방법 논문

3D 전체 심장 심근 조직 분석

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⸱

DOI:

10.3791/54974

⸱

2017년 4월 12일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Division Heart and Lungs, University Medical Center Utrecht, 2MIRA Institute, University Twente

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 MRI와 전체 심장 심근 조직의 3 차원 비교를위한 새로운 방법을 설명합니다. 이는 심근 경색의 만성 돼지 모델의 경색 경계 영역에서 심근 내 주입의 정확한 평가를 위해 설계되었습니다.

초록

심장 재생 치료 보호 및 허혈성 심장 질환 환자에 부상 심장을 복구하는 것을 목표로하고 있습니다. 줄기 세포 또는 경색 경계 존 (IBZ)에 angio- 또는 혈관 생성을 향상 다른 생물학적 물질을 주입함으로써, 조직 관류가 개선되고, 심근은 상기 손상으로부터 보호 할 수있다. 최대 치료 효과의 경우, 회생 물질이 가장 IBZ에 전달되는 것을 가정한다. 이것은 정확한 주사를 필요로하며, 새로운 사출 기술의 개발을 주도하고있다. 이러한 새로운 기술을 검증하기 위해, 우리는 심근 조직 분석을 기반으로 검증 프로토콜을 설계했다. 이 프로토콜은 상세한 이차원 (2D)와 심장의 해부학 및 심근 내 주사를 3 차원 (3D)을 분석 할 수 전체 심장 심근 조직 처리를 포함한다. 돼지에서 심근 경색은 좌전 하행 관상 동맥의 90 분 폐색에 의해 만들어졌습니다. 네 주 후에하는 믹스트초상 자성 산화철 입자 (SPIOs) 형광 비드와 함께 하이드로 겔 URE은 최소 침습 방식 내막을 사용 IBZ에 주입 하였다. 1 시간 주입 과정을 거친 후, 돼지를 안락사시키고, 심장을 절제하고, 아가로 오스 임베드 (한천). 한천의 고형화 후에, 자기 공명 영상 (MRI), 심장의 슬라이싱 및 형광 이미징을 실시 하였다. 영상 후 처리 한 후, 3 차원 분석은 IBZ 타겟팅 정확성을 평가하기 위해 수행 하였다. 이 프로토콜은 IBZ 심근에 주입의 타겟팅 정확성을 평가하기위한 구조화 재현 방법을 제공한다. 흉터 조직 및 / 또는 전체 심장의 분사 정밀도의 검증 처리가 요구되는 경우, 프로토콜은 쉽게 이용 될 수있다.

서론

허혈성 심장 질환은 과거 수십 년 1 죽음의 세계의 주요 원인이었다. 심근 경색 후 급성 치료는 경피적 관상 동맥 중재술 또는 관상 동맥 우회술을 통해 심근에 혈액의 흐름을 복원하는 것을 목표로하고있다. 심각한 경색에서 심근의 넓은 지역은 상처되며, 이러한 경우는 종종 허혈성 심부전 (HF)이 발생. HF 예방에 초점과 HF 환자의 심장 기능의 보존을위한 현재 치료 옵션이 아닌 재생합니다.

지난 10 년 동안 심장 재생 치료는 HF 3에 대한 치료 옵션으로 조사되었다. 이 치료는 재관류, 심근 보호, 분화를 유도하기 위해 직접 부상 심근에, 같은 줄기 세포 또는 성장 인자 등의 생물학적 제제를 제공하는 것을 목표로, 성장 4. 최적의 경우치료 효과는,이 생물이 생물의 생존 및 대상 영역 (5, 6)에 대한 최적의 효과를 잘 조직 관류를 용이하게하기 위해 경색 경계 존 (IBZ)에 주입해야한다고 가정한다. 다수의 기술은 심근 주사 7, 8, 9, 10, 11를 안내하는 IBZ 식별 및 시각화를 수행하기 위해 개발되었다. IBZ의 식별 및 시각화 외에, 배달도 사용되는 생체 재료 및 주입 카테터에 의존한다. 전달 기술의 분사 정밀도를 검증하기 위해, 정확하고 재현 가능한 정량 분석 ​​방법이 요구된다.

우리는 전체 심장 심근 조직의 2 차원 (2D) 제공 처리 및 3 dimensio위한 프로토콜을 개발했습니다정성 및 정량 연구에 사용할 수있는 최종 (3D) 영상은, 목표로하고있다. 프로토콜은 매립 처리 및 디지털 이미지 분석을 포함한다. 본 논문에서는 만성 심근 경색의 큰 돼지 모델에서 IBZ에서 심근 내 주입의 타겟팅 정확도 평가를위한 프로토콜을 보여줍니다.

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프로토콜

생체 내 실험은 실험 동물 연구의 연구소에 의해 제조 된 실험 동물의 관리에 대한 가이드에 따라 및 사용에 실시했다. 실험은 로컬 동물 실험위원회에 의해 승인되었다.

및 포함 주사 용액의 제조 (1)

  1. 주 사용 젤을 준비합니다.
    1. 13는 이전에 설명 된 프로토콜에 따라 12 우레이도 - 피리 미디 논 (UPy) 겔 1 ㎖를 준비한다.
    2. 이 용액에 추가 초상 자성 산화철 입자 (SPIOs)는 15 ㎍ / ml의 농도를 얻을 균일 분포 5 분 동안 혼합물을 교반한다.
    3. 10,000 비즈 / ml의 농도를 얻기 위해 용액에 형광 마이크로 비드를 첨가하고 균일 한 분포를 5 분 동안 혼합물을 교반한다.
    4. 어두운 곳에서 실온에서 생성 된 혼합물을 저장한다. 따뜻하고 소용돌이 또는 교반 t곧 주입 절차 전에 그는 솔루션입니다.
  2. 매립 용액을 준비한다.
    1. 실온 수돗물로 시작하고 (한천) 4 중량 %의 농도로 아가로 오스를 추가한다.
    2. 천천히 전자 레인지를 사용하여 비점 용액을 가열하고, 가열시에 빈번하게 교반한다. 비점 스토어에 도달하고, 2 시간 동안 70 ° C 위 한천 용액을 계속하면 갇힌 공기가 표면 있도록.
    3. 한천은 매립시까지 50 ~ 60 ° C 사이의 온도를 실온에서 냉각되도록.

2. 사출 절차

  1. 이전 14 설명 된 바와 같이, 900 mg을 경구 투여 (항 부정맥 제제, 항 혈소판 치료 및 진통제), 마취, 정맥 액세스 및 삽관을 수행합니다.
  2. 심근 주입 카테터 (재료 표)를 사용하는 주사를 수행한다. 각 주입 0.혼합물을 2 ㎖의 분사 장치를 사용하여 0.3 ㎖ / min의 일정한 속도로 하나 개의 덩어리로 주입된다. IBZ (12)을 따라 상이한 위치에서 주사를 놓는다.
  3. 종래, 동물을 안락사에 가돌리늄 계 조영제 15 분 0.2 ㎖ / kg (1.0 밀리몰 / ㎖) 관리.
  4. 정맥 내, 동물을 안락사 7.5 % 염화칼륨 20㎖의 관리.
  5. Koudstaal 등에 의해 설명 된 바와 같이, 8.3 - 프로토콜 다음과 같은 안전 종격동 액세스 8.2 단계를 반복합니다. (14). 우심방에서 하부 대정맥 정맥 5 센티미터 절단되고 흡입 장치와 유출되는 혈액을 제거한다. 마음을 절제하고 실온에서 0.9 % 식염수로 씻어.

3. 임베딩 절차

  1. 마음을 준비합니다.
    1. 그대로 심방과 심실을 유지하면서 마음에서 심낭을 제거합니다. ± 1cm Klinkenberg를 사용 대동맥판 위 대동맥을 해부가위. 심방으로부터 하부 대정맥을 정맥 ± 1cm 컷하고 폐정맥에 대해서도 똑같이.
    2. 매립 플라스틱 용기 (17 X 15 X 15cm, 가로 x 세로 x 높이) 삽입시에 심장의 부상을 방지하기 위해 2-0 봉합사를 이용하여 (도 1a)의 바닥 중심의 정점 봉합사.
    3. 심장이 중심으로되어 있는지 확인하고 용기 (그림 1B)의 벽을 터치하지, 2-0를 사용하여 용기의 림에 대동맥의 나머지 부분을 봉합.

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그림 1 : 도식 개요 및 퍼가기 컨테이너의 사진입니다. (A) 매립 처리의 개요도. 마음 (빨간색)은 봉합사를 사용하여 컨테이너 (파란색)에 고정된다. 한천 용액과 마음을 충전 한 후, 심장 주위의 공간이 채워집니다. 마지막으로,두 개의 경질 플라스틱 튜브 (황색)는 화상 등록시 기준 역할을하는 중심부를 만지고 다음에 있지만, 용기 내에 위치한다. 매립 용기에 고정 된 심장의 (B)의 사진. 봉합은 모기 클램프를 이용하여 상기 용기의 림에 고정되어있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 최종 이완기 같은 형상에 마음을 삽입.
    참고 : 기포 생성의 예방이 필요하다. 대형 공기 한천 용액에 존재하는 거품 경우, 기포 표면 있도록 40 ° C에서 한천을 유지한다.
    1. 모기 클램프를 사용하여 정맥 열등한 대정맥을 클램프. 천천히 우심방과 우심실 모두가 완전히 채워질 때까지 우수한 대정맥 정맥 우심방에 50ml의 주사기를 이용하여 액체 한천을 주입.
    2. mosquit를 사용하여 폐 혈관 클램프오 클램프. 부드럽게 대동맥 밸브를 통해 역행 한천 채워진 50 ml 주사기를 통과한다. 천천히 LV 및 좌심방이 완전히 채워질 때까지 좌심실 (LV)의 용액을 주입. 좌심실를 작성 후, LV에 한천을 유지하기 위해 대동맥 클램프.
    3. 마음이 완전히 덮여 때까지 용기에 남아있는 한천을 부어. 이후 화상 등록부 (도 1a)에 대한 기준 구조체 역할을 매립 용기 내에서 두 개의 경질 플라스틱 튜브를 놓는다. 튜브는 용기 또는 마음의 벽을 만지지 않도록합니다.
    4. 7 °의 C - 한천 2 응고 보자.

4. 이미지 수집

  1. 컨테이너에 포함 된 마음의 횡단 생체 MRI 검사를 수행합니다.
    1. 헤드 코일 내부에 매립 심장 (자재 표)로 컨테이너를 배치.
    2. 슬라이스는 용기의 바닥에 평행 Angulate. 용도각 생체 MRI 시퀀스에서 동일한 방향 및 만곡.
    3. 심근 시각화, 유체 감쇠 역 회복 다음 매개 변수 (FLAIR) 서열 수행 반복 시간 [TR] / 에코 시간 [TE = 10 초 / 140 밀리 플립 각 = 90 °, 화소 크기 = 0.5 × 0.5 mm보기 [FOV = 169 X 169 mm의 필드, 320 × 320 매트릭스 및 3 mm 슬라이스 두께.
    4. [TR] / [TE = 5.53 MS / 1.69 MS 플립 각 = 25 °, 화소 크기 = 1.0 × 1.0 mm, [: 심근 경색을 가시화하기 위해, 다음의 파라미터들 (LGE) 시퀀스 향상된 늦은 가돌리늄 수행 FOV = 169 X 169 mm, 176 X 176 매트릭스 및 3 mm 슬라이스 두께.
    5. - 24.6 MS 플립 각 = 15 °, 화소 [TR] / [TE = 88.7 MS / 1.9의 범위를 갖는 15 개의 동일한 분산의 TE하십시오 T2 다음 매개 변수 * -weighted 구배 에코 시퀀스를 수행 SPIOs 시각화 크기 = 0.5 × 0.5 mm, [FOV = 169 X 169 mm, 320 × 320 매트릭스 및 3 mm 슬라이스 두께.
  2. 조직의 사전 처리노래
    1. 거꾸로 컨테이너를 켜고 용기에서, 심장을 포함한 고체 한천 용액을 제거 한천 용기의 측면 사이의 공기를 할 수 있습니다. 고체 한천에서 플라스틱 막대를 제거합니다.
    2. 제 고기 슬라이서를 사용하여 심장의베이스에 정점으로부터 5 mm 조각의 중심부를 포함하는 한천 블록. 한천 블록의 아래쪽에 평행하게 절단하여 절단 조각 획득 된 MR 화상에서와 같은 만곡의 유지.
    3. 37 ℃에서 0.9 %의 생리 식염수에 용해 된 2,3,5- triphenyltetrazoliumchloride (TTC)의 1 중량 %에서 15 분 동안 (심장 포함) 한천 조각을 염색 및 수직 시야에서 양쪽의 조각을 촬영 (도 2A). 다음, 조심스럽게 0.9 % 식염수의 조각을 씻어.
      참고 :이 연구에서 우리는 적절한 렌즈 / 목적, 삼각대, 균일 한 조명과 함께 DSLR 카메라 설정을 사용했다. 그러나, 사진은 단지 흉터 영역의 평가를위한 대조군으로그래서 우리는 다른 설정을 사용할 수도.
  3. 형광 이미징
    주 : 따라서, 선택된 여기 레이저 형광 마이크로 비드의 여기 및 방출 파장에 따라 (예를 들어, 여기에 사용되는 적색 마이크로 비드는 각각 580 nm 내지 605 nm의 여기 스펙트럼과 발광 파장을 가지고이 적절한 필터 블록 및 여기 레이저를 선택 대역 통과 필터는 532 nm의 30분의 580 nm 내지 30분의 610 nm의 각각)로 설정 하였다.
    1. 가변 모드 스캐너를 선택 형광 모드 영상. 430 V 또는 등가의 광전자 증 배관, 100 × 100 μm의 픽셀 크기를 설정한다. 형광 마이크로 비드의 여기 파장으로 여기 레이저 (532 ㎚)에 가장 가까운 선택.
    2. 제 1 필터 블록, 주입 된 형광 비드 (채널 1)의 발광 파장과 중첩 대역 통과 필터 (30분의 580 나노 미터)을 선택한다. 전자 바깥 번째 필터 블록 (30분의 610)를위한 대역 통과 필터를 선택미션 파장 (채널 2).
      제 2 필터 블록은 대조군 역할을 그대로 분사 위치를 유지하면서 자동 형광을 제거 참고.
    3. 두 채널을 이용하여 가변 모드 레이저 스캐너의 형광 모드 한천 조각의 양면을 스캔. 각 조각은 완전히 참조 구멍을 포함하여, 스캔되어 있는지 확인합니다.

5. 후가공

참고 : 이미지 후 처리의 첫 번째 단계는 내향 및 심 외막 국경뿐만 아니라 주사 부위를 추적하기 위해 자체 개발 한 스크립트를 사용하여 심근의 수동 분할이다. 이것은 MRI와 형광 검사 모두 동일합니다.

  1. 세그먼트 자기 공명 영상 검사에서 심근.
    1. 세그먼트 감각 MRI 시퀀스 이미지에 심 내막과 심 외막 브 보더스.
    2. LG 전자 MRI 시퀀스에 LGE-MRI 데이터 세트 세그먼트에 단계 5.1.1에서 흉터를 LV 분할 복사.
    3. 좌심실의 심근 * -weighted 세트 및 세그먼트 SPIO 증착에 T2의 단계 5.1.1에서 심근 세그먼트를 복사한다.
  2. 형광 이미지를 처리하고 세분화를 수행합니다.
    1. 가변 모드 스캐너로부터 얻어진 파일을로드하고, 각 단면 중심 슬라이스의 별도의 이미지를 만든다.
    2. 방향 정점과 정점으로부터 기부으로 배향되는 두 채널의 스택에 형광 이미지를 정렬베이스 스캔 된 슬라이스 플립.
    3. 형광 이미지에 세그먼트 심 내막과 심 외막 브 보더스.
    4. 세그먼트 형광 이미지에 수동으로 흉터 및 사용하는 LG 전자-MRI 스캔과 사진은 흉터의 형태를 확인합니다.
    5. 자동 형광을 제외 채널 1의 화상 스택에서 채널 2의 화상 스택을 뺀다. 수동 세그먼트는 형광 마이크로 비드 침착하고 확인 * 이미지를 T2를 사용합니다.
  3. 만들다해부학 - 정확한 3 차원 형상은, 기준 구조 (경질 관에 의해 생성 된 구멍)에 기초하여 화상 스택의 조각 경질 등록을 수행한다. 계산하고 각 이미지의 적용 번역 및 회전을 저장합니다.
  4. 이미지 스택과 세분화에 저장된 변환을 적용합니다. 선형 오리지널 슬라이스 두께를 재구성하고, 상기 데이터의 3D 모델을 생성하기 위해 슬라이스의 양측의 세그먼테이션을 보간.

6. 분석

  1. 분사 정확도를 평가하기 위해 주사 부위의 센터와 IBZ 사이의 거리의 2D 및 / 또는 3D 측정을 수행합니다. 좌심실 분할의 내막 국경의 거리를 측정합니다. 도 2c 및도 2f에서, 2 차원 및 3 차원 측정의 예는 적색 라인으로 표시된다.

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결과

조직 임베딩

매립 공정을 통해 최종 확장기와 같은 형상이 설립되었다. 성공적으로 조직을 가능하게 심장 조직에 부착 된 한천은 동일한 슬라이스 두께 (도 2A 및 2C)로 원하는 만곡에서 분리된다.

Scar- 및 주사 부위 평가

각 영상 기법의 경우, 경색 및 사출 위치 평가는 성공적으로 수행했다. 모두 2 차원 형광 이미징 및 MRI 영상에서, 흉터 및 사출 사이트 (명확하게 구분되었다 그림 2C, 2D 및 2E,

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토론

이 프로토콜에 따라 전체 심장 3D 심근 조직 처리 경색의 IBZ 및 심장의 해부학에 대해 수행 된 주입의 3 차원 분석을 가능하게하는 구조화 된 방법을 제공한다. 마음의 충전 볼륨이 원하는 분석에 따라 달라집니다. 본 연구에서는 사출 정확성을 평가하기 위해, 우리는 최대한 가깝게 최종 이완기 형상을 닮은 마음을 채우기 위해 목표. 이를 적용하려면 LV 에이펙스는 용기의 바닥에 고정되고, 폐정맥을 클램핑하는 동안 LV는 아가로 채워진다. 좌심실가 작성되면, 대동맥은 LV 유출 가능한 한 가깝게 확장 기말 형상을 모방에서 한천을 방지 할뿐만 아니라 클램핑된다. 임베디드 마음을 단면은 균일 한 슬라이스 두께의 혜택을 제공하고, 조각에 생체 이미징과 같은 각 형성 될 수 있습니다. 슬라이싱 후에, 매립 재료가 의한 변형이 티슈 방지화상 취득 동안에 슬라이스 처리. 염색은 대사 적 활성 및 조직 -inactive 구별 효소에 의존 이상적으로, TTC 염색법은 몸에서 제거한 후 가능한 한 빨리 수행되어야한다. 우리의 프...

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공개 사항

저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

저자는 동물 실험과의 도움을 말리진 얀센, 조이스 비저, 그리고 마티 반 Nieuwburg에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 크게 MRI 이미징과의 지원 마티 Froeling과 안케 와싱크 인정합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.9% 식염수Braun
AgaroseRoche 진단과학 등급 다목적 아가르
생체 분자 형광 스캐너 태풍 9410 GE 헬스케어
임베딩 용기플라스틱, 치수 17 x 14.5 x 14cm
FluoSpheres 폴리스티렌 마이크로스피어InvitrogenF8834red, 10 µ m
가돌리늄Gadovist1.0 mmol/mL
dS 32 채널 헤드 코일필립스또는 이와 유사한
MatlabMathworks호환성을 보장하기 위해 2015a 이상
고기 슬라이서Berkel
Myostar 주입 카테터Biosense 웹스터
슈퍼 상자성 산화철 입자Sinerem
Triphenyl-tetrazolium chlorideMerck
UPy-PEG10k
Vicryl 2-0Ethicon

참고문헌

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