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방법 논문

세포 내 이웃 셀을받은 사멸 세포 죽음과의 상호 작용에 의해 실행 가능한 세포에서 유도 된 이벤트를 시그널링의 식별

8.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/54980

⸱

2016년 12월 27일

 ,  ,  ,  , 
1Section of Nephrology, Department of Medicine, University of Illinois at Chicago, 2Section of Nephrology, Department of Medicine, Jesse Brown Veterans Affairs Medical Center, 3Department of Biology, Kutztown University of Pennsylvania, 4Division of Rheumatology, Department of Medicine, Research Institute of the McGill University Health Centre, 5Department of Microbiology & Immunology, University of Illinois at Chicago

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기에서는 인접한 사멸 또는 죽어가는 세포와의 물리적 상호 작용에 의해 생존 가능한 세포에서 유도되는 세포 내 신호 전달 이벤트를 결정하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 죽은 세포의 식세포 흡수 또는 용해성 매개체의 방출과 대조적으로 죽은 세포의 수용체 매개 인식에 의해 유도되는 신호 전달 이벤트에 중점을 둡니다.

초록

아폽토시스로 죽어가는 세포는 또한 인접 생균의 기능에 영향을 할 수 있도록 다수의 새로운 작업을 취득로 규제 세포 사멸 함. 이러한 생존, 증식, 성장, 분화 등의 생명 활동은 세포 사멸 세포에 의해 변조 된 많은 세포 기능 중입니다. 사멸 세포에 인식하고 반응하는 능력에 관계없이 혈통 또는 발신의 기관의 모든 세포의 보편적 인 기능이 나타납니다. 그러나, 다이버 시티가 큰 치료 특정 결과에 대한 책임이있는 신호 전달 사건 경로 해부 취해질 사멸 세포의 위임에 대한 응답의 복잡성. 특히, 하나의 세포 자멸사를 포함한 가능한 응답자 세포 내에서 세포 내 신호 전달 경로에 영향을 줄 수있는 다수의 메카니즘을 구별해야의 수용체 - 매개 세포 사멸 세포의 인식은 사멸 세포에 의한 수용성 매개체의 방출 및 / 또는 결합 phagocytic 기계. 여기서, 우리는 세포 사멸에 대한 노출 다음 가능한 응답자 세포에서 유도되는 세포 내 신호 이벤트를 식별하기위한 프로토콜을 제공한다. 프로토콜의 주요 장점은 사멸 세포가 반응 셀 내의 이벤트 신호 조절하는 메커니즘의 절개로 지불주의에 달려있다. 프로토콜을 조건 적 불사 마우스 신장 근위 관상 세포주 (BU.MPT 세포)에 대한 특정하지만, 그것은 쉽게 기원 비상피 및 / 또는 신장 이외의 기관에서 유래 된 세포주에 적용된다. 자극 죽은 세포의 사용은 세포 내 신호 이벤트의 검출을 방해 할 수있는 몇 가지 독특한 요소를 도입한다. 이런 문제뿐만 아니라, 그것들을 최소화하거나 회피 전략이 프로토콜 내에서 설명된다. 이 프로토콜의 적용은 건강과 disea에 모두 죽었거나 죽어가는 세포가 라이브 이웃에 미치는 광범위한 영향의 우리의 확장 지식을 도움한다그 자체.

서론

아폽토시스 또는 조절 된 세포 사멸 (1)는, 조직 유지 및 발달에 필수적인 방식으로 기여한다. 가장 간단하게 조회, 세포 사멸의 허가, 세 손상, 또는 과잉 세포는 주변 조직 2,3에 해없이 제거 할 수 있습니다. 조직의 항상성에 세포 사멸의 기여는하지만, 훨씬 더 역동적이고 다양합니다. 아폽토시스로 죽어가는 세포는 여러 새로운 활동을 취득 모두 분비 세포 연관된 인접 생균 4-10의 기능에 영향을 할 수 있도록. 11-16 염증을 억제하기 사멸 세포의 기능에 중점을 이전 연구하지만 사멸 세포는 생존 4,9,10, 4,9,10 증식, 분화 (17)와 같은 중요한 작업을 포함한 세포 기능의 넓은 범위를 조절 이전 18과 성장 19. 더욱이, 이러한 효과는 대 식세포와 같은 전문 식세포에 한정되지S 있지만, 이러한 상피 및 내피 세포 7,9,10,18-21 같은 비 전통적 식세포 비롯한 거의 모든 세포 유형 및 계통으로 연장된다.

사멸 세포에 노출 된 다음 인접 살아있는 세포의 특정 응답은 가능한 응답 세포와 세포 사멸 세포 자체에 모두 관련된 여러 요인에 따라 달라집니다. 사멸 세포에 노출 모두 뮤린 대 식세포 및 신장 근위 관 상피 세포 (PTECs)의 증식을 억제하지만, 예를 들어,이 두 종류의 세포가 사멸 세포 4,6,9,10 그들의 생존 응답 대폭 다르다. 사멸 세포는 대 식세포의 생존을 촉진하지만, PTECs 4,6,9,10의 세포 사멸 죽음을 유도한다. 특히, 세포 사멸에 대한 응답은, 동일한 혈통의 세포 응답을 원점 (10) (유방 상피 비교 예 신장 PTECs의 셀의 응답에 따라 장기 사이에도 다를 수도세포) 또는 활성화 상태 (22) (예, 호중구). 반대로, 사멸 세포는 세포 사멸의 특성에 따라 매우 동일한 셀에서 다른 응답 10,23 또는 10,14 아폽토시스의 스테이지 자극 보여주고있다.

사멸 세포에 대한 반응의 복잡성 · 다양 주어 큰 관심이 특정 결과에 대한 책임이있는 신호 전달 사건 경로 해부에주의해야한다. 첫째, 생존과 사멸 세포 사이의 직접적인 물리적 상호 작용을 필요로하는 응답은 사멸 세포 3,6-10에 의해 발표 또는 생성 된 수용성 매개체에 의해 유도하는 차별화해야합니다. 물리적 상호 작용이 필요한 경우, 추가의 미분이 수행되어야한다. 신호 이벤트는 사멸 세포를 결합하는 특정 수용체의 독립 이후 말림의 독립, 또는 식세포 흡수에 세포 사멸 세포의 수용체 매개 인식에 따라 달라질 수 있습니다 3-7,9,10,19. 후자의 경우에, 응답은 사멸 세포에 고유하지 않으며, 어떠한 재료 식세포 4,6- 의해 트리거 될 수있다.

이 차이의 중요성은 다시 식세포 신장 PTECs의 반응을 대조함으로써 알 수있다. 두 세포 유형의 세포 사멸에 노출 친 생존 키나아제의 Akt의 활성을 변화시킨다. 변조는 0.4 μm의 폴리 카보네이트 막에 의한 응답의 분리 및 세포 사멸 세포 때문에 응답 4,9,10,19를 폐지, 물리적 상호 작용에 따라 달라집니다. 대 식세포의 탐식 4,9,10,19 응답하여 구동하는 반면, PTECs의 반응은 수용체 매개 식균 작용과는 독립적이다. 이러한 결론은 라텍스 비즈 중성 식세포 자극에 노출 더 PTECs에서의 Akt 활성에 효과가 있지만, 흉내 4,9 식세포의 세포 사멸 효과가 없다는 사실에 의해 강화된다.

"덜 연구>하지만, 괴사 또는 우발적 인 세포 사멸 (1)에 의해 죽는 세포는 또한 세포 자멸사 마찬가지로 괴사 세포는 다양한 메커니즘, 특히 누설을 통해 그 효과를 발휘한다. 3-10,19 근처 생존 세포의 기능을 조절 자신의 파열 세포막 3,5,6,9,24을 통해 세포 내 내용의. PTECs 및 대 식세포를 포함한 많은 세포, 세포 괴사 5,9에 의해 죽음에 대해서는 다른 비 경쟁 수용체를 가지고있다. 이러한 수용체의 참여는 신호 이벤트를 유도 세포 사멸 세포가 인산화 9,10,19을 감소하는 반면 자주 사멸 세포 4-10,19에 대한 수용체의 결합에 의해 유도 된 그 반대. 예를 들어, PTECs에서 괴사 세포의 Akt의 인산화를 증가시킨다.

여기서는 인접 PTECs 사멸 수용체 - 매개를 통해 인식 가능한 신장 PTECs에 의한 세포 내 신호 이벤트를 식별하기위한 프로토콜을 묘사 9,10,19. 프로토콜 BU.MPT 세포 9,10,19,25,26를 알려진 조건 PTEC 불멸화 세포주에 특이하지만, 쉽게 기원 비상피 및 / 또는 이외의 기관에서 유래 된 세포주에 적응 신장. 중요한 세포 자극 등의 사멸 세포의 사용은 수용성 리간드없는 특정 고유 실험 어려움 포즈. 이들 중 가장 중요한 것은 사멸 세포는 현탁액보다는 용액으로 추가되어야한다는 것이다. 이러한 어려움뿐만 아니라, 그것들을 최소화하거나 회피 전략이 프로토콜 내에서 설명된다. 거의 프로토콜에 설명 된 모든 기술은 간단하고, 세포 배양에 대한 표준이다. 이 프로토콜의 장점은 사멸 세포 응답 세포 내 신호 전달을 조절하는 여러 메커니즘의 관심에있다. 이러한 메커니즘은 표면의 결정을 통해 결합 또는 재에 특정 수용체 ​​분자를 브리징 포함sponding 세포 용해성 매개자의 방출, 및 / 또는 식세포 기계 결합. 괴사 세포 결과는 세포 죽음의 모드, 그리고 죽은 세포에 대한 일반화 된 응답에 해당하는지 확인하기 위해 모든 실험에 포함되어 있습니다. 이 프로토콜에서 권장하는주의 깊은 접근 방식은, 죽어가는 세포가 건강과 질병 모두에서, 라이브 이웃에 발휘 적 확대 영향에 대한 우리의 이해에 중요하다.

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프로토콜

1. 준비

주 :이 프로토콜 둘 이상의 세포주 또는 일차 세포 배양에서 독립적으로 특정 조건 하에서 제조된다. 이 제제는 세포 사멸 세포 (프로토콜 1), 괴사 세포 (프로토콜 2) 건강 응답자 세포 (프로토콜 3)를 포함한다. 독립적 준비되면 세포 사멸 또는 세포 괴사가 리스폰 더 세포에 첨가하고, 생성 된 신호 전달은 (프로토콜 4, 5, 6) 모니터링된다.

  1. 배지 및 시약을 준비
    1. 110 배속 둘 베코의 변형 이글의 중간 (DMEM) 4.5 g / L 포도당, 584 ㎎ / ℓ의 ʟ 글루타민을 함유 : (허용 조건에서 세포를 성장하는 경우, 사용을 위해 1.2 절 참조) 500 mL의 문화 매체 A를 준비 다음을 결합하여 밀리그램 / L 피루브산 나트륨, 100 유닛 / ㎖의 페니실린 - 스트렙토 마이신, 10 % (v / v)의 소 태아 혈청 (FBS), 10 단위 / 인터페론 γ (IFN-γ)의 용액.
    2. 사용 WH위한 배양 배지 B의 500 ㎖를 (준비비 허용 조건에서 혈청 굶주린 세포 욕실 전에 혈청 기아에 비 허용 조건 (아래의 세포 성장을 배양 배지 A.)의 제조법에서 FBS와 IFN-γ를 생략하여 섹션 1.2)를 참조하십시오, 10 % 절 추가 배양 배지 B.에 / V FBS
    3. 죽은 세포의 고정 4 %의 재고 파라 포름 알데히드로부터 1 배 둘 베코 인산염 완충 생리 식염수 (DPBS)에서 0.4 % (v / v)의 파라 포름 알데히드, pH가 7.2을 준비합니다.
      참고 : 파라 포름 알데히드는 독성이, 적절한주의는 그것의 사용에서 수행되어야한다.
  2. 문화 BU.MPT 세포
    1. 액체 질소에서 BU.MPT 셀 한 바이알을 해동.
      참고 BU.MPT 주요 마우스의 제어하에 SV40 큰 종양 항원 (TAG)의 온도에 민감한 (TS) 돌연변이 (tsA58)를 담지 트랜스 제닉 마우스로부터 유도 된 마우스 신장 근위 관 상피 세포 (PTEC) 라인 조직 적합성 복합체 (MHC) H-2K의 B 클래스 I은 25, 26를 프로모터.
    2. 멸균 polystyr에 플레이트 세포엔 진공 기체 플라즈마 처리 된 조직 배양 접시 (~ 5 × 106 세포 100mm 직경 접시 당).
    3. 가습 5 % (v / v)의 CO 2 분위기에서 허용 조건에서 세포를 성장.
      참고 : 33 문화로 정의된다 관대 한 조건 - IFN-γ의 존재에서 37 ºC는 tsA58 돌연변이 태그 유전자의 안정적인 표현을 할 수 있습니다. 허용 조건이 무한정 계대 수에 따라 단일 통로 또는 둘 이상을 생존하지 않는 마우스 신장 PTEC의 차 문화와 달리, BU.MPT는 배양.
      1. 실험에 사용하기 전에 해동 후 통로 세포는 적어도 3 시간.
        1. 통로 셀에 5 분간 37 ºC에서 (V / V) CO 2 분위기 가습 5 % 100mm의 접시 당 0.05 % 트립신 1 mL를 첨가하고 배양한다. 10 ㎖ 매체 A. 흡인 물의 분리 된 세포를 첨가함으로써 트립신을 중화하고, 1 분할 : 새로운 100mm 멸균 폴리스티렌 진공 기체 플라즈마 처리 담배 마는으로 5 : 1 내지 3UE 문화 요리. 100mm 접시 당 10 ㎖의 총 볼륨을 가지고 매체 A를 추가합니다.
    4. 세포 응답 등의 실험적인 사용에 대비, 비 허용 조건에서 가습 5 %에 합류하는 세포 (v / v)의 CO 2 분위기를 성장 (즉, IFN-γ의 부재에서 39 ºC에서 [중간 B는 10 %의 V를 포함 / V FBS).
      주 : 비 허가 조건에서 tsA58 돌연변이 태그 도입 유전자의 발현을> 95 %로 억제하고, BU.MPT 세포는 마우스 신장 PTEC의 차 배양처럼 행동.

사멸 BU.MPT 세포의 2. 준비 (프로토콜 1)

참고 :이 프로토콜은 세포 사멸 유도의 방법과 세포 사멸 세포의 소스 및 스타 우로 스포린 등 BU.MPT 세포 고유의 것입니다. 대안으로, 다른 세포주 또는 일차 세포 배양은 표준화 protoco에 의해 유도 된 아폽토시스로 사멸 세포의 공급원으로 사용될 수있다아폽토시스 유도 특정 세포 유형 및 방법 LS.

  1. 100mm 직경 멸균 폴리스티렌 진공 기체 플라즈마 처리 된 조직 배양 접시 상에 통과 한 후에 BU.MPT 세포를 가습 5 %에 합류 허가 조건 (V / V) CO 2 분위기 성장 (즉에서 배양 매체 A 37 ºC에서 1.2.3 절에서 설명한 바와 같이 100mm의 접시 당 10 ㎖).
  2. 부착 성 세포 단층을 린스 당 10 ㎖를 사용하여 배양 배지 B로 3 회 헹군.
  3. 37 ºC에서 (V / V) CO를 가습 5 %에서 3 시간 동안 1 μg의 / ㎖에서 2 분위기 스타 우로 스포린, 비 선택적 키나제 억제제를 함유하는 배양 배지 B에서 세포를 배양하여 세포 사멸을 유도한다.
  4. 단일 층에서 분리 한 "부동"사멸 세포를 포함하는 스타 우로 스포린 함유 배지를 흡인. 원심 분리기 500 XG에 10 분 동안이 매체는, 상층 액을 버린다 펠렛을 배양 배지 B로 3 회 세척하고,다음 단계, 2.5에서 수집 세포에 다시 펠렛을 추가합니다.
  5. 5 밀리미터 (에틸렌 디아민 테트라 아세트산) 1 배 칼슘의 EDTA를 첨가하여 단계 2.3 및 2.4에서 나머지 부착 세포를 분리 2 + - Mg를 5 분 동안 접시 당 1 mL의에서 2 + - 무료 DPBS. 분리 된 사멸 세포를 함유하는 EDTA 함유 배지를 흡인하고 15 mL의 멸균 폴리스티렌 원심 관의 단계 2.4에서 "부동"사멸 세포로 분리 된 세포를 풀링.
  6. 및 마그네슘 + 2 세척 당 - 무료 DPBS - 10 mL의 1 배의 칼슘 + 2 10 500 XG에 분, 재 부유에 대한 사멸 세포를 원심 분리하여 세 번 씻으십시오.
  7. 마지막 세척 후, 응답자 세포를 자극하기 위해 사용 전에 용액 당 ~ 5 × 106 세포를 신선한 배지에서 B 세포의 사멸을 정지. 또한, 30 분 동안 1X DPBS 0.4 %에서 (v / v)의 파라 포름 알데히드를 씻어 사멸 세포를 해결하고 문화로 3 회 세척배양 배지 (B)에 정지하기 전에 매체 B,
  8. 적절한 사멸 세포의 개별 제제를 사용하여 세포 계측법 (또는 이러한 목적을 위해 일부 셀을 예약하여) 이전 6,9,10,15 바와 같은 흐름에 의해 세포 자멸의 유도를 확인한다.
    주 : 초기 사멸 세포는 본래 세포막을 가지며, 요오드화 프로피 듐 (PI)로 표시하고 제외 어 넥신 V 양성 세포 (세포 생존에 대해) 셀 크기를 감소시켰다. 후기 사멸 세포 비 본래 세포막 있고, PI의 양성 및 아 넥신 V 양성 세포는 세포 크기의 감소로 나타난다. 현재의 프로토콜을 사용하여 일반적인 준비는 ~ 85 %를 초기 세포 사멸과 ~ 15 % 후반 사멸 세포가 포함되어 있습니다.
  9. 직접 또는 0.4 % 1X DPBS에서 (v / v)의 파라 포름 알데히드와 30 분 동안 세포 사멸 세포의 고정 후, 1 : 1의 세포 사멸 - 투 - 응답 세포 비율로 응답 세포 (프로토콜 3) BU.MPT하는 사멸 세포를 추가 .
    참고 : 사멸 세포 고정을 이전에 응답자의 자극해야관찰 된 신호 이벤트 가용성 중재자 (표 1)의 발표 할 예정 않는 한하지, 결과에 영향을 미친다.

괴사 BU.MPT 세포의 3. 준비 (프로토콜 2)

주 :이 프로토콜은 괴사의 유도 방법과 괴사 세포의 공급원으로서 가열 BU.MPT 세포에 특이. 대안으로, 다른 세포주 또는 일차 세포 배양은 괴사 유도 특정 세포 유형 및 방법에 대한 표준 프로토콜에 의해 유도 된 괴사, 괴사 성 세포의 공급원으로 사용될 수있다.

  1. 100mm 직경 멸균 폴리스티렌 진공 기체 플라즈마 처리 된 조직 배양 접시 상에 통과 한 후에 BU.MPT 세포를 가습 5 %에 합류 허가 조건 (V / V) CO 2 분위기 성장 (즉에서 배양 매체 A 37 ºC에서 1.2.3 절에서 설명한 바와 같이 접시 당 10 ㎖).
  2. 상기 부착 성 세포를 단층 배양 배지 B로 3 회 씻어 사용린스 당 10 ㎖.
  3. 및 마그네슘 + 2 5 분 동안 접시 당 1 mL의에서 - 무료 DPBS - 1 배 칼슘 + 2에서 5 mM의 EDTA를 첨가하여 세포를 분리합니다. 분리 된 세포를 함유하는 EDTA 함유 배지를 흡인하고 15 mL의 멸균 폴리스티렌 원심 분리 튜브에 세포 현탁액을 추가한다.
  4. 및 마그네슘 + 2 세척 당 - 무료 DPBS - 칼슘 + 2 10 mL에 10 500 XG에 분, 재 부유에 대한 세포를 원심 분리하여 세 번 씻으십시오.
  5. 마지막 세척 후, 용액 당 ~ 5 × 106 세포에 신선한 배양액 B의 셀을 정지.
  6. 부드럽게 세포 현탁액을 10 분마다 볼 텍싱을 수욕에서 45 분 동안 70 ºC에 셀을 가열하여 괴사를 유도한다.
  7. 37 ° C에서 (v / v)의 CO 2 분위기 가습 5 %에서 2 시간 동안 세포를 품어. 조심스럽게 세포 현탁액마다 15 분을 소용돌이.
  8. 적절한 네브라스카의 별도의 준비를 사용하여 유동 세포 계측법에 의해 괴사의 유도를 확인crotic 세포 (또는 이러한 목적을 위해 일부 셀을 확보함으로써), 앞서 설명한 6,9,10,15.
    괴사 세포는 세포막을 파열 있고, (생존 세포에 비해) 증가 셀 크기의 PI 양성 세포로 나타납니다합니다. 현재의 프로토콜을 사용하여 일반적인 준비는 ≥ 95 % 괴사 세포가 포함되어 있습니다. 대안 적으로, 괴사 막 무결성 손실의 유도는 트리 판 블루 염색에 의해 확인 될 수있다.

BU.MPT 응답자 세포의 4. 준비 (프로토콜 3)

참고 :이 프로토콜은 응답 세포의 소스로 BU.MPT 세포 고유의 것입니다. 대안으로, 다른 세포주 또는 일차 세포 배양은 리스폰 더 세포로서 사용될 수있다. 실험 사용하기 전에 정지는 실험실 내에서 표준화 된 프로토콜에 의해 밤새도록 유도 할 수있다.

  1. 그들이 달성 할 때까지 ~ 접시 당 10 ㎖에 배지 A의 허용 조건에서 멸균 100mm 조직 문화 요리 BU.MPT 세포 성장85 %의 합류.
  2. 대기음 배양액 A, 린스 당 10 ㎖의 세포를 배양 배지 B로 3 회 헹군다. 가습 5 %에서 18 ~ 24 시간 동안 밤새 비 허용 조건 (v / v)의 CO 2 분위기 세포를 혈청이 굶어 (즉, 접시 당 10 ㎖에서 39 ºC 문화 매체 B에서) 섹션 1.2에 기술 된 바와 같이, 0.4 순서대로 정지를 유도합니다. 또한, FBS없이 하룻밤 배양 배지 B 혈청 굶주린 세포 전에 하루 39 ºC에서 배양 배지 B 플러스 10 %에서 (v / v)의 FBS를 세포를 성장.
  3. 각 실험 조건 합류 BU.MPT 세포의 별도의 조직 배양 접시 레이블.
  4. 어떤 세포, 세포 사멸 세포, 또는 괴사 세포 하나에 30 분 동안 자신의 노출 다음 15 분 동안 어느 차량이나 표피 성장 인자 (EGF)와 가능한 BU.MPT 응답자의 자극, 다음 여섯 조건을 포함합니다.
    참고 사균에 노출되면 자극 또는 위장관의 활동 수준을 억제 할 수도 있고벤은 분자 신호. 자극은 가장 낮은 기준선 이상 검출 (예를 들어, EGF의 부재) 억제가 가장 높은 기준선에서 검출 된 반면 (예를 들면, EGF의 존재). 죽은 세포 자극의 효과가 선험적 알려지지 때문에,이 부재와 EGF의 존재 모두에 모든 연구를 수행 할 것을 권장한다.

사멸 및 괴사 세포 (프로토콜 4)와 응답자 세포의 5 자극

  1. 대기의 미리 라벨링 요리에서 기음 문화 매체 B (혈청 결핍) BU.MPT 응답 세포 (프로토콜 3).
    주 : 비 허용 조건에서 하룻밤 문화, BU.MPT 세포가 마우스 신장 PTEC의 차 문화처럼 행동해야합니다 후.
  2. 100mm 접시 당, 다음 중 하나의 2 mL를 넣어 : 문화 매체 B (NO 세포); 배양 배지 B의 용액 당 ~ 5 × 106 세포 (프로토콜 1)에서 사멸 세포 현탁액; ML의 전 당 또는 괴사 세포 현탁액 ~ 5 × 10 6 세포N 배양 배지 B (2 프로토콜).
    1. 균등 100mm의 접시 위에 죽은 세포의 2 ML의 정지를 배포하고,이를 최소한으로 해결하는 시간을 유지합니다. 이를 위해 응답자 세포 요리 전면 넓은 팁 피펫 드롭하여 사균 현탁액 드롭을 배포한다. 안정 시간을 최소화하고 죽은 세포의 응집을 방지 사이의 타협으로이 용액의 부피를 사용합니다.
      참고 사균 현탁액의 사용을 자극은 더 상세 (표 2 및 고찰) 후술되는 특수 고려 사항들을 수반있다.
    2. ~ 10 × 106 세포를 포함하는 융합 100mm 접시에 용액 당 ~ 5 × 106 세포에 사균의 2ml를 첨가하여 1 ~ 1 데드 - 투 - 응답 세포의 비율을 달성한다. 대안 적으로, 임의의 관찰 된 이벤트 신호의 용량 의존성을 확립하기 위해서, 종파 진보적 희석하여 연속적으로 응답자 세포 사망의 비율을 다양프로토콜 1과 2에서 제조 된 죽은 세포 현탁액의 URE 매체 B.
  3. 조심스럽게 다음 가습 5 % (v / v)의 CO 2 분위기에서 37 ºC에서 부화, 요리를 소용돌이 친다.
  4. 30 분 후, 배양 접시의 미리 라벨링에있어서, 비히클 또는 50 나노 EGF 하나와 응답자 세포를 자극한다.
  5. 가습 5 % (V / V) CO 2 분위기하에 37 ℃에서 15 분 동안 인큐베이션.
  6. 빙냉 1X DPBS 5 mL를 첨가 접시를 선회하고, 세정액을 흡인함으로써 사균을 씻어. 세 번 반복합니다.
  7. 즉시 추가 처리를 위해 얼음에 응답자 세포 요리를 배치합니다.
  8. 세포 용 해물을 준비
    1. 다음을 포함하는 세포 용해 완충액을 제조 1 × 트리스 식염수 (TBS), 10 mM의 나트륨 피로 포스페이트, w 0.5 % / V 옥시 콜레이트 / SDS V, 10 % 글리세롤, 25 mM의 불소화 나트륨 w 0.1 % 완충.
      1. , 용해 셀 산업사에서 주어진 정확한 순서에 다음을 추가하기 직전icated 농도 : 소형 EDTA 프리 프로테아제 억제제 칵테일 (1 정 10 용해 완충액 1 ㎖ 당)를 10 % (v / v) 트리톤 X-100, 1 mM 디티 오 트레이 톨 (DTT), 1 mM의 페닐 메탄 설 포닐 플루오 라이드 (PMSF), 10 mM의 나트륨 오르토 바나 데이트.
    2. 단계 5.7에서 얼음에 신선한 자극 응답 세포의 100mm 접시 당 얼음처럼 차가운 세포 용해 완충액 700 μL를 추가합니다. 셀 스크레이퍼로 세포를 긁어, 1.5 ML의 마이크로 튜브에 미리 냉장 용 해물을 전송합니다. 15 분 동안 얼음에 튜브를 유지한다.
    3. 20 Hz에서, 지속 시간이 1 초 미만 각각 10 펄스 얼음에 초음파 처리 해물. 이 샘플을 과열 수있는 바와 같이, 가스 / 액체 계면에서 거품의 생성을 피한다. 완벽에 초음파기를 전환하기 전에 해물을 포함하는 모세관에 소니 케이 프로브를 체험하고, 해물에서 프로브를 제거하기 전에 초음파기를 전환합니다.
    4. 4 ° C에서 10 분 동안 20,000 XG에 원심 분리기, 신선한 사전 냉장 모세관에 상층 액을 전송및 저장 -70에서 ºC.
    5. 이전 6,9,10,15 설명 된대로, 해물의 상층 액에 겔 전기 영동 및 면역를 수행합니다.

6. 반투과성 폴리 카보네이트 멤브레인을 사용하여 대상과 응답자 간의 직접 물리적 접촉을 방지 (프로토콜 5)

  1. 한 가지 예외, 프로토콜 3 항에 BU.MPT 응답자 세포를 준비; 폴리스티렌 멸균 조직 배양에서 세포 성장을 12 웰 클러스터를 처리 하였다.
  2. 선택된 웰에서 죽은 응답자 세포 간의 물리적 상호 작용을 방지하기 위해 0.4 ㎛의 폴리 카보네이트 막을 포함하는 투과성 지원 시스템을 배치했다. 같은 실험에서 막없이 제어 우물을 포함합니다.
  3. 혈청 결핍 BU.MPT 응답자 세포의 실험 우물에서 대기음 배양 배지 B.
  4. 다음 수정을 사멸 또는 괴사 세포와 응답 세포의 자극에 대한 프로토콜 4를 따르십시오 :
    1. 당 잘 12 웰 클러스터는 다음 중 하나의 0.1 mL를 넣어 : 문화 매체 B (NO 세포); 배양 배지 B의 용액 당 ~ 5 × 106 세포 (프로토콜 1)에서 사멸 세포 현탁액; 괴사 또는 세포 현탁액 배양 배지 B의 용액 당 ~ 5 × 106 세포 (프로토콜 2)에서.
      참고 : 12 웰 클러스터 합류도 포함 같이 ~ 0.5 × 106 세포에서의 사균 ~ 0.1 mL를 첨가하는 용액 당 5 × 106 세포의 데드 - 투 - 응답 세포의 비율을 산출 ~ 1 : 1이다.
    2. 투과 지원 시스템을 포함하는 우물, 투과 지원 시스템 내에서 0.4 μm의 폴리 카보네이트 막의 상단에있는 죽은 세포를 추가, 그래서 죽은 응답 세포 사이에 직접적인 물리적 상호 작용이 없다.

사이토 칼라 D와 탐식 7. 억제 (프로토콜 6)

  1. 프로토콜 3 항에 BU.MPT 응답자 세포를 준비합니다.
  2. 다이 메틸의 골격 억제제 사이토의 D 준비일 술폭 4 ㎎ / ㎖ (× 1000)에서 (DMSO). BU.MPT 응답자 세포 위해 미리 라벨링 요리를 추가하거나 차량의 10 μL (DMSO) 또는 사이토 (D)의 10 μL를 배양액 B. 10ml에 4 μg / ML의 최종 농도를 달성
    참고 : BU.MPT 세포와 대식 세포주에 의한 사이토의 D, 식균 작용이 농도에서 ≥90 % (9, 10)에 의해 억제되었다.
  3. 가습 5 % (v / v)의 CO 2 분위기에서 37 ºC에서 2 시간 동안 품어.
  4. 세포 사멸이나 괴사 세포 응답 세포의 자극에 대한 프로토콜 4를 따릅니다.
  5. 이전 9,10 바와 같이 적절하게 (이 목적을 위해 예약 또는 셀) 죽은 세포 응답자의 개별 제제를 사용하여 유동 세포 계측법에 의해 사균의 식세포 작용의 억제를 확인한다.

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결과

도 1에서는 타이밍 및 임계 사멸 세포의 제조에 관련된 단계 (프로토콜 1), 괴사 성 세포 (프로토콜 2) 및 세포 사멸 및 괴사 세포 현탁액과 응답자 세포의 자극 (프로토콜 4)을 도시하는 개략도를 제공한다.

도 2에서는, 세린 - 트레오닌 키나아제 글리코겐 합성 효소 키나제 3 (GSK-3), GSK-3α 및 GSK-3β의 두 이성체의 인산화에 사멸 세포의 효과를 보여주는 대표적인 결과를 제공한다. GSK-3α / β는 세포 증식 및 생존의 조절에 중요한 역할뿐만 아니라, 글루코스 대사의 중요한 역할을 갖는다. 세린-9에서 세린-21과 GSK-3β에서 GSK-3α의 인산화 차례로, 인산화를 감소 β-catenin이 안정화 증가에 이르게, 키나제 활성을 억제합니다. β-catenin이다음은 세포 ...

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토론

우리는 여기서 사멸 또는 세포 사멸의 다른 형태를받은 세포에 노출을 다음 생존 세포에서 유도 된 세포 내 신호 이벤트를 특성화하기위한 프로토콜을 제공한다. 프로토콜은 세포 사멸에 대한 노출은 가능한 응답자 세포 내에서 세포 내 신호 전달 경로를 변조 할 수있는 복수의 메커니즘을 강조한다. 이러한 메커니즘은 다음과 같습니다 상호 작용을 (죽은 세포 또는 창고 소포 및 마이크로 소포에 분자 또는 표면의 결정을 브리지를 통해 종종 세포 사멸 몸을 불리는) 응답자 세포의 특정 수용체와; (심지어 또는 세포 외 세대 27) 수용성 매개체의 방출; 상기 기계 식세포의 결합. 실질적인 탐식이 발생하는 상황에서는 고려 될 수있는 추가적인 메커니즘은 세포 사멸 또는 소체 (21) 내에서 농축 등의 마이크로 RNA와 같은 매개체의 전달이다. O에 비해 우리 프로토콜의 중요성THER 방법은, 사멸 세포 응답 세포 내 신호 전달을 조절 할 수있는 여러 메커니즘의주의 해부에있다. 주요 장점은 필요한 대부분의 기...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 José A. Arruda 박사와 시카고 일리노이 대학교 신장학 분과의 기관 기금(J. S. L.에게)의 기관 기금으로 전체 또는 부분적으로 지원되었으며, McGill University 의과대학과 McGill University Health Center 연구소의 자금 지원(J. R.에게)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Cell culture materials
DMEM, 1x with [4.5 g/L] glucose, ʟ-glutamine & sodium-pyruvateMediatech (Manassas, VA)10-013-CV
HyClone Fetal Clone II, fetal bovine serumGE Healthcare (Logan, UT)SH30066.03배양 매체에 10% (v/v) 
추가 A 페니실린-스트렙토마이신-글루타민, 100xLife Technologies (Grand Island, NY)10378-016배양 배지 A 및 B
γ-인터페론, 마우스 재조합, Escherichia coliCalbiochem, Millipore (Billerica, MA)에100 units/mL 추가407303 배양 배지 A
Falcon 폴리스티렌 조직 배양 처리 접시, 비발열성Corning (Durham, NC)353003멸균, 직경 100mm
Falcon 폴리스티렌 원심분리기 튜브, 원뿔형 바닥Corning(노스캐롤라이나주 더럼352095멸균, 15mL
트립신-EDTA, 0.05%, GibcoFisher(매사추세츠주 월섬25300062멸균, 100mL
Name<strong>CompanyCatalogComments
Chemicals and inhibitors
Staurosporine, from Streptomyces sp.시그마(미주리주 세인트루이스)S4400[1 μ g/mL] 세포사멸을 유도하기 위해 3시간 동안
표피 성장 인자(EGF), [1 mg/mL]Millipore(Billerica, MA)EA14050nM에서 사용하여 반응 세포 자극
UltraPure, 0.5 M EDTA, pH 8.0Life Technologies(Grand Island, NY)15575-0385mM을 사용하여 부착 세포 분리
Trypan blue solution, 0.4%MP Biomedicals(Santa Ana, CA)91691049사세포 염색
파라포름알데히드 용액, DPBSAffymetrix(Santa Clara, CA)19943세포 고정을 위해 1x DPBS에서 0.4%(v/v)를 사용합니다.
Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS), 1x, GibcoLife Technologies(Grand Island, NY)14040133원액
Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS), Ca2+- 및 Mg2+-free, 1x, GibcoLife Technologies (Grand Island, NY)14190367원액
Cytochalasin D, 4 mM in dimethyl sulfoxide (DMSO), from Zygosporium mansoniiSigma (St. Louis, MO)C8273사용 at [4 μ g/mL] 식균작용을 억제하기 위해
디메틸 설폭사이드(DMSO)시그마(세인트루이스, 미주리)D2650시토칼라신용 용매 D
[헤더]
세포 용해 완충 완충 성분
Tris-buffered saline(TBS), 10x, pH 7.4BioRad(Hercules, CA)1706435세포 용해 완충
Sodium pyrophosphateSigma-Aldrich (St. Louis, MO)221368세포 용해 완충액 10 mM
Sodium deoxycholateSigma-Aldrich (St. Louis, MO)D6750세포 용해 완충액 0.5% w/v
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)L3771 세포 용해 완충액의 경우 0.1% w/v
글리세롤시그마-알드리치(미주리주 세인트루이스)G5516세포 용해 완충액용 10%
불화나트륨시그마-알드리치(미주리주 세인트루이스)450022세포 용해 완충액용 25mM
완전 미니 EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일 정제Roche Diagnostics(인디애나폴리스, 인디애4693159001세포 용해 완충액, 완충액 10mL당 1
Triton X-100시그마-알드리치(세인트루이스, MO)T8787세포 용해 완충액용 10%
Dithiothreitol (DTT)MP Biomedicals (Santa Ana, CA)11DTT00005세포 용해 완충액용 1 mM
페닐메탄설포닐 플루오라이드 (PMSF)MP Biomedicals (Santa Ana, CA)4800263세포 용해 완충액용 1 mM
Sodium orthovandateMP Biomedicals (Santa Ana, CA)2159664세포 용해 완충액
용 10 mMNameCompanyCatalogComments
Equipment
Sorvall T6000B centrifugeDu Pont (Wilmington, DE)T6000B
Fisher Tissuemat, waterbath Fisher (Waltham, MA)
Sonic Dismembrator (sonicator), model 100Fisher (Waltham, MA)
Miscellaneous
Cell counting chamber, NeubauerHawksley (Lancing, Sussex, UK)AC2000
Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit IIMillipore (Billerica, MA)CBA059for PI and Annexin V staining to determine of apoptosis(세포사멸 단계를 결정하기 위한 PIC 및 Annexin V 염색)
Eppendorf microcntrifuge tubes, 1.5 mLSigma-Aldrich (St. Louis, MO)T9661
Transwell 투과성 지지체, 0.4 μ m 폴리카보네이트 멤브레인Corning (Corning, NY)3413무균, 폴리스티렌, 조직 배양 처리
NameCompanyCatalogComments
Antibodies
포스포-글리코겐 합성효소 키나아제-3&알파;/&베타; (GSK-3&알파;/&베타;) (Ser21/9), 다클론 항체Cell Signaling Technology9331토끼 다클론 항체
글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소(GAPDH) 단클론 무기구( (14C10) )Cell Signaling Technology2118토끼 단클론 항체
))에서 4%는 액 나폴리스)정

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