여기에서는 인접한 사멸 또는 죽어가는 세포와의 물리적 상호 작용에 의해 생존 가능한 세포에서 유도되는 세포 내 신호 전달 이벤트를 결정하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 죽은 세포의 식세포 흡수 또는 용해성 매개체의 방출과 대조적으로 죽은 세포의 수용체 매개 인식에 의해 유도되는 신호 전달 이벤트에 중점을 둡니다.
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방법 논문
세포 내 이웃 셀을받은 사멸 세포 죽음과의 상호 작용에 의해 실행 가능한 세포에서 유도 된 이벤트를 시그널링의 식별
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이 논문에서
요약
초록
아폽토시스로 죽어가는 세포는 또한 인접 생균의 기능에 영향을 할 수 있도록 다수의 새로운 작업을 취득로 규제 세포 사멸 함. 이러한 생존, 증식, 성장, 분화 등의 생명 활동은 세포 사멸 세포에 의해 변조 된 많은 세포 기능 중입니다. 사멸 세포에 인식하고 반응하는 능력에 관계없이 혈통 또는 발신의 기관의 모든 세포의 보편적 인 기능이 나타납니다. 그러나, 다이버 시티가 큰 치료 특정 결과에 대한 책임이있는 신호 전달 사건 경로 해부 취해질 사멸 세포의 위임에 대한 응답의 복잡성. 특히, 하나의 세포 자멸사를 포함한 가능한 응답자 세포 내에서 세포 내 신호 전달 경로에 영향을 줄 수있는 다수의 메카니즘을 구별해야의 수용체 - 매개 세포 사멸 세포의 인식은 사멸 세포에 의한 수용성 매개체의 방출 및 / 또는 결합 phagocytic 기계. 여기서, 우리는 세포 사멸에 대한 노출 다음 가능한 응답자 세포에서 유도되는 세포 내 신호 이벤트를 식별하기위한 프로토콜을 제공한다. 프로토콜의 주요 장점은 사멸 세포가 반응 셀 내의 이벤트 신호 조절하는 메커니즘의 절개로 지불주의에 달려있다. 프로토콜을 조건 적 불사 마우스 신장 근위 관상 세포주 (BU.MPT 세포)에 대한 특정하지만, 그것은 쉽게 기원 비상피 및 / 또는 신장 이외의 기관에서 유래 된 세포주에 적용된다. 자극 죽은 세포의 사용은 세포 내 신호 이벤트의 검출을 방해 할 수있는 몇 가지 독특한 요소를 도입한다. 이런 문제뿐만 아니라, 그것들을 최소화하거나 회피 전략이 프로토콜 내에서 설명된다. 이 프로토콜의 적용은 건강과 disea에 모두 죽었거나 죽어가는 세포가 라이브 이웃에 미치는 광범위한 영향의 우리의 확장 지식을 도움한다그 자체.
서론
아폽토시스 또는 조절 된 세포 사멸 (1)는, 조직 유지 및 발달에 필수적인 방식으로 기여한다. 가장 간단하게 조회, 세포 사멸의 허가, 세 손상, 또는 과잉 세포는 주변 조직 2,3에 해없이 제거 할 수 있습니다. 조직의 항상성에 세포 사멸의 기여는하지만, 훨씬 더 역동적이고 다양합니다. 아폽토시스로 죽어가는 세포는 여러 새로운 활동을 취득 모두 분비 세포 연관된 인접 생균 4-10의 기능에 영향을 할 수 있도록. 11-16 염증을 억제하기 사멸 세포의 기능에 중점을 이전 연구하지만 사멸 세포는 생존 4,9,10, 4,9,10 증식, 분화 (17)와 같은 중요한 작업을 포함한 세포 기능의 넓은 범위를 조절 이전 18과 성장 19. 더욱이, 이러한 효과는 대 식세포와 같은 전문 식세포에 한정되지S 있지만, 이러한 상피 및 내피 세포 7,9,10,18-21 같은 비 전통적 식세포 비롯한 거의 모든 세포 유형 및 계통으로 연장된다.
사멸 세포에 노출 된 다음 인접 살아있는 세포의 특정 응답은 가능한 응답 세포와 세포 사멸 세포 자체에 모두 관련된 여....
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프로토콜
1. 준비
주 :이 프로토콜 둘 이상의 세포주 또는 일차 세포 배양에서 독립적으로 특정 조건 하에서 제조된다. 이 제제는 세포 사멸 세포 (프로토콜 1), 괴사 세포 (프로토콜 2) 건강 응답자 세포 (프로토콜 3)를 포함한다. 독립적 준비되면 세포 사멸 또는 세포 괴사가 리스폰 더 세포에 첨가하고, 생성 된 신호 전달은 (프로토콜 4, 5, 6) 모니터링된다.
- 배지 및 시약을 준비
- 110 배속 둘 베코의 변형 이글의 중간 (DMEM) 4.5 g / L 포도당, 584 ㎎ / ℓ의 ʟ 글루타민을 함유 : (허용 조건에서 세포를 성장하는 경우, 사용을 위해 1.2 절 참조) 500 mL의 문화 매체 A를 준비 다음을 결합하여 밀리그램 / L 피루브산 나트륨, 100 유닛 / ㎖의 페니실린 - 스트렙토 마이신, 10 % (v / v)의 소 태아 혈청 (FBS), 10 단위 / 인터페론 γ (IFN-γ)의 용액.
- 사용 WH위한 배양 배지 B의 500 ㎖를 (준비비 허용 조건에서 혈청 굶주린 세포 욕실 전에 혈청 기아에 비 허용 조건 (아래의 세포 성장을 배양 배지 A.)의 제조법에서 FBS와 IFN-γ를 생략하여 섹션 1.2)를 참조하십시오, 10 % 절 추가 배양 배지 B.에 / V FBS....
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결과
도 1에서는 타이밍 및 임계 사멸 세포의 제조에 관련된 단계 (프로토콜 1), 괴사 성 세포 (프로토콜 2) 및 세포 사멸 및 괴사 세포 현탁액과 응답자 세포의 자극 (프로토콜 4)을 도시하는 개략도를 제공한다.
도 2에서는, 세린 - 트레오닌 키나아제 글리코겐 합성 효소 키나제 3 (GSK-3), GSK-3α 및 GSK-3β의 두 이성체의 인산화에 사멸 세포의 효과를 보여주는 대표적인 결과를 제공한다. GSK-3α / β는 세포 증식 및 생존의 조절에 중요한 역할뿐만 아니라, 글루코스 대사의 중요한 역할을 갖는다. 세린-9에서 세린-21과 GSK-3β에서 GSK-3α의 인산화 차례로, 인산화를 감소 β-catenin이 안정화 증가에 이르게, 키나제 활성을 억제합니다. β-catenin이다음은 세포 .......
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토론
우리는 여기서 사멸 또는 세포 사멸의 다른 형태를받은 세포에 노출을 다음 생존 세포에서 유도 된 세포 내 신호 이벤트를 특성화하기위한 프로토콜을 제공한다. 프로토콜은 세포 사멸에 대한 노출은 가능한 응답자 세포 내에서 세포 내 신호 전달 경로를 변조 할 수있는 복수의 메커니즘을 강조한다. 이러한 메커니즘은 다음과 같습니다 상호 작용을 (죽은 세포 또는 창고 소포 및 마이크로 소포에 분자 또는 표면의 결정을 브리지를 통해 종종 세포 사멸 몸을 불리는) 응답자 세포의 특정 수용체와; (심지어 또는 세포 외 세대 27) 수용성 매개체의 방출; 상기 기계 식세포의 결합. 실질적인 탐식이 발생하는 상황에서는 고려 될 수있는 추가적인 메커니즘은 세포 사멸 또는 소체 (21) 내에서 농축 등의 마이크로 RNA와 같은 매개체의 전달이다. O에 비해 우리 프로토콜의 중요성THER 방법은, 사멸 세포 응답 세포 내 신호 전달을 조절 할 수있는 여러 메커니즘의주의 해부에있다. 주요 장점은 필요한 대부분의 기.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 José A. Arruda 박사와 시카고 일리노이 대학교 신장학 분과의 기관 기금(J. S. L.에게)의 기관 기금으로 전체 또는 부분적으로 지원되었으며, McGill University 의과대학과 McGill University Health Center 연구소의 자금 지원(J. R.에게)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
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| Cytochalasin D, 4 mM in dimethyl sulfoxide (DMSO), from Zygosporium mansonii | Sigma (St. Louis, MO) | C8273 | 사용 at [4 μ g/mL] 식균작용을 억제하기 위해 |
| 디메틸 설폭사이드(DMSO) | 시그마(세인트루이스, 미주리) | D2650 | 시토칼라신용 용매 D |
| [헤더] | |||
| 세포 용해 완충 완충 성분 | |||
| Tris-buffered saline(TBS), 10x, pH 7.4 | BioRad(Hercules, CA) | 1706435 | 세포 용해 완충 |
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| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | L3771 | 세포 용해 완충액의 경우 0.1% w/v |
| 글리세롤 | 시그마-알드리치(미주리주 세인트루이스) | G5516 | 세포 용해 완충액용 10% |
| 불화나트륨 | 시그마-알드리치(미주리주 세인트루이스) | 450022 | 세포 용해 완충액용 25mM |
| 완전 미니 EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일 정제 | Roche Diagnostics(인디애나폴리스, 인디애 | 4693159001 | 세포 용해 완충액, 완충액 10mL당 1 |
| Triton X-100 | 시그마-알드리치(세인트루이스, MO) | T8787 | 세포 용해 완충액용 10% |
| Dithiothreitol (DTT) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 11DTT00005 | 세포 용해 완충액용 1 mM |
| 페닐메탄설포닐 플루오라이드 (PMSF) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 4800263 | 세포 용해 완충액용 1 mM |
| Sodium orthovandate | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 2159664 | 세포 용해 완충액 |
| 용 10 mMName | Company | Catalog | Comments |
| Equipment | |||
| Sorvall T6000B centrifuge | Du Pont (Wilmington, DE) | T6000B | |
| Fisher Tissuemat, water | bath Fisher (Waltham, MA) | ||
| Sonic Dismembrator (sonicator), model 100 | Fisher (Waltham, MA) | ||
| Miscellaneous | |||
| Cell counting chamber, Neubauer | Hawksley (Lancing, Sussex, UK) | AC2000 | |
| Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit II | Millipore (Billerica, MA) | CBA059 | for PI and Annexin V staining to determine of apoptosis(세포사멸 단계를 결정하기 위한 PIC 및 Annexin V 염색) |
| Eppendorf microcntrifuge tubes, 1.5 mL | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T9661 | |
| Transwell 투과성 지지체, 0.4 μ m 폴리카보네이트 멤브레인 | Corning (Corning, NY) | 3413 | 무균, 폴리스티렌, 조직 배양 처리 |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Antibodies | |||
| 포스포-글리코겐 합성효소 키나아제-3&알파;/&베타; (GSK-3&알파;/&베타;) (Ser21/9), 다클론 항체 | Cell Signaling Technology | 9331 | 토끼 다클론 항체 |
| 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소(GAPDH) 단클론 무기구( (14C10) ) | Cell Signaling Technology | 2118 | 토끼 단클론 항체 |
참고문헌
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- Wallach, D., Kang, T. -B., Kovalenko, A. Concepts of tissue injury and cell death in i....
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