고해상도 호흡율은 투과성이 그대로 세포에서 미토콘드리아 기능을 평가하는

미토콘드리아 특히 아데노신 삼인산 (ATP)를 생산하기 위해 산소를 사용하여, 세포 에너지 대사에서 중요한 역할을 수행. 그들은 세포 사멸에 여러 인간의 질병에 연루되어있다. 미토콘드리아의 산화 적 인산화 (OXPHOS)은 산소 소모와 ATP 합성과 전자 전달계 따라 전자 수송층을 결합한다. 미토콘드리아 트리 카르 복실 산 (TCA) 사이클은 니코틴 아미드 아데닌 디 뉴클레오티드 (NADH)과 플라 빈 아데닌 디 뉴클레오티드 등 에너지 풍부한 화합물 (FADH _2)에 단백질, 탄수화물과 지방의 변환에 참여하고있다. NADH와 FADH _2의 전자가 다음 호흡 전자 수송 체인 단백질 복합체로 전송됩니다 (I는 IV합니다) 미토콘드리아 내막에 있습니다. 또한, 두 개의 다른 산화 환원 경로가 전송 체인을 전자에 전자를 전송할 수 있습니다 : ⅰ) 미토콘드리아 전자 전송 flavoprotein (ETF)를 내부 미토의 행렬면에 위치지방산 β 산화에서 chondrial 막 및 소모품 전자; 및 ⅱ) 디 히드 록시 아세톤 포스페이트를 글리세로 산화하고, 미토콘드리아의 전자 전달계에 전자를 공급 글리세 미토콘드리아 탈수소 효소. 복합 IV (최종 전자 수용체)가 2 분자의 물에 산소를 변환 한 산소 분자에 전자를 전송한다. I는 IV로 호흡 전자 전달계 착체에서 전자의 이동이 미토콘드리아 내막에 걸쳐 전기 화학적 구배를 설정 막간 공간 미토콘드리아 매트릭스에서 양성자의 흐름으로 결합된다. 이후, 미토콘드리아 복잡한 V (ATP 신타) 위로 미토콘드리아 매트릭스 내로 수소 이온 및 ATP를 왕복 분자를 합성한다. OXPHOS 함수를 얻을 수있는 다양한 기술과 다양한 미토콘드리아 호흡 상태를 사용하여 생체 내 및 시험관 내에서 평가할 수있다. 격리 된 미토콘드리아 다음 respirato에서RY 상태가 측정 될 수있다 : ⅰ) 기부 미토콘드리아 호흡 (주 1) 미토콘드리아 호흡 쇄 단지 특정 기질을 첨가 한 후, ⅱ) 산소 소비량 (주 2) ⅲ) 최대 미토콘드리아 산소 소비량의 농도를 포화의 추가 후에 아데노신이 인산 (ADP) (주 3), ATP로 변환 ADP 소비 (후 ⅳ) 휴식 호흡) (주 4). 그대로 셀에 다음과 같은 호흡 상태를 측정 할 수있다 : ⅰ) 기저 세포의 산소 소비 내생 기판과 ADP의 존재, ⅱ) oligomycin의 존재 기저 세포의 산소 소비 (oligomycin를 구분 호흡) 및 oligomycin에 민감한 호흡 (ATP 회전율) antimycin A 및 로테 논을 첨가 한 후, III) FCCP 비결 호흡 및 IV) 비 미토콘드리아 호흡. 투과성이 셀에서, 전자 전달계 착체와 ADP의 특정 기질을 첨가하고, 최대 복잡한 의존 호흡 등급의 수UCH와 같은 복잡한 I-은, II-및 IV-따라 호흡 속도는 측정 할 수있다.

세포 호흡의 측정은 단지 I-IV, 미토콘드리아 무결성과 에너지 대사 ^{1, 2, 3에} 특정 미토콘드리아의 호흡 능력에 중요한 통찰력을 제공합니다. 고정밀, 해상도 및 감도가 미토콘드리아의 산소 소비량의 측정을 가능하게하는 장치 중 하나가 고해상도 oxygraph ^4이다. 고해상도 oxygraph 장치는 주입 포트와 두 개의 챔버를 포함하고, 각 챔버는 폴라 산소 센서가 장착된다. 셀룰러 또는 격리 된 미토콘드리아 현탁액은 호흡계에 지속적으로 교반된다. 미토콘드리아 복잡한 활동 미토콘드리아 기능, 기판 및 억제제를 평가하기 위해 표준 프로토콜 다음 추가 할 수 있습니다. 기질 및 억제제 주입 INT으로 적정 할 수있다상기 oxygraph의 실, 산소 소비 속도 O를 소프트웨어를 사용하여 계산하고 세포의 수를 초당 picomoles로 표시됩니다. 고해상도 호흡율이 증가 감도 및 손상 또는 투과성이 세포와 같은 생물학적 시료의 작은 숫자와 함께 작동하는 기능을 포함하여 전통과 기존의 폴라 산소 전극 장치에 비해 몇 가지 장점을 제공한다. 또한, 각 장치는 두 개의 챔버를 포함하고, 호흡 속도는 산소 농도의 비교를 동시에 기록 할 수있다. 고해상도 oxygraph는 전통적인 산소 폴라 전극 장치에 비해 장치의 챔버에서의 산소 환원 누설의 이점을 갖는다. 최근 셀룰러 산소 소비를 측정하기 위해 개발 된 또 다른 장치는 96 웰 세포 유동 분석기 ^5이다. 세포 외 플럭스 분석기 대신 폴라 센서의 형광을 갖추고 있습니다. 외의 장점고해상도 oxygraph I이다)은 II)가 24 및 고 처리량 스크리닝을위한 96 개의 웰 플레이트에서 산소 소비를 측정하는 것이 가능하고, 크게 자동화 된 장치에 비해 플럭스 분석 따라서 생물학적 샘플의 하부 양을 필요 및 ⅲ) 휴대 당분 플럭스의 추가 측정이 가능합니다. 고해상도 oxygraph에 비해 세포 외 플럭스 분석기의 단점) 장치와 같은 비 재사용 형광 플레이트와 같은 소모품의 고비용 I를, 그리고 ⅱ) 분석 당 네 화합물 / 웰 주사있다 따라서 시스템은 기판 uncoupler 억제제 적정 프로토콜 가능하지 않습니다.

본 연구에서는 미토콘드리아 호흡을 결정하는 고분해능 호흡율을 사용한다. 셀룰러 산소 소비 실험을 위해, 세포 complexe에 전자를 공급하기위한 외인성 ADP와 산화 미토콘드리아 기질의 진입을 허용하는 투과성이있다호흡기의의. 이 방법은 (많은 기판 세포 impermeant 있습니다) 손상 세포에 비해 뚜렷한 장점입니다 개인 미토콘드리아 단지 호흡 용량의 해부를 할 수 있습니다. 그러나, 세포막 permeabilization은 세포 외 배지로 평형화 세포질 및 세포 외 공간 매질 (세포질 용질 세척) 및 세포 내 공간의 조성물의 장벽을 방해 할 것이다. 손상 된 세포 투과성이 세포의 단점 중 하나는 세제 과량 셀 permeabilization 중에 사용될 경우 미토콘드리아 외막이 손상 될 수 있다는 것이다. 완전한 세포, 기저은 그대로 세포의 결합 및 비 결합 된 호흡을 측정 할 수있다. 이 방법은 통합 된 셀의 호흡 기능을 재생하며 최대 미토콘드리아 전자 견인에 대한 정보를 제공하는 외인성 기질 및 ADP의 첨가없이 그대로 세포의 산소 소비량을 평가RT 용량 ^{6, 7.} 투과성이 셀 위에 그대로 셀의 장점 중 하나는 셀룰러 환경이 파괴되지 않고, 미토콘드리아는 세포의 전체 성분과 접촉한다는 것이다. 세포 원형질막 Permeabilize 하시려면 위해 이러한 디기 토닌 세제 ^8을 사용 하였다. 디기 토닌 과도한 양이 이용되는 경우에는, 미토콘드리아 외막 완전성이 손상 될 수있다. 세포 투과성이 손상되지 않도록 미토콘드리아 외막의 무결성을 확인하기 위해, 디기 토닌 적정 셀룰러 ​​permeabilization 대한 최적 농도를 결정하기 위해 수행된다. 이 실험을 위해, 세포 호흡 배지에 재현 탁하고 디기 토닌 농도를 측정하고 미토콘드리아 기질 및 ADP 및 호흡 비율의 존재하에 호흡율으로 적정한다. 본래 비 투과성이 세포 호흡 mitocho의 존재 하에서 자극되지ndrial 기판 및 ADP. 그러나, 이후 단계적 디기 토닌 적정 플라즈마 막 점진적 permeabilization 수율 것이고, 최적의 디기 토닌 농도가 얻어진다. 이는 전체 permeabilization에 호흡까지의 증가에 의해 표시됩니다. 품질 및 미토콘드리아 외막 무결성 외인성 시토크롬 C ^{(2), (9)를} 첨가하여 확인할 수있다. 시토크롬 C는 미토콘드리아 전자 전달계 ^{10, 11, 12} 및 12 kDa의 전자 운반 단백질이다. 이 미토콘드리아 막간 공간에서 지역화, 복잡한 IV 복잡한 III에서 전자를 운반, 산소 소비에 참여하고있다. 미토콘드리아 외막이 손상되면, 시토크롬 C가 해제되고, 미토콘드리아의 산소 소비량이 감소된다. 외인성 시토크롬 C를 첨가하면, 미토콘드리아의 호흡에있는 증가는 나타낸다미토콘드리아 외막을 중단.

투과성이 세포, 기질 및 미토콘드리아 복잡한 활동의 억제에서 다양한 프로토콜 ^{3, 9} 다음에 추가됩니다. 미토콘드리아 호흡 복잡한 구동 비율을 조사하기 위해, 예를 들어, 다음의 프로토콜을 사용할 수있다. 세포 투과성으로 한 후, 제 복합체 I은 호흡 사슬 기판으로서 NADH를 생성 한 이후, ADP는 ATP (주 3 중으로 전환 첨가 복잡한 I.의 활성화를 자극 기판 말산 및 글루타메이트에 의해 자극 복잡한 I-따라 호흡). 안정된 신호가 도달하면, 로테 논은 (미토콘드리아 복잡한 내가 억제제) 로테 논은 FADH ₂ 숙시 네이트 뒤에 복잡한 I.을 억제하고 복잡한 II (주 3, 활성 복잡한 II에 의존하는 호흡)을 활성화하기 위해 투여된다. 복잡한 IV 의존 호흡 제 복합체 III을 측정하기 위해,의존성은 호흡 antimycin의 A (미토콘드리아 복합 III 억제제)을 추가함으로써 억제된다. 그 후, 복잡한 IV에 의존하는 호흡은 아스코르브 산염과 tetramethylphenylendiamine (TMPD)을 투여하여 자극한다. TMPD 따라서 최대 복잡한 IV 의존 호흡률 (주 3) 이전에 아 지드 화 나트륨, 미토콘드리아 복잡한 IV 억제제의 첨가 후 호흡 속도를 감산함으로써 계산되고, 호흡 버퍼에 자동 산화 할 수있다. 호흡 실험은 대조군 (자극되지 않은 세포)로서 병렬 하나의 oxygraph 두 챔버, 다른 함유 자극 세포에서 수행 될 수있다. 이들 산소 소비량이 oxygraph 챔버 측정 전에 물론, 세포는 미토콘드리아 기능에 영향을주는 약물, 예를 들면 다양한 방법으로 사전 처리 될 수있다. 이 프로토콜은 개별 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체의 기능 시험을 허용한다. 또한, 하나의 최대 ADP를 자극 측정 할호흡 팔미 형태 외인성 지방산을 이용하여 투과성이 세포의 (상태 3). (1 몰비 팔미 테이트 : BSA 6)이 프로토콜에서, 소듐 팔미 테이트의 농축 주식 울트라 지방산 자유 소 혈청 알부민 (BSA)와 접합된다. 이후, 제 디기 토닌 및 미토콘드리아 호흡으로 투과성이있다 세포 카르니틴의 첨가에 의해 평가되고, ADP (주 3 최대 호흡)을 첨가하여 팔미 테이트. 그리고,이 상태 oligomycin 4 (주 4O) 및 호흡 조절 비율 (RCR 값)을 모방하기 위해 추가 상태 3 / 상태를 40으로 산출된다. β 산화는 전자 전송 flavoprotein 및 β 히드 록시 - 부티 릴 CoA 탈수소 효소에 의해 전자 전달계에 전달되는 전자 어느 FADH ₂ NADH의 (TCA 사이클에 진입) 아세틸 CoA를 제작 및 생성을 촉진한다. 미토콘드리아 팔미-BSA 프로토콜 지방 검사 연구자에 의해 사용될 수있다 지방산 대사의 중심이며 바와타이 산 산화. 그대로 세포에서 활성화 및 미토콘드리아 복잡한 활동의 억제제는 다른 프로토콜 ^{6, 9} 다음에 추가됩니다. 이들 실험의 경우, 외래의 기판 부재의 비 투과성이 셀들의 제 산소 소비량 (호흡률 인산화)을 측정한다. 그리고, 비 인산화 호흡률은 미토콘드리아 ATP 합성 효소의 억제제이다 oligomycin 첨가 후에 측정된다. 그 후, protonophore 보닐 시안화 P-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)을 다양한 농도로 투여하고 최대 비 결합 미토콘드리아 호흡 속도가 측정된다. 이러한 FCCP 같은 Protonophores는 chemiosmotic 그라데이션을 방출하는 양성자의 수동 이동을 허용, 내부 막의 수소 이온 투과성의 증가를 유도 할 수있다. 양성자 투과성의 증가는 산화 호흡 (NO ATP 생산)으로 분리 및 O의 증가를 유도xygen 소비. 이후, 로테 논 및 antimycin A는 미토콘드리아 호흡 억제 첨가하고, 비 미토콘드리아 호흡 다른 호흡 속도로부터 감산된다.

산소 소모 속도는 (닫힘 산소 실) 체적 고유 산소 유량을 나누어 계산 IO ₂ pmol의의 X 초 ^-1 X ^10-6 셀 (백만 셀 당 산소 유량) JV, O로 표현할 수있다 ₂ pmol의의 X 초 ^-1 X ml의 ^-1] 세포 농도로 세포 챔버 (볼륨 당 세포의 수 [10 ⁶ 세포 ∙ ml의 ^{1]) 15.} 셀 당 질량으로 나눈 셀 질량 특정 산소 플럭스 JO ₂ pmol의의 X 초 ^-1 X 밀리그램 ^-1] 셀당 흐름이고, IO ₂ pmol의의 X 초 ^-1 X ^10-6 셀], [밀리그램 ∙ 10 ⁶ 셀] 또는 볼륨 별 플럭스, JV, O ₂ pmol의의 X 초 ^-1 X ㎖의 ^-1], 부피 당 질량으로 나눈 값매화 [mg의 ∙ ml의 ^1]. _{JO이 세포} 단백질, 세포 건조 중량 또는 부피당 산소 플럭스이다.

고해상도 호흡율을 사용하여, 본 연구에서는, III) 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체를 외인성 시토크롬 C를 사용하여) I를 전체 세포 세포막 permeabilization 최적 디기 토닌 농도 (디기 토닌 적정 분석), ⅱ) 미토콘드리아 외막 무결성 I를 결정하는 프로토콜을 기술 외인성 ADP 미토콘드리아 호흡 쇄 기판과의 존재 디기 토닌 - 투과성이 인 HepG2 세포에서의 II 및 IV 최대 호흡 속도 IV) 기저 외인성 기질의 첨가없이 결합되어 완전한 세포의 최대 비 결합 호흡 (최대 전자 수송 능력) 및 ADP는 일체형 셀의 호흡 기능을 재생.

1. 세포 배양

1. 배양 인간 간암 인 HepG2 세포 ^6cm (25) 인큐베이터 (5 % CO에서 37 ° C에서 10 %의 열 - 불 활성화 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신을 함유하는 둘 베코 변형 이글 배지 ^{(DMEM)에서이} 세포 배양 플라스크 _2, 95 % 공기) (시딩 밀도 : 1 × 10 ⁶ 세포 25 당 cm ² 세포 배양 플라스크, 37 ° C 배양기에서 배양 시간 : 48 시간, 포화 상태의 세포 밀도 : 25 cm 당 4-5 × 10 ⁶ 세포 ² 세포 배양 플라스크).
2. 세포가 90 % ~ 95 %에 합류 할 때 실험을 수행합니다.

폴라로그래피 산소 센서 2. 높은 해상도 호흡율 교정

1. 피펫 2.1 oxygraph 챔버로 호흡 버퍼 용액과 연속적으로 안정한 산소 플럭스 신호까지 1 시간 동안 37 ° C에서 챔버 (700 RPM)에 존재하는 자기 교반 막대를 사용하여 상기 버퍼 교반폴라로 그래프 산소 센서를 얻을 수있다.
   주 : 각 oxygraph 챔버 측정 산소 농도 내 폴라로그래피 산소 전극과 각 챔버 내에 산소 소비량 (유량)을 구한다. 산소 농도 및 산소 소모 속도 (광속)은 데이터 획득 및 분석 소프트웨어를 사용하는 컴퓨터에 온라인으로 실시간으로 표시된다.
2. 제조자의 프로토콜에 따라 ¹⁴ 폴라 산소 센서의 공기 보정을 수행한다.
   주 : 공기 포화 실험 온도에서 미디어 호흡 매체와 산소 농도 폴라 산소 센서의 교정 번만 매일 아침에 수행된다. 이후 미디어 챔버 및 호흡 신선한 배지에 재현 탁시키고 세포를 제거 할 수는 oxygraph 챔버에 첨가하고, 호흡 속도가 측정된다. 첫 번째 실험 후, 챔버는 세정 될 수 있으며, 추가의 실험 시리즈 t에서 수행 될 수있다추가 교정없이 그는 동일한 챔버.

부착 세포, 계산 세포의 3 트립신

1. 실험 날에, 25cm ² 세포 배양 플라스크에서 DMEM 대기음.
2. 인산 완충 식염수 5 ㎖ (PBS)로 배양 플라스크에서 세포 배양 단층을 헹군다.
3. 피펫 0.5 배양 플라스크에서 세포 단층에 (37 ° C의 물 중탕에서 37 ℃로 데워진) 트립신 용액 25 ㎎ / ㎖의 용액 및 인큐베이터 (5 % CO _2에서 37 ° C에서 5 분 동안 배양 95 % 공기).
4. DMEM이 세포 배양 플라스크에서 분리 된 세포에 10 % FBS를 함유하고 피펫 팅하여 세포를 정지 피펫 5 ㎖.
5. 전송 실온에서 350 × g으로 5 분에서 15 mL의 원심 분리 튜브에서 원심 분리로 세포를 재현 탁시키고 상등액을 가만히 따르다.
6. 호흡 버퍼 ⁽¹³⁾ (T 수 1)의 1 ml의 세포 펠렛을 재현 탁.
난> 세포 계수기를 사용하여 세포를 세어 1 × ¹⁰⁶ 세포 / ml의 최종 농도로 호흡 버퍼에이를 재현 탁. 세포 호흡 속도가 휴대폰 번호로 정규화되기 때문에, 정확하고 정밀한 셀 카운터 세포를 계산합니다.

4. 고해상도 호흡율

1. 공기 교정 (만 회 실행이 2.1-2.2 단계) 후, oxygraph의 챔버로부터 호흡 매체를 흡인 챔버 단계 3.7에서 세포 현탁액 (1 × ¹⁰⁶ 세포 / ml) 2.1 ml에 추가한다.
2. 스토퍼를 삽입하여 oxygraph 실을 닫습니다.
3. 계속해서 37 ℃에서 챔버 (700 RPM)에 존재하는 자기 교반 막대를 이용하여 세포를 교반 안정된 산소 플럭스 신호가 얻어 질 때까지 5 ~ 10 분 동안 세포 호흡을 기록한다.
   주 : 산소 농도 및 산소 플럭스 신호는 데이터 수집 및 분석을위한 소프트웨어를 사용하는 컴퓨터에 온라인으로 실시간으로 표시되는S = "외부 참조"> 14.
4. 그 후, 다음과 같은 프로토콜을 사용하여 스토퍼 티탄 주입 포트를 통해 미토콘드리아 호흡 기질 및 억제제를 주입.

호흡율에 의해 본래 세포의 5 디기 토닌 적정

1. 단계 프로토콜 4.3-4.1에서 설명한 절차 후 oxygraph 챔버 함유 세포 현탁액 (1 × ¹⁰⁶ / ㎖)를 준비한다.
2. 주사기를 사용하여 챔버 스토퍼 티탄 주입구 세포 현탁액을 포함하는 oxygraph 챔버에 0.2 밀리미터 로테 논 (0.2 μM) '주의'2 μl를 주입하고 안정한 산소 플럭스 신호가 얻어 질 때까지 5 ~ 10 분 동안 세포 호흡 기록 .
   주 : 다음 단계에서의 모든 주사가 ​​주사기를 사용하여 스토퍼 티탄 주입 포트를 통해 수행된다. 로테의 첨가는 선택적이다 (이것은 역 전자 흐름을 방지 함) 및 디기 토닌 적정 실험을 생략 할 수 있고, 볼6.3 단계.
3. oxygraph 챔버에 1 M 숙시 네이트 (10 mM)을 20 μl를 주입하고 안정한 산소 플럭스 신호가 얻어 질 때까지 5 ~ 10 분 동안 세포 호흡을 기록한다.
4. oxygraph 챔버에 0.5 M ADP (2.5 mM)을 10 μl를 주입하고 안정한 산소 플럭스 신호가 얻어 질 때까지 5 ~ 10 분 동안 세포 호흡을 기록한다.
5. oxygraph 챔버 내로 2 mM의 디기 토닌 (2 μM) 2 μl를 주입하고, 산소 안정된 신호가 얻어 질 때까지 2-5 분 동안 세포 호흡을 기록한다.
6. 또 디기 토닌 oxygraph 챔버로 2 mm의 2 μL를 주입하고 안정된 산소 신호가 달성 될 때까지 2-5 분 동안 세포 호흡을 기록한다.
   주 : 세포 디기 토닌 단계적 첨가 셀룰러 산소 소비량의 증가 및 증가 산소 플럭스 신호를 유도 할 것이다.
7. 챔버에 2 mM의 디기 토닌 단계적 (2-4 μm의 각 단계)의 2-4 μl를 주입 계속합니다. 각 단계 후, 2-5m에 대한 세포 호흡을 기록안정된 산소 플럭스 신호가 달성 될 때까지이다.
   주 : 산소 유량 신호가 최대 레벨에 도달 디기 토닌의 상기 주사 호흡 속도를 증가시키지 않는 경우 디기 토닌 분사 중지. 독자는 단계 6.2 및 실험은 다음 프로토콜 7.2 자신 시약 및 사용 얻어진 최적 디기 토닌 농도를 사용하여 실험실에서 디기 토닌 최적 농도를 결정한다.

미토콘드리아 외막 무결성 6. 평가 : 시토크롬 C

1. 단계 프로토콜 4.3-4.1에서 설명한 절차 후 oxygraph 챔버 함유 세포 현탁액 (1 × ¹⁰⁶ / ㎖)를 준비한다.
2. 세포 현탁액 (1 × ¹⁰⁶ / ㎖)를 함유하는 oxygraph 챔버에 8 밀리미터 디기 토닌 (8 μM) 2 μl를 주입하고 5 분간 세포를 Permeabilize 하시려면.
3. oxygraph 챔버에 1 M 숙시 네이트 (10 mM)을 20 μl를 주입 한 세포 respirat 기록안정된 산소 플럭스 신호가 얻어 질 때까지 5 ~ 10 분 동안 이온.
4. oxygraph 챔버에 0.5 M ADP (2.5 mM)을 10 μl를 주입하고 안정한 산소 플럭스 신호가 얻어 질 때까지 5 ~ 10 분 동안 세포 호흡을 기록한다.
   주 : 세포 ADP의 첨가는 단지 I 자극 산소 소비량의 증가를 유발하고, 산소 유량 신호 증가 및 안정화 될 것이다.
5. oxygraph 챔버에 4 mM의 시토크롬 C (10 μM)의 5 μL를 주입하고 안정한 산소 플럭스 신호가 얻어 질 때까지 5 ~ 10 분 동안 세포 호흡을 기록한다.
6. 마지막 4 ㎎ / ㎖ oligomycin (2 μg의 / ㎖) 1 μl를 주입하고 안정한 산소 플럭스 신호가 도달 할 때까지 세포 호흡을 기록한다.

7. 최대한 ADP 자극 호흡 투과성이 인 HepG2 세포의 (주 3)

1. 단계 프로토콜 4.3-4.1에서 설명한 절차 후 oxygraph 챔버 함유 세포 현탁액 (1 × ¹⁰⁶ / ㎖)를 준비한다.
2. 세포 현탁액을 포함하는 oxygraph 챔버에 8 밀리미터 디기 토닌 (8 μM) 2 μl를 주입하고 5 분간 세포를 Permeabilize 하시려면.
3. 말산 0.8 M (5 mM)을 12.5 μL와 oxygraph 챔버로 글루탐산이 M (10 mM)을 10 μl를 주입한다. 안정된 산소 플럭스 신호까지 녹음 세포 호흡이 달성된다.
4. oxygraph 챔버에 0.5 M ADP (2.5 mM)을 10 μl를 주입하고, 산소 유량의 신호가 증가 할 때까지 세포 호흡 기록 및 안정화시킨다.
   주 : 세포 ADP의 첨가는 산소 소비의 증가 및 증가 산소 플럭스 신호를 유도 할 것이다.
5. oxygraph 챔버에 0.2 밀리미터 로테 논 (0.2 μM) '주의'2 μl를 주입하고, 산소 유량의 신호가 감소 할 때까지 세포 호흡 기록 및 안정화시킨다.
6. 그 후, oxygraph 챔버로 1 M 숙시 네이트 (10 mM)을 20 μL를 투입하고, 산소 유량의 신호가 증가 할 때까지 세포 호흡 기록및 안정화시킨다.
7. 그리고, oxygraph 챔버로 A (5 μM) '주의'antimycin 5mM의 2 μl를 주입하고, 산소 유량의 신호가 감소 할 때까지 세포 호흡 기록 및 안정화시킨다.
8. 이어서 0.8mm의 아스 코르 베이트 (1 mM)을 2.5 μl를 주입 한 직후 oxygraph 챔버로 0.2 mM의 TMPD (0.25 mM)을 2.5 μl를 주입하고, 산소 유량의 신호가 증가 할 때까지 세포 호흡 기록 및 안정화시킨다.
9. 마지막 oxygraph 챔버에 1 M 소듐 아자 이드 (5 mM)을 '주의'10 μL를 투입하고, 산소 유량의 신호가 감소 할 때까지 세포 호흡 기록 및 안정화시킨다.

본래 세포의 8 산소 소비

1. 단계 프로토콜 4.3-4.1에서 설명한 절차 후 oxygraph 챔버 함유 세포 현탁액 (1 × ¹⁰⁶ / ㎖)를 준비한다.
2. oxygraph 챔버 포함하는 세포 현탁액의에 4 ㎎ / ㎖ oligomycin (2 μg의 / ㎖) 1 μl를 주입안정된 산소 플럭스 신호 D까지 기록 세포 호흡이 달성된다.
3. 나중에 oxygraph 챔버 내로 FCCP 0.2 밀리미터 (0.1 μM) '주의'1 μl를 주입하고, 산소 유량의 신호가 증가 할 때까지 세포 호흡 기록 및 안정화시킨다.
4. oxygraph 챔버 내로 FCCP 0.2 밀리미터 (0.4 μM) 3 μl를 주입하고, 상기 산소 유량 신호가 증가 될 때까지 세포 호흡 기록 및 안정화시킨다.
5. 산소 플럭스 신호는 다음의 최대 수준의 더 이상의 증가하고, 도달 할 때까지 oxygraph 챔버로 (챔버 내에서 0.1~2 μM 최종 농도) 0.2 내지 1 mM의 FCCP 중 1-3 μl를 주입하여 0.1 μM 내지 0.3 단계 FCCP를 적정 하락이 시작됩니다.
   주 : 산소 신호가 최대 레벨에 도달 할 때 시작 감소 FCCP를 분사 중지.
6. 이어서, 0.2 밀리미터 로테 논 (0.2 μM)와 챔버로 A (5 μM)를 antimycin 5mM의 2 μL 2 μL를 주입. 녹음 호흡 t까지고 산소 플럭스 신호가 감소하고 안정화시킨다.

디기 토닌 적정 실험 : 셀룰러 Permeabilization을위한 최적의 디기 토닌 농도의 결정

디기 토닌의 적정 인 HepG2 세포 투과성으로위한 최적 농도를 결정하기 위해 수행된다. 이들 실험의 경우, 디기 토닌가 로테 논, 숙신산 (미토콘드리아 복합체 II 기판)와 ADP의 포화 량의 존재하에 완전한 세포에서 적정하고, 호흡 속도 기준선 각 후에 측정된다 (복합체 II 의존 상태 3 유도) 적정 (도 1a 및도 1b). 이 실험의 결과는 디기 토닌의 부재 하에서, 세포 호흡 미토콘드리아 기질 및 ADP의 존재 하에서 자극되지 매우 낮은 그대로 비 투과성이 세포 호흡 것을 보여준다. 그러나, 디기 토닌 단계적으로 첨가하면, 세포 세포막은 투과 가능하고 mitochon되고숙시 네이트와 ADP가 세포를 입력 할 때 drial 호흡 (복잡한 II에 의존하는 상태 3) 전체 permeabilization까지 증가한다. 결과는 8-12 μM의 디기 토닌의 농도 permeabilization가 인 HepG2 세포의 ADP 자극 호흡에 최적입니다 것으로 나타났습니다. 디기 토닌 과도한 양이 이용되는 경우에는, 미토콘드리아 외막 완전성이 손상 될 수있다. 도 1에 도시 된 바와 같이, 디기 토닌 과도한 양이 손상 미토콘드리아 외막 무결성을 나타내는 복소 II 의존 상태 3 호흡의 감소를 유도.

현재와 다음 프로토콜에서, 모든 산소 소모 속도는 폐쇄을 (체적 고유 산소 유량을 나누어 계산 IO 2 pmol의의 X 초 -1 X 10-6 셀 (백만 셀 당 산소 유량)으로 표현되는 산소 챔버), JV, O 2 pmol의의 X 초 -1 X ml의 -1] 휴대 정광로 셀 챔버 내의 이온 (부피 당 세포의 수 [106 셀 X ml의 -1]) 15.

도 1의 디기 토닌 적정 인 HepG2 세포 투과성으로위한 최적 농도를 결정한다. 청색 라인은 산소 농도를 나타내며; 적색 라인은 산소 유량 (산소 농도 기울기)를 나타낸다. 세포가 이용 가능한 산소를 사용하여, 상기 산소 농도가 시간이 지남에 따라 감소한다. 산소 소비 pmol의 / (셀 X 초 수)로 표현된다. 고해상도 호흡율에서 (A)는 트레이싱 미토콘드리아 복합체 II 의존 호흡 (실험 1)의 경우, 기판으로서 ADP와 숙신산 디기 토닌 사용. SD ± 수단 (4) 개별 실험 (B) 미토콘드리아 호흡 속도는 발표했다./ 54,985 / 54985fig1large.jpg "대상 ="_ 빈 "을 업로드>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Optimal (최적) 디기 토닌 농도를 사용하여 미토콘드리아 외막 무결성 평가

외부 미토콘드리아 막 무결성에 최적의 디기 토닌 농도 (8 μM)의 효과를 평가하기 위해 세포 디기 토닌과 미토콘드리아 외막의 무결성과 투과성이되어이 숙시 네이트의 후속 첨가 한 후 미토콘드리아 호흡의 측정에 따라 시험 (미토콘드리아 복잡한 II 의존 상태 2 휴식 ADP의 부재 호흡) ADP (ADP는 ((ADP는 oligomycin 첨가 한 후, 시토크롬 C의 존재)에서 상태 3 호흡 II 의존 복잡한 자극 억제제를 상태 3 호흡 II - 의존성) 및 사이토 크롬 C 복잡한 자극 도 2에 도시 된 바와 같이, ATP 합성 효소)의 모습을 모방 4.

그림 2 : 시토크롬 C는 디기 토닌 (8 μM)을 처리 한 세포의 호흡을 개선하지 않습니다. 고해상도 호흡율를 이용하여 사이토 크롬 c 시험 주제 호흡 추적. 세포는 존재에서 10 mM의 숙시 네이트 (주 2), 2.5 mM의 ADP (주 3) 10 μM 시토크롬 C (주 3의 후속 첨가 한 후 호흡 속도의 측정에 따라 시험 8 μM의 디기 토닌과 미토콘드리아 외막의 무결성과 투과성이있다 상태 4. 호흡 속도를 모방하는 2 μg의 / ㎖ oligomycin을 첨가하여 시토크롬 c)는 pmol의 / (SEC로 표현 X 만 달러n 개의 세포). CII : 복잡한 II. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

디기 토닌 고농도 사용 미토콘드리아 외막 무결성 평가

디기 토닌의 매우 높은 농도는 미토콘드리아 외막 무결성을 손상시킬 수 있음을 입증하기 위해, 우리는 디기 토닌의 고용량을 사용하여 실험을 수행 하였다. 이 실험을 위해, 세포를 40 μM의 디기 토닌 대신 8 μM, 그리고 미토콘드리아 외막의 무결성과 투과성이되어이 숙시 네이트의 후속 첨가 한 후 미토콘드리아 호흡의 측정에 따라 시험 (미토콘드리아 복잡한 ADP의 부재 상태 2 호흡을 쉬고 II-에 따라 다름) , ADP와 시토크롬 C (ADP 복잡한 II 의존 상태 3 호흡을 자극) (ADP 복잡한 II-D 자극oligomycin의 존재 (도 3)의 4 상태를 모방 oligomycin 첨가 한 후 ependent 상태 시토크롬 C의 존재하에 3 호흡). 이 실험의 결과는 시토크롬 C의 손상 미토콘드리아 외막 무결성을 나타내는 미토콘드리아 외막에서 시토크롬 C의 손실을 나타내는 디기 토닌 고용량으로 처리 된 세포의 호흡 향상을 보여준다.

그림 3 : 디기 토닌의 높은 용량 (40 μM)은 미토콘드리아 외막의 무결성을 손상시킨다. 기판으로서 숙신산을 사용 호흡율 고해상도에서 트레이싱. 청색 라인은 산소 농도를 나타내며; 적색 라인은 산소 유량 (산소 농도 기울기)를 나타낸다. 세포가 이용 가능한 산소를 사용하여, 상기 산소 농도가 시간이 지남에 따라 감소한다. 산소 소비는 다음과 같이 표현된다pmol의 / (초 세포의 X 번호). 40 μM의 디기 토닌, 숙시 네이트 (10 mM)을 ADP (2.5 밀리미터), 시토크롬 C (10 μM) 및 oligomycin (2 μg의 / ㎖)의 후속 추가 표시됩니다. CII : 복잡한 II. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

최대 초과 외인성 기판을 이용하여 투과성이 호흡 인 HepG2 세포 (주 3) ADP 자극

복합 I-은 투과성이 인 HepG2 세포 (1 × 106 세포 / ml) 및 IV의 II- 의존성 ADP 최대 자극 호흡 (주 3) 성공적으로 과량 외인성 기질 (도 4)를 사용하여 측정된다. 이 실험을 위해, 세포에 기재된 기판 및 억제제의 후속 첨가 후 측정 디기 토닌 및 미토콘드리아 산소 소비율으로 투과성이있다

그림 4 : 투과성이 인 HepG2 세포의 최대 ADP 자극 호흡 (주 3)의 성공적인 측정. 호흡 속도는 pmol의 / (초 X 만 세포)로 표현된다. 세포는 8 μM의 디기 토닌 및 미토콘드리아 호흡 속도으로 투과성이있다은 복잡한 III을 억제 antimycin 복잡한 I, 숙신산 (주 3 복합체 II)를 억제하기 위해 글루타메이트와 말산 (주 3 복합체 I), 로테의 후속 첨가 후 측정 및 아스 코르 베이트 / TMPD 아 지드 화 나트륨은 복잡 IV를 억제한다. 복잡한 IV 호흡 (주 3)이전과 아 지드 화 나트륨을 첨가 한 후, 산소 소모를 감산하여 해석된다. CI : 복잡한 I, CII : 복잡한 II, CIV : 복잡한 IV. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

최대한 ADP 자극 호흡의 실패 측정 투과성이 인 HepG2 세포의 (주 3)

복합 I-은 II- 및 IV 의존성 ADP 최대 자극 호흡 투과성이 인 HepG2 세포 (1 × 106 세포 / ml)의 (주 3) 성공적으로 과량 외인성 기질 (도 5)를 사용하여 측정되지 않는다. 이 실험을 위해, 세포는도 5에 기술 된 바와 같이 기판 및 억제제의 후속 첨가 후 측정 디기 토닌 및 미토콘드리아 산소 소비율으로 투과성이있다. 도 5에 도시 된 바와 같이, 속도는도 4에 도시 된 결과에 비해 세포 투과성이 매우 낮다. 감소 호흡 레벨에 대한 가능한 설명은 이전 실험에서 미토콘드리아 억제제와 oxygraph 챔버의 오염이다. 이러한 antimycin 및 로테 논 등의 미토콘드리아 억제제는 에탄올에 용해하며 oxygraph 챔버와 스토퍼에 충실 할 수 있습니다. 따라서 oxygraph 챔버 및 스토퍼는 각 실험 후 광범위하게 세척해야한다.

그림 5 : 투과성이 인 HepG2 세포의 최대 ADP 자극 호흡 (주 3)의 실패 측정. I- 복합체의 실패한 실험의 주제 호흡 흔적은 II- 고해상도 호흡율을 이용하여 투과성이 인 HepG2 세포의 최대 ADP 자극 호흡 (주 3) IV는 구동. 호흡 속도는 다음과 같이 표현된다pmol의 / (초 X 백만 셀). 세포는 8 μM의 디기 토닌 및 미토콘드리아 호흡 속도으로 투과성이있다은 복잡한 III을 억제 antimycin 복잡한 I, 숙신산 (주 3 복합체 II)를 억제하기 위해 글루타메이트와 말산 (주 3 복합체 I), 로테의 후속 첨가 후 측정 및 아스 코르 베이트 / TMPD 아 지드 화 나트륨은 복잡 IV를 억제한다. 복합 IV 호흡 (주 3) 이전에 아 지드 화 나트륨을 첨가 한 후, 산소 소모를 감산하여 해석된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

본래 세포의 결합과 비 결합 호흡

인 HepG2 세포의 기저 산소 소비는 oligomycin (oligomycin를 구분 호흡)와 FCCP의 순차적 인 추가 (그림 6)의 존재를 측정한다. BASAL 세포 호흡 속도는 내인성 세포 기질의 존재하에 본래 인 HepG2 세포의 산소 소비를 나타내며, 세포 ATP 요구에 따라 변경할 수있다. Oligomycin를 구분 호흡 속도는 세포의 ATP 회전율을 나타내고 기초 내생 호흡 속도에서 oligomycin를 구분 호흡 속도를 빼서 계산되어 세포 호흡 및 oligomycin에 민감한 호흡 속도를 누출 나타냅니다. FCCP uncoupler의 화학 물질이 순차적으로 기록 된 다른 농도와 최대 비 결합 호흡에 추가됩니다. 본 실험 조건에 대한 최대 비 결합 미토콘드리아 호흡 속도 (최대 전자 전달계 용량) 0.9-1.2 μM FCCP에서 획득된다. 결과는 그대로 인 HepG2 세포에서 FCCP의 이상성 활동을 보여줍니다. 따라서, 각각의 실험 조건에 대해, 최대 비 결합 FCCP는 호흡률을 얻기 위해 적정한다. 커플 링되지 호흡 조절 비율 (uRCR)는 FCCP 나누어 계산oligomycin의 존재 호흡률 의해 비결 호흡률. Oligomycin에 민감한 호흡 (ATP 회전율) oligomycin를 구분 기초 내생 호흡에서 호흡 속도를 빼서 계산한다. 기저 호흡률하여 oligomycin 성 호흡 속도를 나누어 계산 ATP를 합성하는 데 사용되는 미토콘드리아의 산소 소비량의 비율을 나타내는 효율성 결합. 실험의 끝에서, 비 미토콘드리아 호흡 속도를 얻기 위해 미토콘드리아 전자 전달계 억제제를 첨가하고, 비 미토콘드리아 호흡 속도는 모든 결과에서 감산된다. 도 6에 나타낸 실험에서, 비 - 미토콘드리아 호흡 속도가 26 pmol의 / (초 X 백만 셀)의 기초 호흡 속도가 48 pmol의 / (초 X 백만 셀)이다, oligomycin 구분하지 호흡률 7 pmol의 / (SEC X 만 세포), oligomycin에 민감한 호흡 (ATP 회전율) 41 pmol의 / (초 X 만 세포)와 Couplin의g 효율 0.85.

그림 6 : 결합 그대로 세포의 결합되지 호흡. 인 HepG2 세포의 기저 산소 소비의 대표적인 호흡기 흔적 oligomycin (oligomycin 구분하지 호흡) 고해상도 호흡율을 사용 FCCP의 첨가 순서의 존재 하에서 측정 하였다. 안정된 신호가 도달하면 그 후, 호흡 모든 결과에서 감산된다 로테와 antimycin A를 첨가하고, 나머지 배경 호흡 (비 미토콘드리아 호흡)이 억제된다. 산소 소비 pmol의 / (셀 X 초 수)로 표현된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1 : 호흡 버퍼 조성물.

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