Method Article

치수의의 평가에 대한 직접 펄프 캐핑 모델의 개발 상처 치유와 마우스의 수복 상아질 형성

DOI:

10.3791/54973

⸱

January 12th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Shapiro Family Laboratory of Viral Oncology and Aging Research, The UCLA School of Dentistry, 2UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center, 3David Geffen School of Medicine at UCLA

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 치수의 상처 치유 및 생체 수복 상아질 형성 평가 마우스 치아에 직접 캐핑 펄프를 행하는 단계적인 방법을 설명한다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

치과 치수는 법랑질과 상아질로 완전히 보호되는 치아의 중요한 기관입니다. 충치성 또는 의인성 부상으로 인해 치수가 노출된 경우, 치수의 상처 치유를 촉진하기 위해 생체 적합성 물질로 덮는 경우가 많습니다. 궁극적인 목표는 "생물학적 밀봉"으로 기능하고 근본적인 치수조직을 보호하는 물리적 장벽인 회복 상아질을 재생하는 것입니다. 이 직접 치수 캡핑 절차는 치과에서 오랫동안 사용되어 왔지만, 치수 상처 치유 및 회복 상아질 형성의 기본 분자 메커니즘은 여전히 잘 이해되지 않았습니다. 회복성 상아질을 유도하기 위해 펄프 캡핑은 대형 동물에서 실험적으로 수행되었지만 생쥐에서는 그렇지 않았는데, 아마도 작은 크기와 그에 따른 기술적 어려움 때문일 것입니다. 여기에서는 Class-I-like cavity의 준비, pulp-capping 재료의 배치 및 치과 복합재를 사용한 수복 절차를 포함하여 마우스에서 펄프 캡핑 절차를 수행하는 상세한 단계별 방법을 제시합니다. 당사의 펄프 캡핑 마우스 모델은 연구 커뮤니티에서 널리 사용 가능한 형질전환 또는 녹아웃 마우스를 사용할 수 있도록 함으로써 생체 내 회복 상아질의 맥락에서 치수 상처 치유의 기본 분자 메커니즘을 조사하는 데 중요한 역할을 할 것입니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

치아우식증은 가장 흔한 구강 질환 중 하나이며 거의 모든 개인에서 치열에 대한 외과적 개입의 주요 원인입니다1,2. 외과적 개입과 치아 수복의 예후는 적절한 치수 반응과 성공적인 상처 치유에 크게 좌우됩니다. 실제로, 법랑질과 상아질 깊숙이 침투하는 치아 우식은 종종 수산화칼슘(Ca(OH)2) 또는 미네랄 삼산화물 응집체(MTA)를 포함한 수경 칼슘-규산염 시멘트(HCSC)와 같은 치과 재료로 "덮인" 기본 치수 조직의 노출로 이어집니다. 이러한 치수 캡핑 절차의 궁극적인 목표는 근본적인 치수 조직을 보호하고 치아의 기대 수명과 전반적인 구강 건강을 증가시키는 "생물학적 밀봉" 역할을 하는 물리적 장벽인 회복 상아질을 재생하여 치수 상처 치유를 촉진하는 것입니다. 그러나 치수상 상처 치유 및 회복 상아질 형성의 기본 메커니즘은 완전히 이해되지 않았습니다.

생체 내에서 치수상 상처 치유 및 회복 상아질 형성의 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해 이전에는 원숭이, 개, 돼지3-5를 포함한 여러 동물이 사용되었습니다. 그 중에서도 랫드는 다른 동물에 비해 상대적으로 크기가 작기 때문에 자주 사용되지만, 이빨은 기술적인 어려움 없이 직접 펄프 캡핑을 수행할 수 있을 만큼 충분히 크다6-10. 이러한 동물 모델은 치수 반응 및 회복 상아질 형성을 조사하기 위한 인간 연구의 이상적인 대안입니다. 그러나 이들의 활용은 세포 수준에서의 관찰 연구로 제한되며, 분자 수준에서 회복 상아질을 형성하는 동안 기계론적 통찰력을 거의 제공하지 않습니다.

최근 유전 공학의 기술적 발전은 생체 내에서 인간 질병의 분자 메커니즘을 연구하는 데 중요한 역할을 하는 귀중하고 필수적인 연구 도구(과발현 또는 삭제된 유전자를 가진 쥐)를 제공했습니다. 세포 특이적 방식으로 전략적으로 유도할 수 있는 형질전환 또는 녹아웃 마우스의 다양한 균주의 수는 과학계에서 지속적으로 증가하고 있습니다. 따라서 이 쥐에서 치수상 상처 치유 및 회복 상아질 재생을 조사하는 것은 분자 수준에서 이러한 과정에 대한 이해를 촉진하는 데 크게 도움이 될 것입니다. 그러나 마우스 이빨에 펄프 캡핑 절차를 수행하는 것은 소형 크기로 인해 기술적으로 어렵기 때문에 마우스의 사용이 크게 감소합니다. 여기에서는 생체 내 치수 상처 치유 및 회복 상아질 형성을 평가하기 위해 마우스에서 직접 펄프 캡핑을 수행하는 재현 가능한 방법을 제시합니다.

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Protocol

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마우스는 잭슨 연구소에서 구입하여 실험 동물 의학의 UCLA과 (DLAM)에서 병원균이없는 동식물 사육장에 보관 하였다. 실험은 교육감의 동물 연구위원회 (ARC 번호 2016-037)에서 승인 된 기관의 지침에 따라 수행 하였다.

1. 마우스 마취

  1. 8 주 된 암컷 C57 / BL6 마우스를 사용하여 (n = 3)를 나타낸다.
  2. 케타민 (마우스 체중의 80 ~ 120 ㎎ / ㎏) / 자일 라진 (5 밀리그램 / 마우스 체중 kg) 솔루션을 사용하여 마우스를 마취 및 10 ㎖ / kg의 용량으로 복강 내 (IP) 투여.
  3. 케타민 준비 (80-120 ㎎ / ㎏) / 자일 라진 (5 ㎎ / ㎏) 용액 및 10 ㎖ / kg의 용량으로 복강 내 (IP)을 투여.
  4. 쥐가 완전히 발가락 핀치를 수행하여 마취되어 있는지 확인합니다.

2. 펄프 캐핑 절차

  1. 마우스의 입에서 입 홀더를 배치합니다.
  2. 그는 그 같은 테이블에 입 홀더를 고정광고가 위쪽으로 직면하고있다.
  3. 첫 번째 상악 대구치가 완전히 볼 수 있도록 입의 상단에있는 현미경 (10X)를 놓습니다.
  4. 펄프 투명 상아질 통해 보일 때까지 20 rpm으로 고속 핸드 피스의 ¼ 라운드 버를 사용하여, 중간 치아의 에나멜 부분을 제거한다. 버와 펄프를 노출시키지 마십시오.
  5. A # 15 근관 K-파일 (150 μm의 직경)를 사용하여 상아질을 통해 천공 및 펄프를 노출합니다.
    참고 : 상아질 파편이 펄프로 밀어되지 않도록 특별한주의가 요구됩니다. 이 분기마다 K 파일을 회전하고 출력이 K-파일 당겨 회피 할 수있다.
  6. 제조업체의 지침에 따라 멸균 H 2 O와 MTA를 섞는다. 제공 및 탐색기의 끝 노출 된 펄프에 MTA에 배치합니다. 부드러운 감청에 의해 노출 된 펄프로 MTA를 포장하는 종이 포인트 (미세)의 뒷면을 사용합니다. 용지 점의 두꺼운 측이 평평하기 때문에 허용노출 된 펄프에 MTA의 적절한 응축.
  7. 단지 치아를 커버하는 35 % 인산 에칭액을 배치하여 15 초 동안 에칭 치아. 이 잇몸 조직을 자극 할 수 있으므로, 에칭의 배치를 제한하기 위해 특별한주의하십시오.
    주 : 에칭액 주사기오고 치과 접착제 치아에 마이크로 기계식 결합을 매개하는 데에 흐를 수 있도록 치아 표면을 거칠게하는 데 사용된다. 그들은 점성 때문에 독립적 치아에 직접 적은 양을 적용함으로써 할 수있다.
  8. 에칭 제를 제거하는 음의 압력을 흡입을 사용합니다. 가볍게 에칭의 잔류 물을 제거하기 위해 H 2 O에 배어있는 면봉을 사용합니다. 에칭이 완전히 치아에서 제거 될 때까지이 단계를 반복합니다.
  9. 압축 공기 살포기를 사용하여 부드럽게 치아를 건조.
  10. 용지 포인트의 뒷면을 사용하여 치과 용 접착제를 적용한다.
  11. 3 초 동안 압축 공기를 이용하여 상기 접착제 층이 얇게.
  12. 기음URE 경화 백라이트 유닛을 사용하여 20 초 동안 치과 용 접착제.
  13. MTA와 모자를 씌웠다 치아에 소량의 유동성 복합 놓습니다. 치아 홈에 복합 흐름에 탐색기의 팁을 사용합니다.
  14. 이를 중합 광 경화 유닛을 이용하여 30 초 동안 복합 치료. 복합 완전히 경화 하드 탐색기를 사용하고 있는지 확인합니다.

3. 수술 후 케어

  1. 즉시 펄프 캐핑 시술 후 카프로 펜 (5 ㎎ / ㎏) 피하 (SC)를 관리 할 수 ​​있습니다.
  2. 그들이 일어나 전에 따뜻한 동물을 유지하기 위해 낮은 전력으로 가열 패드에서 마우스를 놓습니다.
  3. 주택의 동식물 사육장에 마우스를 돌려줍니다.

4. 조직 조달

  1. 오 후 - 육주, 이소 플루 란과 완벽한 마취 상태에서 자궁 전위에 의해 쥐를 안락사.
  2. 조심스럽게 두개골의 바닥에서 상악를 제거하고 50 mL의 관에 넣어. entir 수정밤새 39 ° C에서 펄프 캡핑 치아와 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드, pH가 7.4 반대측 캡핑 치아를 모두 포함하고, 그 다음 70 % 에탄올 용액에 보관 전자 상악.
    참고 : 파라 포름 알데히드는 독성 및 발암 성이다. 표준 운영 절차 (SOP)에 설명 된대로 적절한 사용 파라 포름 알데히드를 모니터링해야한다.
  3. μCT 검사를 사용하여 마우스 상악를 스캔합니다. 70 % 에탄올에 적신 거즈로 샘플을 포장하고, 15 mL의 세포 배양 튜브에 배치, 스캔하는 동안 상악을 확보합니다.

5. μCT 검색

  1. μCT 검사를위한 샘플을 준비합니다. 간단히, 70 % 에탄올에 적신 거즈로 샘플을 포장 및 일반 15 mL의 세포 배양 원뿔 튜브를 고정합니다. 제조업체의 지침에 설명 된 바와 같이, μCT 스캔 무대에 튜브를 장착합니다.
  2. 145 μA의 전류 55 KVP의 전압, 및 (2)의 노광 시간으로 X 선 소스를 설정00 밀리.
  3. 20 μm의 해상도와 0.5 mm 알루미늄 필터로 μCT 스캐너로 이미지 수집을 수행합니다.
  4. 이미지를 재구성하고 (11)를 시각화.
  5. μCT 검사가 완료되면 2 주 동안 5 % EDTA와 PBS에서 4 %의 자당 (PH 7.4)와 탈회를 시작합니다.

6. 조직 가공 및 염색

  1. 파라핀의 탈회 조직을 포함. 삽입하기 전에, 바로 첫 번째 어금니에 전방 시상 절단하여 상악 트림. 매립하면서 제 몰의 종단면은 절단면이되도록 하향으로이 표면의 위치.
  2. 마이크로톰을 사용하여, 5 μm의 두께의 슬라이드를 준비합니다. 펄프 캐핑 영역은 일반적으로 표식으로서 사용될 수 distopalatal (DP) 루트와 일치한다. 광학 현미경 하에서 조직 학적 검사 및 μCT 이미지를 비교하여 관심의 정확한 영역을 결정합니다.
  3. H & E 염색, depara에 대한ffinize 자일 렌 (2 배)와 직렬로 희석 한 에탄올 (100 % EtOH로 배, 95 % EtOH로 배, 70 % EtOH로 1 배)로 슬라이드를 재수.
  4. 수돗물을 실행에 슬라이드를 씻어.
  5. 2.5 분 헤 마톡 실린 용액으로 얼룩 및 수돗물로 씻어냅니다.
  6. 1 분 동안 95 % 에탄올에서 슬라이드 딥.
  7. 1 분 에오신 용액으로 얼룩 및 수돗물로 씻어냅니다.
  8. 희석 한 에탄올 (70 % EtOH로 1 배, 95 % EtOH로 2 배, 및 100 % EtOH로 3X) 및 크실렌 (3x)로 탈수.
  9. 솔루션을 장착와 슬라이드를 탑재합니다.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기서는 마우스 치아 캐핑 펄프 수행 단계별 과정을 나타내었다. 마우스에서 캐핑 펄프의 중요한 측면 중 하나는 적절한 장치를 가지고있다. 이와 관련하여, 10 배의 전력 배율 현미경을 갖는 것이 필수적 (도 1a)이다. 치아의 클래스 I-같은 준비를 만들려면, 우리는 20 만 rpm으로 (그림 1B)에서 전기 고속 핸드 피스의 ¼ 라운드 버를 사용했다. 대안 적으로, 압축 공기를 사용하는 것을 포함하여 다른 엔진은, 치아를 제조 할 수있다.

그림 2A-2E에서, 펄프 캡을 수행하기위한 대표적인 단계가 표시됩니다. 클래스-I-같은 준비 (그림 2B)를 수행 하였다. 물 스프레이 절차를 수행하는 동안 쥐를 익사 수 있기 때문에, 그것의 사용은 ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

현재 치과 펄프 줄기 세포 (DPSCs) (13)의 치성 분화에 치과 재료, 비계, 또는 성장 인자의 생체 내 효과를 검증 할 수 여러 가지 실험 모델이있다. 이 모델은 신장 캡슐 기관에 DPSCs의 자궁외자가 이식, 또는 비계 14, 15와 면역 저하 마우스로 DPSCs의 피하 이식을 포함한다. 그러나, 이들 방법은 DPSCs 그들의 원성 효과는 동소 펄프 환경에서 수행되지 않도록 제한된다. 한편, 치아의 펄프 펄프 캡핑 절차에 동소 이식 큰 동물 (16, 17)에 사용된다. 이러한 모델은 동소 환경 원성 잠재력을 평가하는데 유용한 있지만, 이들 모델의 사용은 펄프 상처 치유 및 수복 상아질 형성 제한된 기계적 통찰력을 제공하는 자연에서 주로 관찰된다.

본 논문에서는 생쥐에서 펄프 - 캡핑을 수행 할 수있는 구체적인 방법을 제시한다. 이 단계별 절차는 스캔 μCT와 분석, 펄프 캐핑 물질을 배...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 NIDCR / NIH에서 R01DE023348 (RHK)와 캘리포니아 대학 로스 앤젤레스 부문의 학술 상원의 연구에 이사회에서 학부 연구 그랜트 (RHK)에 의해 지원되었다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BM-LED 스테레오 현미경MEIJI 테크노현미경 
옵티마 MCX-LED Bien Air Dental1700588-001일렉트릭 모터 엔진
이소 플루란Henry schein 동물 건강NDC 11695-0500-2
1/4 라운드 버Brasseler001092T0
Endodontic K-fileRoydent98947
ProRoot MTADentsplyPROROOT5WMTA
종이 포인트Henry schein100-3941
울트라 에치Ultradent 제품 Inc.인산 에칭액
OptiBond SoloPlusKerr29669접착제
Coltolux LEDColtene/whaledent Inc.C7970100115경화광 유닛
특성화 틴트BiscoT-14012유동 복합재
SkyscanBreuker1275uCT 스캐너
MicromThermoHM355SMicrotome
Hematoxyline-1Thermo Scientific7221
Eosin-YThermo Scientific7111
Cytoseal 60Thermo Scientific8310-16마운팅 솔루션

References

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