

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결과

수 크로스 쿠션을 사용하는 항 응고 혈의 원심 분리 후, 말초 혈 단핵 세포 (PBMC)를 밀도 구배 배지 (도 1)의 상단에 계면에서 농축된다. PBMC를 전원이 그려진 후, FACS 분석은 혈통 마커를 사용하여 PBMC를 (예를 들어, CD3 T 림프구를 들어, CD14 단핵구, 그리고 CD19 B 림프구에 대한) 내에서 서로 다른 세포 집단의 특성을 수행한다. 도 2a는 수집 및 밀도 구배 원심 분리 후, PBMC를 염색 대표 FACS 분석의 결과를 나타낸다. 게이트 된 인구 (그림 2A, 상단 플롯) 중, 우리는 43.62 %가 T 림프구했다있는 4.03 %의 B 림프구, 28.20 %의 단핵구 및 67.62 % 다른 세포 (그림 2A, 중간 플롯), (그림 2A를 감지, 낮은 음모 ).

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토론

이 프로토콜은 자성 나노 입자 - 기반 분석법을 이용하여 항 - 응고 혈 단핵 세포에서 인간의 분리를 통하여 단핵 세포 - 유래 수지상 세포 (MDDCs)의 생성을 설명한다. 이 프로토콜에서, 원심 분리 단계는 PBMC의 분획의 농축에 이르는 세포 분리 과정 상류 행한다. 세포를 원심 분리 중에 손실되지만, 밀도 구배 배지 200-300 ml의 요구 밀도 구배 매체의 전혈 팩의 내용을 오버레이 때문에 비용 효율적으로 간주 될 수 없다. 또한, 적극적으로, 분리 과정 동안 항 - 인간 CD14 자성 입자의 부착에 영향을주는 세제 세포 집단에서 원심 분리 한 PBMC에 의한 결과의 농축. 상기 다양한 DC 서브 세트 또는 대 식세포로 체외 분화에 사용될 수있는 가능한 단핵구 집단에서 단핵구 결과의 자기 나노 입자 분리.

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 원고를 작성하는 데 귀중한 도움과 지원을 주신 위생 및 의료 미생물학 부서의 Karolin Thurnes 박사와 중앙 수혈 및 면역학 부서의 Annelies Mühlbacher 박사와 Paul Hörtnagl 박사에게 감사드립니다. 이 연구를 지원해 주신 오스트리아 과학기금(Austrian Science Fund)에 감사드립니다(P24598 to DW, P25389 to WP).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
APC 마우스 Anti-Human CD19 클론 HIB19BD Biosciences555415
APC Mouse Anti-Human CD83 클론 HB15eBD Biosciences551073
BD Imag Anti-Human CD14 자성 입자BD Biosciences557769
BD ImagnetBD Biosciences552311
BSA (알부민 분획 V)Carl RothEG-Nr 2923225
Costar 6 Well Clear TC 처리 다중 웰 플레이트Costar3506
밀도 구배 매체: Ficoll-Paque PremiumGE Healthcare Bio-Sciences17-5442-03
Dulbecco' s 인산염 완충 식염수 (D-PBS)Sigma-AldrichD8537
Falcon 10  ml 혈청학적 피펫코닝357551
팔콘 25  ml 혈청학적 피펫코닝357525
팔콘 50  ml High Clarity PP 원심분리기 튜브Corning352070
Falcon 둥근 바닥 튜브Corning352054
FITC 마우스 Anti-Human CD3 클론 HIT3aBD Biosciences555339
Ghost Dye Violet 510 (Cell Viability Reagent)Tonbo biosciences13-0870
GM-CSFMACS Miltenyi Biotec130-093-862
열 비활성화 FBS (소 태아 혈청), EU 승인 원산지 (남아메리카)Gibco10500-064
Hettich Rotanta 460RHettich---
IL-4 CCPromoKineC-61401
절연 완충액 : BD IMag 완충액 (10x)BD Biosciences552362
L- 글루타민 용액Sigma-AldrichG7513
마이크로 원심분리기 튜브, 1.5ml, SuperSpinVWR211-0015
PE 마우스 Anti-Human CD14 클론 M5E2BD Biosciences555398
PE 마우스 Anti-Human CD209 클론 DCN46BD Biosciences551265
RPMI-1640 매체Sigma-AldrichR0883
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0Invitrogen15575020

참고문헌

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  16. Posch, W., et al. Antibodies attenuate the capacity of dendritic cells to stimulate HIV-specific cytotoxic T lymphocytes. J Allergy Clin Immunol. 130, e1362 1368-1374 (2012).
  17. Posch, W., et al. Complement-Opsonized HIV-1 Overcomes Restriction in Dendritic Cells. PLoS Pathog. 11, e1005005(2015).
  18. Wilflingseder, D., et al. Immediate T-Helper 17 Polarization Upon Triggering CD11b/c on HIV-Exposed Dendritic Cells. J Infect Dis. 212, 44-56 (2015).
  19. Grassi, F., et al. Monocyte-derived dendritic cells have a phenotype comparable to that of dermal dendritic cells and display ultrastructural granules distinct from Birbeck granules. J Leukoc Biol. 64, 484-493 (1998).

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단핵구 분리수지상 세포 분화CD14 자성 비드밀도 구배 원심분리PBMC 농축유세포 분석인터루킨 4GM-CSF 자극미성숙 수지상 세포항원 제시
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