X 선 결정학, 생물 물리학 및 기능 분석 실험을 사용하면 메커니즘 집행 T 세포 암 항원의 수용체 인식을 확인하는 방법

요약

여기에서는 인간 백혈구 항원에 의해 제시되는 T-세포 수용체와 종양 항원 사이의 상호 작용의 본질이 T-세포 기능을 어떻게 지배하는지 결정하기 위해 실험실에서 일반적으로 사용하는 방법을 설명합니다. 이러한 방법에는 단백질 생산, X선 결정학, 생물 물리학 및 기능적 T 세포 실험이 포함됩니다.

초록

인간 CD8+ 세포독성 T 림프구(CTL)는 종양 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있습니다. 이 기능을 수행하기 위해 세포 표면 발현 T 세포 수용체(TCR)는 인간 백혈구 항원(HLA) 제한 종양 유래 펩타이드(pHLA)를 기능적으로 인식해야 합니다. 그러나, 당사와 다른 연구자들은 대부분의 TCR이 종양 항원에 최적으로 결합하지 않는다는 것을 보여주었습니다. 이러한 잘못된 인식을 정의하는 분자 메커니즘을 밝히는 것은 이러한 단점을 우회하는 새로운 표적 치료법의 개발에 도움이 될 수 있습니다. 실제로, 이러한 분자적 이해가 결여된 현재의 치료법은 보편적으로 효과적이지 않다. 여기에서는 TCR과 pHLA 간의 상호 작용 특성이 T 세포 기능을 어떻게 제어하는지 결정하기 위해 실험실에서 일반적으로 사용하는 방법을 설명합니다. 이러한 방법에는 용해성 TCR 및 pHLA의 생성과 X선 결정학, 생물물리학적 분석 및 pHLA 다량체를 사용한 항원 특이적 T 세포 염색을 위한 이러한 시약의 사용이 포함됩니다. 이러한 접근 방식을 사용하고 구조 분석을 통해 TCR과 pHLA 간의 상호 작용을 수정한 다음 이러한 수정이 T 세포 항원 인식에 어떤 영향을 미치는지 테스트할 수 있습니다. 이러한 발견은 이미 여러 암 항원의 T세포 인식 메커니즘을 명확히 하는 데 도움이 되었으며 새로운 암 치료를 위한 변형된 펩타이드 및 변형된 TCR의 개발을 지시할 수 있습니다.

서론

X 선 결정학은 왔으며, 리간드 - 수용체 상호 작용의 성질을 이해하기 위해 매우 강력한 기술이 될 것. 원자 수준에서 이러한 상호 작용을 시각화함으로써뿐만 아니라 가능 다양한 생물학적 과정을 관리하는 분자 메커니즘을 밝히기 있지만 직접 치료 효과를위한 접촉 인터페이스를 변경하는 것도 가능하다. 이러한 표면 플라즈몬 공명과 (이름 단지 몇) 등온 적정 열량 측정법과 같은 기법을 결합 변형이어서 결합 친화력 상호 작용 동역학 및 열역학에 직접적인 영향을 평가할 biophysically 분석 될 수있다. 마지막으로, 중요한 세포 유형에서 기능 실험을 수행하여, 수용체 - 리간드 상호 작용에 대한 수정의 분자와 기능적 영향 상세한 그림이 매우 특정한 기계적인 정보를 제공하고, 얻을 수있다. 전반적으로, 이러한 종류의 방법 억제 ​​유효화 원자 해상도의 화상을 제공 할 진단 및 치료의 발전을위한 부수적 인 의미와 함께 작동하는 방법을 생물학적 시스템의 mination.

우리 실험실에서 일상적으로자가 면역, 병원체, 암 인간 T 세포 매개 면역 수용체 공부 이러한 기술을 사용하여 이식시. 여기서, 우리는 T 세포 수용체 (TCR) 및 인간 백혈구 항원 (HLA) -restricted 종양 유래 펩티드 (pHLA) 사이의 상호 작용에 의해 매개되는 암 인간 CD8 ⁺ T 세포 반응에 초점을 맞춘다. CD8 ⁺ T 세포가 암 세포를 표적으로 할 수 있지만, 우리는 이전과 다른 항암 TCR도는 동족 suboptimally pHLA ^{(1, 2)에} 결합하는 것을 도시 한 때문에 중요하다. 따라서, 많은 실험실 변경 시도 어느 TCR ^{3, 4, 5} 또는 펩티드 리간드 ⁶면역 원성을 증가시키기 위해 더 좋은 표적 암세포 클래스 = "외부 참조"> ^{(7, 8).} 그러나, 이러한 접근은 항상 효과적이지 오프 타겟 독성 ^{4, 9, 10과} 같은 심각한 부작용을 가질 수있다. 암 항원의 T 세포 인식을 지배하는 분자 메커니즘을 탐구 또한 연구는 이러한 부족을 극복하는 것이 중요 할 것이다.

본 연구에서, 우리는 가장 일반적 * 0201 (HLA-A에 의해 제공 100 (gp100)을 당 단백질 분화 멜라닌 세포 항원의 단편에 특이적인 CD8 ⁺ T 세포에 의해자가 흑색 종 세포에 대한 반응, gp100 _280-288에 집중 -expressed 인간 pHLA 클래스 I). 이 항원은 흑색 종의 면역 요법을 위해 널리 연구 대상이었다 및 발린이 알라닌으로 대체되는 소위 "헤테로 클리"펩티드 개발되었으며앵커 위치 9시 pHLA 안정성 ^(11)을 향상시킬 수 있습니다. 이 방법은 시험 관내에서 흑색 종의 CTL 반응의 유도를 향상시키는 데 사용하고, 성공적으로 임상 시험 ^(12)에 사용되어왔다. 그러나, 펩티드 잔기 변형 클리닉 ^6,13- 대부분 heterolitic 펩티드의 불량한 효능 입증 T 세포 특이성의 예측 효과를 가질 수있다. 사실, Glu3가 알라 치환 된 펩타이드 잔류 물에 gp100 _280-288의 또 다른되어 헤테로 형태는, gp100 _280-288 - 특정 T 세포 ^{(14), (15)의} 클론 집단에 의해 인정을 폐기. 우리는 이전에 펩타이드 앵커 잔류 물에 사소한 변화가 실질적으로 예측할 수없는 방법으로 ^{6, 16} T 세포 인식을 변화시킬 수 있음을 증명하고있다. 따라서,이 연구는 빌드에 초점을 맞춘CD8 ⁺ T 세포의 TCR도 pHLA와 사이의 상호 작용의 gp100 어떻게 수정을 인식하는 방법의보다 상세한 그림을 보내고은이 기능에 영향을 미칠 수있다.

여기, 우리는 HLA-A * 0201 (A2-YLE)에 의해 제공 gp100 _280-288에 대한 특정이 TCR도의 고순도, 수용성 형태뿐만 아니라 pHLA의 자연 및 변경 양식을 생성합니다. 이러한 시약은 헤테로 클리 A2-YLE 형태뿐만 아니라 unligated 형태 돌연변이 pHLAs 두 복잡한에서 인간 TCR의 삼원 원자 구조를 해결하기 위해 단백질 결정을 생성하기 위해 사용되었다. 그런 다음에 자세하게 생물 물리학 적 실험을 수행하여 TCR도에 치환 펩타이드의 효과를 입증하기 위해 펩티드 주사 방식을 사용 하였다. 마지막으로, 유전자 변형 CD8 + T 세포주를 생성하는 다양한 펩티드 변형의 생물학적 효과를 테스트하는 기능 실험을 수행하기 위해, A2-YLE 특정 TCR도 중 하나를 표현하는 재 - 프로그램. 이러한 데이터는도 MODI 입증fications 예측할 노크에 TCR 바인딩 및 T 세포 인식 폐지 인접 펩타이드 잔류에 영향을 미칠 수있는 TCR 결합 모티프의 외부에있는 잔류 물을 펩티드. 우리의 결과는 흑색이 중요한 치료 표적 T 세포 인식을 기본 구조 메커니즘의 제 1 예를 나타낸다.

프로토콜

1. 단백질 발현

1. 앞서 ^{17, 18에서} 상세히 설명한 바와 같이, 가용성 TCR도 및 pHLAs의 생성에 유전자 작 제물을 만든다. 5 '를 BamH1 및 3'는 pGMT7 벡터에 삽입 EcoR1 제한 사이트 구성 각 디자인합니다.
2. 4 ℃에서 50 내지 200 NG / 5 분 동안 대장균의 5 μL와 μL 플라스미드 1 μL를 배양하여 관심의 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 pGMT7 유래 플라스미드 벡터로 대장균 로제타 (DE3) pLysS를 변환 42 ℃에서 2 분, 4 ℃에서 5 분, 50 밀리그램 / L의 카르 베니 실린이 보충하는 LB 한천 플레이트에 37 ℃에서 하룻밤 접시.
3. 개별 식민지를 선택하고 정지 할 때까지 100 μM의 카르 베니 실린이 보충 된 37 ° C, 220 rpm으로 30 ㎖ TYP 미디어에서 (16g /의 L 트립 톤, 16g / L의 효모 추출물, 및 5g / L HK ₂ O _4)로 성장 광학 드에 도달nsity 0.4 내지 0.6의 (OD _600).
4. 3 시간 동안 0.5 mM의 이소 프로필 β-D-1- 티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG)를 도입하여 5 ㎖ 분취 량의 단백질 생산을 유도한다. 와 소듐 도데 실 설페이트 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE) 분석 유도없이 현탁액 20 μL를 유지하고, 겔을 염색.
5. 100 μM의 카르 베니 실린이 보충 TYP 1 L에 스타터 배양액을 첨가하고, 현탁액을 0.4 내지 0.6 사이에서 OD _(600)에 도달 _할 때까지 단계 130에서 전술 한 바와 같이 세포를 성장한다.
6. 0.5 mM의 IPTG와 함께 3 시간 동안 단백질 발현을 유도한다. 3,000 XG에서 20 분 동안 세포를 원심 분리기 조심스럽게 상층 액을 붓는다.
7. 2의 간격을 이용하여 30 분간 60 %의 전력에 대해, 얼음에 초음파 처리를 용해 완충액 40 ㎖의 펠렛을 용해시키고 (10 % 글리세롤, 10 mM 염화 마그네슘,의 MgCl _2, 150 mM의 NaCl을 10 mM 트리스, pH를 8.1) 0.1 g / L DNase를 30 분 동안 실온 (RT)에서 배양한다.
8. 가 SUS 치료세척 완충액 100㎖로 봉입체 (IB)의 형태로 함유하는 단백질 연금 (0.5 % 트리톤 X-100, 50 mM 트리스, pH가 8.1, 100 mM의 염화나트륨 및 10 mM의 EDTA).
9. 4 ° C에서 20 분 8,000 XG에 대한 샘플을 원심 분리기 조심스럽게 상층 액을 붓는다. 다시 서스펜션 버퍼 100 ㎖의 펠렛 일시 중지 재 (100 mM의 NaCl을 50 mM 트리스, pH가 8.1 mM의 EDTA, pH가 8.1, 10), 원심 분리기 이전 8,000 XG에 조심스럽게 상층 액을 붓는다.
10. 마지막으로, 구아니딘 완충액 10ml에 펠렛을 용해 (6 M 구아니딘, 50 mM 트리스, pH가 8.1, 2 mM의 EDTA, pH가 8.1, 100 mM의 염화나트륨)과 분광 광도계를 사용하여 280 nm에서의 단백질 농도를 측정한다.

2. pHLA 및 TCR 리 폴딩

1. pHLA의 refolds 들어, 최종 부피 수욕에서 37 ℃에서의 IB를 (비오틴 태그 또는 HLA-A2) β2m의 IB 30 ㎎, 30 분 동안 펩티드 4 mg의 HLA-A2의 30 mg을 혼합 10 mM의 디티 오 트레이 톨로 보충 구아니딘 완충액 6 mL를(DTT).
2. 미리 냉각 된 HLA의 폴딩 완충액 1 L의 이전 믹스를 희석하여 단백질을 리 폴딩을 시작 (50mM 트리스, pH가 8.1 400 밀리미터 L 아르기닌, 2 mM의 EDTA, pH가 8.1 6 밀리미터 시스 테 아민, 4 밀리미터 시스 타민).
3. HLA 3 시간 동안 4 ℃에서 교반 접힘 후 12.4 kDa의 MWCO로 (분자량 컷 - 오프) 투석 튜브를 전송하고 10 mM 트리스, 산도 8.1의 20 L에 대해 24 시간 동안 두 번 투석 둡니다.
4. TCR에의 refolds를 들어, 10 mM의 DTT 보충 구아니딘 완충액 6 mL의 수욕에서 37 ° C에서 30 분 동안 TCR α 쇄의 IB 30 mg의 TCR β 사슬의 IB 30mg을 섞는다.
5. 미리 냉각 된 TCR의 폴딩 완충액 1 L로 변성 TCR 혼합물을 희석하여 단백질을 리 폴딩을 시작 (50mM 트리스, pH가 8.1, 2.5 M 우레아, 4 밀리미터 시스 타민 2 mM의 EDTA, pH가 8.1, 6 밀리미터 시스 테 아민) 3 대 시간.
6. 12.4-kDa의 MWCO 투석 튜브에 접힘을 전송하고 10 mM 트리스, 산도 8.1의 20 L에 대해 24 시간 동안 두 번 투석.
7. pHLA 또는 TCR 심판 모두 필터정제 단계는 0.45 ㎛ 멤브레인 필터를 사용하여 세.

고속 단백질 액체 크로마토 그래피 3. 정제 (FPLC)

1. 7.9 mL의에 필터링 된 폴딩 준비 (pHLA 또는 TCR를)로드, 50 μm의 음이온 교환 수지 컬럼은 10 mM 트리스, 유연하고 직관적 인 크로마토 그래피 시스템의 pH 8.1의 20 mL로 미리 평형.
2. (8 열 권 이상, 10 mM 트리스에서 0-500 밀리미터의 NaCl, pH를 8.1) 소금 그라데이션 5 mL / 분에서 단백질을 용출하고 1 ML의 분수를 수집합니다.
3. 함께 관심있는 단백질을 함유하는 분획을 풀링, SDS-PAGE에 의해 관심의 단백질에 대응하는 분획을 분석하고 4000 XG에서 20 분 동안 원심 분리에 의해 10 kDa의 500 μL에 MWCO 20 또는 10 kDa의 MWCO 4 그들을 집중 상기 플로우 스루 폐기.
4. 24 mL의 크기 배제 크로마토 그래피 칼럼에 2 mL를 주입 루프에 집중 단백질 제제를로드 앱으로 미리 평형ropriate 용출 완충액 : 인산 완충 식염수 (PBS), HBS (10 mM의 HEPES, pH 7.4의 150 mM의 염화나트륨, 3.4 mM의 EDTA, 0.005 % 계면 활성제), 또는 결정 완충액 (10 mM 트리스, pH가 8.1, 10 mM의 NaCl을 ).
5. 0.5 mL / 분 칼럼 부피 일 이상의 유동 속도에서의 단백질을 용출; SDS-PAGE에 의해 확인 관심의 단백질을 포함하는 1 ML의 분수를 수집합니다.
   참고 :이 방법은 수용성 PMEL17 TCR 및 gp100 TCR도뿐만 아니라 본 연구에 사용 된 pHLAs의 모든으로 생성하는 데 사용했다 : HLA-A를 * 0201와 YLEPGPVTA (A2-YLE), YLEPGPVTV (A2-YLE-9V), ALEPGPVTA (A2-YLE-1A), YLAPGPVTA (A2-YLE-3A), YLEAGPVTA (A2-YLE-4A), YLEPAPVTA (A2-YLE-5A), YLEPGAVTA (A2-YLE-6A), YLEPGPATA (A2-YLE- 도 7a) 또는 YLEPGPVAA (A2-YLE-8A).

4. 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 분석

1. CM5 센서 칩 ^(19)을 구비 한 분자 상호 작용의 분석 시스템을 사용하여 평형 결합 분석 또는 열역학적 분석을 수행한다.
2. F에 의해 CM5 칩을 활성화과 같은 1 : 10 μL / 분의 유속 및 25 ℃에서 10 분 동안 100 mM의 N- 히드 록시 숙신이 미드 (NHS), 400 mM의 1- 에틸 -3- (3- 디메틸) -carboiimide (EDC)의 혼합물 1 기음.
3. 네 플로우 셀에 상기 칩 표면에 결합 및 해제 1 M 에탄올 아민 염산염 100 μL를 사용하여 공유 결합에 의해로드 약 5000 반응 단위 (10mM의 아세트산에서 200 μg의 110 μL가 / ㎖, pH를 4.5) (RU) 스트렙 타비 딘 나머지 반응기.
4. pHLA 커플 약 500-600 RU 10 μL / 분의 느린 유속에서 CM5 센서 칩 (제조사에 의해 제공됨) 상용 버퍼 ~ 1 μM에서 칩 표면에 균일 한 분포를 보장한다.
5. 60 초 동안 (제조업체에서 제공) 상업 버퍼에 1 mM의 비오틴과 칩 표면을 포화.
6. 25 ° C에서 30 μL / 분의 높은 유량에 관련된 유동 - 세포 위에 가용성 TCR도 십 희석액을 주입한다.
7. 평형 결합 상수를 계산(K _D (E))은 비선형 곡선 맞춤 (Y = (P1x) / (P2 + X)) ^(20)를 이용하여 값.
   참고 : Y = 응답 장치, X = 애널리스트 농도, P1 = r에 _최대, P2 = K _D.
8. 1 가정 동력학 분석을 수행한다 : 1 랭 뮤어 결합 및 소프트웨어 패키지 ^(2)의 글로벌 맞춤 알고리즘을 사용하여 데이터를 장착한다.
9. 5 ° C, 12 ° C, 18 ° C, 25 ° C, 30 ° C ⁽¹⁹⁾ 다음의 온도에서이 방법을 반복하여 열역학 실험을 수행합니다.
10. 표준 열역학 식 (ΔG ° = -RTlnK _D) ^(19)를 사용하여 ° ΔG를 계산하기 위해 다른 온도에서 SPR에 의해 결정되는 K _{D 값을} 사용합니다.
    참고 : R = 기체 상수, T K에서 = 온도, LN = 자연 로그.
11. ¹⁹ - 깁스 - 헬름홀츠 방정식 (TΔS ° ΔG ° = ΔH)에 따라 열역학적 매개 변수를 계산합니다.
12. (세 파라미터 방정식에 맞는 비선형 회귀를 이용하여 온도에 대한 결합 자유 에너지, ΔG ° (ΔG ° = -RTlnK _D), (K)를 플롯 Y = ΔH + ΔCp * (X-298)를 -x * ΔS- X * ΔCp * LN (X / 298)) ^19.
    참고 : X = ΔG °, K에서 Y = 온도.

5. 등온 적정 열량계 (ITC)

1. 등온 적정 열량계를 사용하여 ITC 실험을 수행합니다. 주사기에 열량계 셀 및로드 210 μM 가용성 TCR을에 30 μM pHLA을 주입한다. 20 mM의 헤 페스 150 mM의 NaCl을 함유하는 (PH 7.4) : 다음 버퍼 조건을 사용합니다.
2. 20 TCR 주사, 2 μL 볼륨의 각을 수행합니다. 분석 소프트웨어를 사용하여 ΔH 및 K _{D를 계산합니다.}

6. 결정화, 회절 데이터 수집 및 모델 정교화

1. 결정화 로봇을 사용하여 결정화 실험을 수행합니다.
2. VAP에 의해 결정 성장또는 결정화 버퍼의 60 μL (모액) ^(21)를 포함하는 저수지와 96 웰 플레이트에 앉아 드롭 기술을 통해 18 ° C에서 확산.
3. 10 kDa의 분자량 컷 - 오프 원심 농축기에서 3,000 XG에서 회전에 의해 결정 버퍼에 약 10 ㎎ / ㎖ (0.2 밀리미터)에 용해 pHLA을 집중한다.
4. 약 10 ㎎ / ㎖ (0.1 mM)을 단백질 용액을 얻었다 : 1 몰비로 공동 복잡한 구조를 들면, 하나의 TCR 및 pHLA 섞는다.
5. 24 시간, 48 시간, 72 후 현미경으로 결정을 위해 TCR과 pHLA 1 몰비 믹스, 결정화 로봇을 사용하여 결정화 화면에서 각 저장 솔루션의 200 (NL)로하고 점수 : 단독 200 거리 nL pHLA의 추가 또는 1 시간 후 일주일에 한 번.
6. 수동 현미경에서 극저온 루프에서 그들을 장착하여 수확 단결정 잠수 및 액체 질소 (100 K)에 저장하여이를 냉동은-냉각.
   참고 :로드 결정 prac 약간의 소요TICE 및 데이터 수집을위한 충분있는 결정 결정은 경험을 함께 제공됩니다. 경험상, 더 크고 일정한 결정수록있다.
7. 100 K. 질소 가스의 스트림 데이터를 수집
   참고 :이 데이터는 다이아몬드 광원 (DLS) 영국의 국가 싱크로 과학 시설에 인수되었다.
8. 두 MOSFLM ^22을 사용 xia2와 반사 강도를 추정하여 데이터를 분석 및 XDS ^{23 패키지화하고} SCALA 또는 목적이 ^(24)와 CCP4 패키지 ^(25)와 데이터 크기.
9. PHASER ^(26)를 사용하여 분자 교체와 구조를 해결합니다.
10. 닭 ^(27)와 모델을 조정하고 REFMAC5 ²⁸ 모델을 수정.
11. 파이 몰 ²⁹ 그래픽 표현을 준비합니다.
12. "연락처"를 사용하여 연락처를 계산CCP4 패키지 프로그램입니다. 반 데르 발스 연락처에 대한 4 Å 차단 및 수소 결합과 소금 교량에 대한 3.4 Å 차단을 사용합니다.
13. CCP4 패키지의 "SC"프로그램을 사용하여 표면 보완을 계산합니다.
14. ³⁰ 바와 같이, TCR-pHLA 복합체의 교차 각도를 계산한다.
    참고 :이 연구를 위해, 반사 데이터와 최종 모델의 좌표가 PDB 데이터베이스에 기탁 하였다 (PMEL17 TCR-A2-YLE-9V PDB : 5EU6, A2-YLE PDB : 5EU3, A2-YLE-3A PDB : 5EU4 및 A2 -YLE-5A의 PDB : 5EU5).

결과

전술 한 방법을 사용하여, 우리는 CD8 ⁺ T 세포에 의해 심층 gp100 _280-288 인식 분자 분석을 수행하기 위해 가용성 TCR (표 1) pHLA 분자를 생성. 변형 된 대장균 발현 시스템은 TCR도 (α 및 β 쇄) 및 pHLAs (α 쇄와 β2m) 모두 각각 별도 체인 대해 불용성의 IB를 생성하기 위해 사용되었다. 이 방법은 설정된 비교적 저렴하고 용이하다는 장점을 가지고 있으며, 단백질의 큰 수율 (배양 100-500 밀리그램 / L)를 생성한다. -80 ° C에 보관하는 경우 또한, 불용성 단백질은 매우 안정하다. 그런 다음 기능 균질 가용성 단백질을 생성하는 확립 된 폴딩 및 정제 기술을 사용했다. 이러한 방법은 진단 또는 치료를 위해 사용될 수 있으며, 생물 물리학 적 구조와 세포 실험뿐만 아니라, 시약을위한 단백질을 생성하는 데 유용하다.

(표 2)를 이용하여 결합 친 화성을 TCR을 평가 하였다. 펩티드에 잔류 물 증명이 분석은 TCR 바인딩을 위해 가장 중요했다. 고해상도이 기술을 이용하여 결합 친 화성 분석은 매우 단백질 - 단백질 상호 작용을 제어하는 ​​생물학적 메커니즘을 판정하는데 유용뿐만 아니라, 치료 적 분자의 결합 친화도를 분석한다.

그런 다음 원 해상도 (도 1 및 2, 표 3)의 결합 모드를 조사하는 수정 종양 유래 pHLA (A2-YLE - 9V) 복잡한에서 흑색 특정 가용성 TCR (PMEL17 TCR)을 결정화. 이 실험은 두 분자 사이의 결합 인터페이스를 직접 시각화를 제공 providin상호 작용을 지배하는 기본 원리에 대한 g 키 정보. 우리는 또한 (그림 3)를 결합 활성화 정력적인 기여를 공개, SPR 및 ITC 모두를 사용하여 상호 작용의 열역학적 분석을 수행 하였다. 이러한 분석은 상기 두 단백질 (도 4 및 표 4) 사이의 접촉 면적 고해상도 설명에 의해지지되었다.

우리는 다음 분자 스위치를 설명 할 수 있음을 드러내는 펩티드의 변이 형태를 제시 unligated pHLA 분자의 구조를 해결 이유 결합 TCR 폐기 특정 돌연변이 (도 5).

전반적으로, 이들 기술은 T 세포의 항암 치료제에 대한 중요한 표적 인 흑색 종 유래의 항원을 인식하는 방법을 설명하는 메커니즘을 보여주는 신규 데이터를 제공했다. 더 광범위하게, 이들 기술신규 한 치료 적 진보의 대상이 될 수있는 새로운 생물학적 메커니즘을 폭로 거의 모든 수용체 - 리간드 상호 작용을 조사 할 수있다.

그림 1 : 밀도 플롯 분석. 좌측 컬럼에 도시 한 모델은 펩티드의 부재하에 정제시킨 맵을 생략합니다. 차이 밀도는 3.0 시그마에서 윤곽되고, 긍정적 인 윤곽은 녹색으로 표시하고, 음의 윤곽이 빨간색된다. 오른쪽 열은 REFMAC5 적용 자동이 아닌 결정 대칭 구속을 사용하여 후속 정제 후 (단백질 사슬의 스틱 표현 주위에 회색 메쉬로 표시) 1.0 시그마에서 관찰 된지도를 보여줍니다. (A)를 TCR CDR3와 PMEL17 TCR-A2-YLE-9V의 모델은 컬러 블루 (α 체인), 오렌지 (β 체인) 및 녹색 펩타이드를 반복합니다. (B) A2-YLE의 모델펩타이드는 진한 녹색 색깔. (C) A2-YLE-3A의 펩타이드 컬러 오렌지 A2-YLE-3A의 모델 (이 비대칭 단위에 2 분자가 있었지만, 이러한 생략하고 밀도지도의 측면에서 거의 동일했다, 그래서 단 1 복사 ) 여기에 표시됩니다. (D) 펩티드 컬러 핑크 A2-YLE-5A의 모델입니다. 참조 ^{(31)로부터} 허가 재판. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2 : A2-YLE-9V와 단지의 PMEL17 TCR의 개요. PMEL17 TCR-A2-YLE-9V 단지의 (A) 만화의 표현입니다. TCR에 검은 색입니다; 짙은 녹색, CDR2α; TCR CDR의 루프 (빨강, CDR1α을 나타낸다 블루, CDR3α, 노란색, CDR1β, 아쿠아, CDR2 ^(6); 오렌지, CDR3β); 그리고 HLA-A * 0201는 회색으로 묘사된다. YLE-9V 펩티드 스틱 녹색으로 표시된다. (; YLE-9V, 녹색 스틱 A2, 회색)를 PMEL17 TCR CDR의 잔류 물 (B) 표면과 스틱 표현은 (A에서와 같이 색으로 구분)을 A2-YLE 표면과 접촉하는 루프. 블랙 대각선은 YLEPGPVTV 펩티드 (46.15 °)의 장축에 대하여 TCR의 교차 각도를 나타낸다. (C)이 A2-YLE-9V 표면에 PMEL17 TCR (A2, 회색)의 접촉 면적; 보라색과 녹색 (표면과 스틱)은 HLA-A * 0201를 표시하고 YLE 잔류 물은 각각 gp100의 TCR 연락. 컷 - 오프 수소 결합 3.4 Å과 반 데르 발스 연락처 4 Å의를. 참고 31에서 허가 재판하는 것은 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3 : PMEL17 TCR-A2-YLE 상호 작용의 열역학적 분석. (A) PMEL17 TCR 평형 결합, 18, 12, 5시 25 A2-YLE에 대한 응답을하고, 열 TCR 연속 희석 9에서 37 ° C. 각 곡선의 삽입에 도시되어 글로벌 맞춤 알고리즘 (BIA 평가 3.1)를 사용하여 K _{오프 값} K를 계산하기 위해 사용 하였다 : SPR 원료와 끼워 데이터 (랭 뮤어 결합 일 1 가정). 표는 평형 결합을 보여줍니다 (K _D (E)) 및 운동 결합 상수 (K _D (K) = K _오프 / K) 각각의 온도에서. 결합 상수 평형 (K _D는 μM) 값은 비선형 맞게 사용하여 계산 하였다 (Y = (P1x) / (P2를 + X)). (B) 열역학적 파라미터 깁스 - 헬름홀츠 방정식에 따라 계산 하였다 (ΔG ° = ΔH ° - TΔS °). 바인딩 무료 에너지, ΔG ° (ΔG ° = -RTlnK _D)가, 온도에 대해 도시 하였다 (K) 세 파라미터 방정식에 맞는 비선형 회귀 분석을 사용하여 (Y = ΔH ° + ΔCp ° * (X-298) -x * ΔS ° -x * ΔCp ° * LN (X / 298)). 298 K (25 ° C)에서의 엔탈피 (ΔH °)과 엔트로피 (TΔS °)는 킬로 칼로리 / 몰에 도시되는 온도 (K)의 비 - 선형 회귀에 의해 계산 된 자유 에너지에 대해 플롯 (ΔG °). PMEL17 TCR-A2-YLE 상호 작용 (C) 등온 열량 적정 (ITC) 측정. 298 K (25 ° C)에서 엔탈피 (ΔH °)와 엔트로피 (TΔS °는) 킬로 칼로리 / 몰에 표시됩니다. 참조 ^{(31)로부터} 허가 재판. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

옹> 그림 4 : 펩타이드 잔류 Pro4, Val7 및 Thr8에 PMEL17 CDR 루프 초점을 맞 춥니 다. (A)에 YLE-9V 펩티드 및 PMEL17 CDR 루프 잔기 사이의 콘택트의 도식 표현은 (도 2A에서와 같이 색으로 구분). 패널의 아래쪽에있는 숫자는 TCR 펩티드 사이의 전체 접촉을 나타낸다. (B)를 PMEL17 TCR과 반 데르를 보여주는 YLE-9V 펩타이드 (녹색 지팡이) 사이의 연락처 발스 연락처 (검은 점선)과 TCR CDR3α (파란색)에 의해 수소 결합 (빨간 점선), CDR1β (노란색) , CDR2β (아쿠아), 및 CDR3β (주황색) 루프. 하단 패널에서 YLE Pro4, Val7 및 Thr8 사이의 접촉의보기 닫기를 각각이고, TCR CDR 루프 잔기 (컬러 그림 1A와 같이 코딩 스틱). 컷 - 오프 수소 결합 3.4 Å과 반 데르 발스 연락처 4 Å의를. 참조 ^{(31)로부터} 허가 재판.rge.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5 : HLA-A * 0201에 의해 발표 YLE, YLE-3A의 구조적 비교 및 A2-YLE-5A 펩티드. (A) YLE (진한 녹색 막대기)과 YLE-3A (오렌지 스틱) HLA-A의 중첩 * 0201 α1 나선 (회색 만화)에 의해 펩타이드 정렬. 박스형 잔류 물 알라닌으로 Glu3의 돌연변이를 나타냅니다. 인 세트는 Glu3Ala 대체는 A2-YLE 구조에 비해 A2-YLE-3A 구조의 이웃 잔류 Pro4의 위치의 변화 (검은 색 화살표)을 발생하는 방법을 보여줍니다. (B) YLE (진한 녹색 막대기)과 YLE-5A (핑크 스틱) HLA-A * 0201 α1 나선 (회색 만화)의 중첩에 의해 펩타이드 정렬. 박스형 잔류 물 알라닌으로 글리신 (5)의 변이를 나타냅니다. 기준의 허가 재판 ^{이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.}

TCR	CDR1α	CDR2α	CDR3α	CDR1β	CDR1β	CDR1β
PMEL17	DSAIYN	IQSSQRE	CAVLSSGGSNYKLTFG	SGHTA	FQGTGA	CASSFIGGTDTQYFG
gp100	TSINN	IRSNERE	CATDGDTPLVFG	LNHDA	SQIVND	CASSIGGPYEQYFG
	KALYS	LLKGGEQ	CGTETNTGNQFYFG	SGHDY	FNNNVP	CASSLGRYNEQFFG
296	DSASNY	IRSNVGE	CAASTSGGTSYGKLTFG	MNHEY	SMNVEV	CASSLGSSYEQYFG

표 1 : TCR CDR3 PMEL17의 지역, gp100, MPD, 및 296 gp100 특정 TCR도의 정렬. 참조 ^{(31)로부터} 허가 재판.

펩타이드 서열	펩타이드	PMEL17 TCR TRAV21 TRBV7-3 선호도 K D	gp100 TCR TRAV17 TRBV19 AffiNITY K D
YLEPGPVTA	YLE	7.6 ± 2 μM	26.5 ± 2.3 μM
YLEPGPVT V	YLE-9V	6.3 ± 1.2 μM	21.9 ± 2.4 μM
LEPGPVTA	YLE-1A	15.9 ± 4.1 μM	60.6 ± 5.4 μM
YL PGPVTA	YLE-3A	어떤 구속력 없음	어떤 구속력 없음
YLE GPVTA	YLE-4A	19.7 ± 1.3 μM	144.1 ± 7.8 μM
YLEP PVTA	YLE-5A	> 1 ㎜	>를 1mM
YLEPG VTA	YLE-6A	11.4 ± 2.7 μM	954.9 ± 97.8 μM
YLEPGP TA	YLE-7A	31.1 ± 4 μM	102.0 ± 9.2 μM
YLEPGPV A A	YLE-8A	38.1 ± 7.4 μM	121.0 ± 7.5 μM

표 2 : PMEL17 TCR의 선호도 분석 (K _D) 및 gp100의 TCR은 _280-288 펩타이드 변형을 gp100합니다. 참조 ^{(31)로부터} 허가 재판.

매개 변수	PMEL17 TCR-A2-YLE-9V	A2-YLE	A2-YLE-3A	A2-YLE-5A
PDB 코드 <> / 강해	5EU6	5EU3	5EU4	5EU5
데이터 집합 통계
공간 그룹	P1	P1 21 일	P1	P1 21 일
단위 셀 파라미터 (A)	A = 45.52, B = 54.41, C = 112.12, A = 85.0 °, B = 81.6 °, g = 72.6 °	A = 52.81, B = 80.37, C = 56.06, B = 112.8 °	A = 56.08, B = 57.63, C = 79.93, A = 90.0 °, B = 89.8 °, g = 63.8 °	A = 56.33, B = 79.64, C = 57.74, B = 116.2 °
방사원	DIAMOND I03	DIAMOND I03	DIAMOND I02	DIAMOND I02
파장 (Å)	0.9763	0.9999	0.9763	0.9763
Measu적색 해상도 범위 (A)	51.87-2.02	45.25-1.97	43.39-2.12	43.42-1.54
외부 해결 쉘 (Å)	2.07-2.02	2.02-1.97	2.18-2.12	1.58-154
반사가 관찰	128,191 (8955)	99,442 (7056)	99,386 (7463)	244,577 (17,745)
고유 반사	64,983 (4785)	30,103 (2249)	49,667 (3636)	67,308 (4962)
완전성 (%)	97.7 (96.7)	98.5 (99.3)	97.4 (96.7)	99.6 (99.9)
다수	2.0 (1.9)	3.3 (3.1)	2.0 (2.1)	3.6 (3.6)
I / 시그마 (I)	5.5 (1.9)	7.2 (1.9)	6.7 (2.삼)	13 (2.3)
Rpim (%)	5.7 (39.8)	8.8 (44.7)	8.7 (41.6)	4.5 (35.4)
R 병합 (%)	7.8 (39.6)	9.8 (50.2)	8.7 (41.6)	5.0 (53.2)
제련 통계
해상도 (Å)	2.02	1.97	2.12	1.54
사용 없음 반사 않는다	61688	28557	47153	63875
Rfree 세트에는 반영되지	3294	1,526	2,514	3406
R의 크리스 í (더 컷 - 오프) (%)	18.1	19.7	17.2	17.0
R 무료	22.2	25.5	(21).1	20.1
루트 이상적인 형상에서 평방 편차를 의미
결합 길이 (Å)	0.018 (0.019) *	0.019 (0.019) *	0.021 (0.019) *	0.018 (0.019) *
본드 각도 (°)	1.964 (1.939) *	1.961 (1.926) *	2.067 (1.927) *	1.914 (1.936) *
전체 오류 (Å)를 좌표	0.122	0.153	0.147	0.055
라마 찬드 통계
최혜국	791 (96 %)	371 (98 %)	749 (99 %)	384 (98 %)
허용	32 (4 %)	6 (2 %)	10 (1 %)	5 (1 %)
아웃 라이어	2 (0 %)	3 (1 %)	1 (0 %)	2 (0 %)

표 3 : 데이터 감소와 정제 통계 (분자 교체). 참조 ^{(31)로부터} 허가 재판. 괄호 안의 값은 최고 해상도 쉘에 대한 것입니다.

^OH

HLA / 펩타이드 잔류	TCR 잔류	제 VDW (≤4Å)	번호 H-채권 (≤3.4Å)
Gly62	αGly98	삼
	αSer99	1
Arg65	αSer99	이
Arg65 O	αAsn100 Nδ2	이	1
Arg65 NH1	βAsp58 Oδ2		1
	βSer59	8
Lys66	αGly98	1
	αSer99	4
	αAsn100	4
Ala69	αAsn100	이
	βAla56	이
Gln72 Nε2	βGln51 O	삼	1
	βGly54	(7)
	βAla55	1
Thr73	βGln51	1
Val76	βGln51	삼
	βGly52	이
Lys146	βPhe97	삼
	βIle98	삼
Ala150	βIle98	1
	βAsp102	삼
Val152	βIle98	1
Glu154	αTyr32	1
Gln155 N	αTyr32 OH	4	1
Gln155 Oε1	βThr101 N	(10)	1
αGly97 O	1	1
	αGly98	1
	αSer96	1
Glu3	αTyr101	1
Pro4	αSer96	1
	αSer99	1
	αAsn100	4
Pro4 O	αTyr101 N	(14)	1
Gly5	αTyr101	삼
	βGly100	이
Val7	βIle98	(7)
	βGly99	이
	βGly100	이
Thr8	βThr31	(5)
	βGln51	1
	βPhe97	1
Thr8 N	βIle98 O	6	1

Tyr1

표 4 : PMEL17 TCR-A2-YLE-9V 연락 표. 참조 ^{(31)로부터} 허가 재판.

토론

여기에 설명 된 프로토콜은 인간 질병의 맥락에서 T 세포 반응의 분자 세포 절개하기위한 프레임 워크를 제공한다. 암 연구의 주요 초점했지만, 우리는 바이러스 ^{32, 33, 34, 35에} 대한 T 세포 반응을 조사하기 위해 매우 유사한 접근 방식을 사용하고 ^{(36), (37)} 및자가 면역 ^{38, 39, 40} 중. 더욱이, 우리는 T 세포 항원 인식 ^{2, 19, 41, 42에} 적용되는 분자 원리를 이해하기 더 넓게 이러한 기술을 사용했다. 실제로, 수정의 예측할 수없는 본질은, 심지어을 잔류 물을 펩티드TCR을 접촉 잔기의 외부에서 충격 T 세포 인식되어 헤테로 펩티드의 디자인을위한 중요한 의미를 갖는다. 이러한 결과는 직접적으로 개선 진단 프로그램 ^{(45), (46), (47)뿐만} 아니라, 펩타이드 백신 ^{6 43} 인공 고친 화성 TCR도 ^{3, 4, 5, 20, 44을} 포함한 신규 한 T 세포 치료법의 개발에 기여 하였다.

프로토콜 내에서 중요한 단계
고순도, 기능성 단백질의 생성은이 문서에 설명 된 방법 모두를위한 필수적이다.

수정 및 문제 해결
고순도의 단백질을 생성하는 어려움은 종종 매우의 발현과 관련순수한, 대장균 발현 시스템에서 불용성의 IB. 통상적으로, 발현 프로토콜 (예를 들어, 다양한 E. 콜라이 균주를 사용하는 상이한 광학 밀도에서 유도 또는 다른 매체를 사용하여 형성)를 수정하는 것은 이러한 문제를 해결한다.

기술의 한계
이러한 기술은 일반적으로 세포 표면에 발현되는 가용성 단백질 분자 (TCR 및 pHLA)를 사용한다. 따라서, 구조 / 생물 리 학적 결과는 생물학적 중요성을 확인하기 위해 셀룰러 방식과 일치하는 것을 보장하는 것이 중요하다.

기존의 / 대안적인 방법에 대한 기술의 중요성
X 선 결정학 및 기능 분석을 통해 입증 된 생물 물리학의 사용을 통해, 우리와 다른 암 항원에 대한 TCR도의 특정은 일반적으로 낮은 결합 친화도 ^(48)에 의해 특징 있음을 증명하고있다. 이 낮은 TCR 선호도는 T 세포가 아칸소 이유를 설명하는 데 도움이 될 수 있습니다전자 암을 취소에서 자연적으로 효과가 없습니다. 항암 TCR도하고 동족 종양 항원 간의 복합체의 고해상도 원자 구조는이 약한 선호도에 대한 분자 적 기초를 공개하기 시작했다. 또한, 이들 연구는 미래에 개선 ^(16)을 시드,이 문제를 극복하기위한 치료 적 개입을 기초 메커니즘을 결정하는 데 유용하다. 이 연구에서 우리는 gp100의 HLA-A * 0201 제한 흑색 종 항원 복잡한에 자연 발생 αβTCR의 첫 번째 구조를 조사 하였다. 에 대한 심도있는 생물 리 학적 검사와 결합 구조는, 상호 작용의 전체 바인딩 모드를 한 것으로 밝혀졌습니다. 또한 및 CD8 ⁺ T 세포 인식 (작용 성 실험) (표면 플라즈몬 공명을 이용하여 평가 된) 결합 TCR 폐기 펩티드의 변이 형태 발생 예기치 분자 스위치, 폭로. HLA 항원 presentati의 새로운 메커니즘을 입증하는 경우에만 가능했다기재된 고해상도 방법에 사용.

이 기술을 마스터 한 후 미래의 응용 프로그램이나 방향
강력한 기능 분석과 결합 될 때 전반적으로, 우리의 결과는 X 선 결정학 및 생물 물리학 적 방법의 힘을 보여줍니다. 이러한 접근법을 사용하면, T 세포 항원 인식을 적용 정확한 분자 메커니즘을 절개 할 수있다. 실제로, 구조적 변화가 항원 차별 ^{49, 50, 51} 중 역할을 할 수있는 방법을 보여주는 unligated TCR도의 구조를 해결하기 위해이 방법을 사용하는 것도 가능하다. TCR-pHLA 상호 작용을 뒷받침 매우 복잡하고 동적 인 특성의 이해는 치료 설계를위한 명백한 의미를 가지고있다. 직접 변형 항원 recognitio에 치료 표적이되고있는 분자뿐만 아니라 효과를 "볼"수 있다는N, 분명히 앞으로 이러한 의약품의 개발이 향상됩니다. 이 연구에서 우리는 심하게 TCR에 의해 결합되지 않은 단일 펩티드 잔류 심지어 변화가 예측할 수 차례, 극적으로 T 세포의 인식을 변화의 HLA-결합 된 펩타이드, 다른 잔류 물에 구조적 변화를 전송할 수 있음을 보여준다. 인간 질병의 광범위한 미래 요법을 설계 할 때 T 세포의 항원 인식시 사용되는 분자 기전의보다 완전한 이해는 상당히 유익 할 것이다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
S.O.C. 미디어	Invitrogen
Orbi-Safe New Orbit 인큐베이터	산요
카르베니실린	시그마
IPTG	피셔
퀵 쿠마시 스테인 세이프스테인	Generon
Legend RT 원심분리기	소르발
트리스	피셔
염화마그네슘	아르코스
NaCl	피셔
글리세롤	시그마-알드리치
소노펄스 HD 2070	Bandelin
DNAse	피셔
트리톤	시그마-알드리치
EDTA	피셔
구아니딘	피셔
나노드롭 ND1000	열
펩타이드	펩타이드 단백질 연구
디티오트레이톨	시그마-알드리치
L-아르기닌	SAFC
시스테아민	피셔
시스타민	Fisher
투석 튜브	시그마-알드리치
우레아	시그마-알드리치
Metricel 0.45 μ m 멤브레인 필터	Pall
POROS 10/100 HQ	응용 biosystems
Ä KTA 순수 FPLC 시스템	GE 헬스케어 생명과학
10 kDa MWCO Vivaspin 20	싸토리우스
10 kDa MWCO 비바스핀 4	Sartorius
Superdex 200 10/300 GL 칼럼	GE Healthcare Life Sciences
인산염 완충액 식염수	옥소이드
BIAcore 버퍼 HBS	GE 헬스케어 생명과학
바이오틴화 키트	Avidity
BIAcore T200	GE 헬스케어 생명과학
CM5 칩 커플링 키트	GE 헬스케어 생명과학
스트렙타비딘	Sigma-Aldrich
Microcal 부사장-ITC	GE 헬스케어 생명과학
Hepes	Sigma-Aldrich
Gryphon 결정화 로봇	Art Robbins Instruments
Intelli-plate	Art Robbins Instruments
결정화 스크린 및 시약	분자 치수
75 cm2 플라스크	Greiner 바이오 원
0.22 μ m 필터	Miller-GP, Millipore
Ultra-Clear 초원심분리기 튜브	Beckman Coulter
Optima L-100 XP SW28 로터	Beckman Coulter
CD8 마이크로비즈	Miltenyi Biotec
안티-CD3/CD28 다이나비드	Invitrogen
안티-PE 마이크로비즈	Miltenyi Biotec
CK 매체, PHA	Alere Ltd
anti-TCRVβ mAb
다사티닙	축삭돌기
MIP-1β 및 TNFα 엘리사	R& D 시스템
51Cr	PerkinElmer
1450 Microbeta 카운터	PerkinElmer