Method Article

고해상도 호흡율은 투과성이 그대로 세포에서 미토콘드리아 기능을 평가하는

DOI:

10.3791/54985

⸱

February 8th, 2017

 , 
1Department of Intensive Care Medicine, Inselspital, Bern University Hospital, University of Bern

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

고해상도 호흡율은 미토콘드리아의 산소 소비를 결정하는 데 사용된다. 이것은 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체 '(I-IV) 호흡 속도, 최대 미토콘드리아 전자 전달계 용량 및 미토콘드리아 외막 무결성을 결정하기위한 간단한 기술이다.

Abstract

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고해상도 산소 그래프는 생물학적 샘플(온전하고 투과화된 세포, 조직 또는 분리된 미토콘드리아)에서 매우 높은 해상도와 감도로 폐쇄 챔버 시스템에서 세포 산소 소비량을 측정하는 장치입니다. 고해상도 산소 그래프 장치에는 두 개의 챔버가 장착되어 있으며 폴라로그래픽 산소 센서를 사용하여 산소 농도를 측정하고 각 챔버 내의 산소 소비량을 계산합니다. 산소 소비율은 소프트웨어를 사용하여 계산되며 세포 수당 초당 피코몰로 표시됩니다. 각 고분해능 산소계 챔버에는 주입 포트가 있는 스토퍼가 포함되어 있어 원형질막 투과를 위한 효과적이고 최적의 농도를 결정하기 위한 기질-분리-억제제 적정 또는 세제 적정 프로토콜에 이상적입니다. 이 기술은 다양한 세포 유형에서 호흡을 측정하는 데 적용할 수 있으며 미토콘드리아 품질 및 무결성, 최대 미토콘드리아 호흡 전자 전달 시스템 용량에 대한 정보도 제공합니다.

Introduction

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미토콘드리아 특히 아데노신 삼인산 (ATP)를 생산하기 위해 산소를 사용하여, 세포 에너지 대사에서 중요한 역할을 수행. 그들은 세포 사멸에 여러 인간의 질병에 연루되어있다. 미토콘드리아의 산화 적 인산화 (OXPHOS)은 산소 소모와 ATP 합성과 전자 전달계 따라 전자 수송층을 결합한다. 미토콘드리아 트리 카르 복실 산 (TCA) 사이클은 니코틴 아미드 아데닌 디 뉴클레오티드 (NADH)과 플라 빈 아데닌 디 뉴클레오티드 등 에너지 풍부한 화합물 (FADH 2)에 단백질, 탄수화물과 지방의 변환에 참여하고있다. NADH와 FADH 2의 전자가 다음 호흡 전자 수송 체인 단백질 복합체로 전송됩니다 (I는 IV합니다) 미토콘드리아 내막에 있습니다. 또한, 두 개의 다른 산화 환원 경로가 전송 체인을 전자에 전자를 전송할 수 있습니다 : ⅰ) 미토콘드리아 전자 전송 flavoprotein (ETF)를 내부 미토의 행렬면에 위치지방산 β 산화에서 chondrial 막 및 소모품 전자; 및 ⅱ) 디 히드 록시 아세톤 포스페이트를 글리세로 산화하고, 미토콘드리아의 전자 전달계에 전자를 공급 글리세 미토콘드리아 탈수소 효소. 복합 IV (최종 전자 수용체)가 2 분자의 물에 산소를 변환 한 산소 분자에 전자를 전송한다. I는 IV로 호흡 전자 전달계 착체에서 ....

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Protocol

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1. 세포 배양

  1. 배양 인간 간암 인 HepG2 세포 6cm (25) 인큐베이터 (5 % CO에서 37 ° C에서 10 %의 열 - 불 활성화 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신을 함유하는 둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM)에서이 세포 배양 플라스크 2, 95 % 공기) (시딩 밀도 : 1 × 10 6 세포 25 당 cm 2 세포 배양 플라스크, 37 ° C 배양기에서 배양 시간 : 48 시간, 포화 상태의 세포 밀도 : 25 cm 당 4-5 × 10 6 세포 2 세포 배양 플라스크).
  2. 세포가 90 % ~ 95 %에 합류 할 때 실험을 수행합니다.

폴라로그래피 산소 센서 2. 높은 해상도 호흡율 교정

  1. 피펫 2.1 oxygraph 챔버로 호흡 버퍼 용액과 연속적으로 안정한 산소 플럭스 신호까지 1 시간 동안 37 ° C에서 챔버 (700 RPM)에 존재하는 자기 교반 막대를 사용하여 상기 버퍼 교반폴라로 그래프 산소 센서를 얻을 수있다.
    주 : 각 oxygraph 챔버 측정 ....

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Results

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디기 토닌 적정 실험 : 셀룰러 Permeabilization을위한 최적의 디기 토닌 농도의 결정

디기 토닌의 적정 인 HepG2 세포 투과성으로위한 최적 농도를 결정하기 위해 수행된다. 이들 실험의 경우, 디기 토닌가 로테 논, 숙신산 (미토콘드리아 복합체 II 기판)와 ADP의 포화 량의 존재하에 완전한 세포에서 적정하고, 호흡 속도 기준선 각 후에 측정된다 (복합체 II 의존 상태 3 유도) 적정 (도 1a 및도 1b). 이 실험의 결과는 디기 토닌의 부재 하에서, 세포 호흡 미토콘드리아 기질 및 ADP의 존재 하에서 자극되지 매우 낮은 그대로 비 투과성이 세포 호흡 것을 보여준다. 그러나, 디기 토닌 단계적으로 첨가하면, 세포 세포막은 투과 가능하고 mitochon되고숙시 네이트와 ADP가 세포를 .......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 프로토콜의 목적은 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체 '(I-IV) 호흡 속도, 최대 미토콘드리아 전자 전달계 용량 및 미토콘드리아 외막 무결성을 측정하는 고해상도 호흡율을 사용 하였다.

본 프로토콜 내에서 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 우선, 세포 산소 소모 속도는 일반적으로 세포의 개수로 표준화되어있다 (pmol의 / [셀 초 X 참조). 따라서, 셀룰러 산소 소비를 모니터링하기 전에, 세포 수가 정확하고 신뢰성있는 측정을 가능하게하는 장치를 사용하는 것이 중요하다. 본 프로토콜에서 자동 세포 계수기 (단계 물질의 프로토콜과 표 3.7) 사용되어왔다. 특히 투과성이 셀에 두 번째 중요한 단계는, 셀 (스텝 프로토콜 3.6)에 재현 탁된다 투과성이있는 호흡 버퍼의 선택이다. 휴대 permeabilization는 intracellula의 손실을 유도 할 수 있기 때문에R 이온, permeabilization 중에 사용 된 배지는 세포 내 환경과 호환되는 것이 매우 중.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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이 연구는 스위스 국립과학재단(Swiss National Science Foundation, Grant nº 32003B_127619)의 지원을 받았습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ADPSigmaA 4386Chemical
Antimycin ASigmaA 8674Chemical, 에탄올에 용해
AscorbateMerck1.00127Chemical
BSASigmaA 6003Chemical
FCCPSigmaC 2920Chemical, 에탄올에 용해
Countess 자동 세포 계수기 Thermo Fisher Scientificn/a자동 세포 계수 기기
Cytochrome cSigmaC 7752화학
DigitoninSigmaD 5628화학, DMSO
DMEMGibco 31966021매체
EGTAfluka3779화학 FBS
Gibco26010-074매체 성분
글루타메이트시그마G 1626화학
HepesSigmaH 7523화학
KClMerck1.04936화학
KH2PO4Merck1.04873화학
물질 K-락토바이오네이시그마L 2398화학 MgCl
2 SigmaM 9272화학
O2k-코어: Oxygraph-2K Oroboros Instruments10000-02고해상도 호흡 측정기
OligomycinSigmaO 4876화학 물질, 에탄올에 용해
페니실린 - 스트렙토 마이신Gibco15140122화학 물질
아지드 화 나트륨시그마S2002화학
물질 로테논시그마R 8875화학, 에탄올
에 용해석시네이시그마S 2378케미컬
타우린시그마T 8691케미컬
TMPD시그마T 3134케미컬
트립신시그마T 4674케미컬
에 용해 트 트

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435 (2), 297-312 (2011).
  2. Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).
  3. Zhang, J., et al.

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High resolution RespirometryMitochondrial FunctionPermeabilized CellsIntact CellsOxygen ConsumptionSubstrate TitrationInhibitor TitrationDigitonin PermeabilizationMitochondrial IntegrityRespiratory Chain

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