여기에서는 다양한 발달 단계에서 초파리를 준비하고 맞춤형 광학 간섭 현미경(OCM) 시스템을 사용하여 초파리 심장 박동의 종단 광학 이미징을 수행하기 위한 실험 프로토콜에 대해 설명합니다. 심장의 형태학적 및 역학적 변화는 OCM 이미지에서 심장의 구조적 및 기능적 매개변수를 분석하여 정량적으로 특성화할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
작은 동물의 심장 박동에 대한 종단 연구는 심장 발달 중 구조적, 기능적 변화를 이해하는 데 기여합니다. 광간섭 현미경(OCM)은 높은 공간 해상도와 초고속 이미징 속도로 작은 동물의 심장을 이미징할 수 있는 것으로 입증되었습니다. 높은 이미지 대비와 비침습적 특성으로 인해 OCM은 조직 해부나 염색 없이 종단 연구를 수행하는 데 이상적입니다. 초파리는 많은 수의 상동 인간 질병 유전자, 척추 동물과의 분자 메커니즘 및 유전 경로의 유사성, 짧은 수명주기 및 낮은 배양 비용으로 인해 심장 발달 연구에서 모델 유기체로 널리 사용되었습니다. 여기에서 실험 프로토콜은 표본의 수명 주기 동안 맞춤형 OCM 시스템을 사용하여 초파리를 준비하고 심장 박동을 광학 이미징하기 위해 설명됩니다. 이 보고서에 제공된 단계를 따르면 횡방향 M-모드 및 3D OCM 이미지를 획득하여 초파리 심장 형태 및 기능에 대한 종단 연구를 수행할 수 있습니다. 또한 안면 및 축 단면 OCM 이미지와 심박수(HR) 및 심장 활동 기간(CAP) 히스토그램을 통해 심장 구조 변화를 분석하고 초파리 변태 중 심장 역학을 정량화했으며, 심장 활동을 직관적으로 추적하기 위해 M 모드 이미지로 구성된 비디오와 결합했습니다. 초파리와 척추동물 사이의 유전적 유사성으로 인해 초파리의 심장 형태와 역학에 대한 종단 연구는 인간 심장 질환의 기원을 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기서의 프로토콜은 인간의 심장 질환 메커니즘을 이해하기 위해 광범위한 연구를 수행할 수 있는 효과적인 방법을 제공할 것입니다.
서론
작은 동물의 마음의 종단 연구는 유전자와 관련된 선천성 심장 결함 1,2 인간 관련 심혈관 질환의 다양한 이해에 기여한다. 지난 수십 년 동안, 이러한 마우스 3,4-, 5,6- 제노, 제브라 7,8 조류 9 및 초파리 10-16와 같은 다양한 동물 모델에서의 연구와 관련된 인간의 심장 개발을 수행하는데 사용되어왔다. 마우스 모델 널리 정상 및 비정상 심장 개발 및 인간 심장 3,4과의 유사성으로 인해 심장 결함 표현형을 연구하기 위해 사용되었다. Xenopus의 배아 때문에 쉬운 취급 및 부분 투명 5,6에 심장 개발의 연구에서 특히 유용합니다. 배아와 제브라 피쉬 모델의 초기 유충의 투명성 심장 개발 7,8 쉽게 광학 관찰 할 수 있습니다. 조류 모델은 발달 심장 연구의 일반적인 될 수 있습니다 becaus전자 심장 쉽게 알 껍질과 인간 9 조류 마음의 형태 학적 유사성을 제거한 후 액세스 할 수 있습니다. 초파리 모델은 마음의 종 방향 연구를 수행하기에 이상적 몇 가지 독특한 기능을 가지고 있습니다. 첫째, 초파리의 심장 관은 ....
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프로토콜
초파리 (16)의 광학 이미징에 대한 OCM 시스템의 1. 준비
- 분광기 및 OCM 시스템 초파리의 하트 비트를 해석 할 수 있도록 적어도 80 프레임 / 초의 프레임 속도를 제공하는 고속의 라인 스캔 카메라를 선택한다.
- 초파리의 핵심 구조를 식별하기 위해 2 ㎛, 축 해상도를 보장하는 광대역 광원을 사용한다.
- 높은 가로 해상도를 얻기 위해 10X 목표를 사용합니다.
- 기준 암부 광속을 반사하고, 시험편의 초점 심도를 확장하는 환형 샘플 아암 광빔을 생성하는 45 ° 막대 거울을 사용한다.
- OCM이 시스템을 제어하고 측정을 수행하는 사용자 컴퓨터 프로그램을 개발한다.
2. 초파리 문화
- 표준 비행 음식 준비
- 폴리스티렌 유리 병에 ~ 5 ml의 인스턴트 초파리 수식을 넣어종이 슈트의 도움 튜브.
- 제대로 음식을 포화 식으로 ~ 8 ml의 물을 붓고.
- 다른 실험에 대한 표준 비행 음식에 다른 보충제를 추가합니다. 실험 35 페이싱 ....
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결과
길이 심장 이미징 OCM 실온에서 24B-GAL4 / + 균주와 초파리를 사용하여 수행 하였다. 측정 L2, L3에서 수행하고, PD4에 PD1에서 8 시간 간격으로, 성인 1 일 (AD1)는 변형 과정 (표 1)를 추적 할 수 있었다. 유충, 번데기 초, 늦은 번데기 및 성인 파리는 그림 1A에서 볼 수 있듯이 유리 슬라이드에 장착했다. 애벌레와 성인 파리의 심장의 세그먼트 기능은 그림 1B의 개략적 인 표현에 나타내었다.
이 발달 연구에서, 4096 프레임은 초파리의 심장 박동을 추적하는 우리의 사용자 정의 OCM 시스템으로 32 초에서 획득 하였다. 측정 정확도를 개선하기 위해 다섯 반복 측정은 각 발달 단계에서 각각의 시료에 대해 수행 하였다. 3D 데이터는 변형 동안 심장 구조 변화를 관찰하기 위해 얻어 질 수있다.
가로 M .......
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토론
애벌레와 성인 단계에서 400 BPM 주위 최대 HR과 초파리의 빠른 심장 박동, 심장 diastoles 및 systoles (경험을 바탕으로 더 이상 80 프레임 / 초)를 해결하기 위해 높은 이미징 속도를 필요로한다. 작기 때문에 심실 크기 및 마이크론 스케일 심장 벽의 두께 (5-10 μm의) 높은 공간 분해능 (2 ㎛의보다 나은) 중심 관 구조를 해결하기위한 요구된다. 본 연구에서는, 고해상도 및 고속 초고 OCM 시스템 격자 600 라인 / mm의 변속기 분광기와 2048 픽셀 라인 스캔 카메라를 사용한 경우, 개발되었다. 20 kHz에서의 A-스캔 속도는 라인 스캔 카메라에 의해 제공된다. 128 프레임의 프레임 속도는 / 초 L2, L3, PD1, PD2, PD3, PD4, PD5, 성인 등 다양한 발달 단계에서 초파리 하트 비트를 포착 할 수있을만큼 빠르다. 광원 ~ 800 nm에서의 중심 파장 및 대역폭을 갖는 넓은 대역폭 초 연속 광원이었다220 nm의 각각과 조직 ~ 1.3 .......
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공개 사항
저자는 현재 연구와 관련된 이해 상충이 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 리하이 대학교 스타트업 펀드, NIH(R00EB010071는 C.Z.로, R15EB019704는 C.Z. 및 A.L.로, R03AR063271는 A.L.로, R01AG014713 및 R01MH060009는 R.E.T.), NSF(1455613는 C.Z. 및 A.L.), Cure Alzheimer's Fund(R.E.T.로) 및 Massachusetts General Hospital(A.L.에 대한 연구 상 집행 위원회)의 지원을 받았습니다. M.C.와 Y.M.은 National Key Basic Research Program의 지원을 받았습니다. 보조금 번호 2014CB340404에 따른 중국(973 프로그램).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 우리 연구실 | 맞춤형 OCM 이미징 시스템 | ||
| my Temp Mini Digital Incubator | Benchmark | H2200-HC | |
| Cover Glass | AmScope | 200PCS | |
| Cotton Ball | RITE AID | ||
| Instant Drosophila Formula | CAROLINA | formula 4-24 | |
| Yeast | ActiveDry | ||
| 현미경 | SONY | WILD M420 | |
| Brush | Loew-Cornell | 245B | 는 표본을 이동하는 데 사용됩니다 |
| Labview 소프트웨어 | National Instruments | ||
| ImageJ | National Institutes of Health | ||
| Matlab | Mathworks | ||
| Tweezer | Wiha | AA SA | 과일을 고정하는 데 사용됩니다. 플라이 윙스 |
| FlyNap | Carolina Biological Supply Company | 4,224,898 | |
| 스카치 퍼머넌트 양면 테이프, 3M | 스카치 | ||
| 피펫 | Fisherbrand | MU18837 | |
| 유기농 엑스트라 코코넛 오일 | Spring Valley | 13183 | |
| 현미경 슬라이드 | 캐피톨브랜드 | M3504-E | |
| Drosophila 바이알 | SEOH | 8401SS | |
| All-trans-retinal | Sigma-Aldrich Co. | R2500 |
참고문헌
- Liberatore, C. M., Searcy-Schrick, R. D., Yutzey, K. E. Ventricular expression of tbx5 inhibits normal heart chamber development. Dev. Biol. 223 (1), 169-180 (2000).
- Christoffels, V. M., et al. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart. ....
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재인쇄 및 허가
