이 방법은 효율적으로 암세포의 혈관 침입 능력을 시험하기 위해 제브라 피쉬 배아를 이용한다. 형광 암세포 개발 배아 precardiac 부비동 또는 난황 낭에 주입된다. 암 세포 혈관 침윤 및 혈관 외 유출은 24-96 시간 후 꼬리 영역의 형광 현미경을 통해 평가된다.
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이 논문에서
요약
초록
암세포 혈관 침입 및 유출은 전이성 진행의 특징입니다. 암세포의 내피 침입에 대한 전통적인 체외 모델은 일반적으로 침입 세포가 생체 내에서 노출되는 유체 역학이 부족합니다. 그러나 마우스 모델과 같은 생체 내 시스템은 생리학적으로 더 관련성이 높지만 실험 기간이 더 길고 모니터링 및 데이터 분석과 관련된 고유한 문제가 있습니다. 여기에서는 암세포 혈관 침입 및 유출을 신속하게 평가할 수 있도록 하여 이러한 기술적 격차를 해소하고자 하는 제브라피시 분석법에 대해 설명합니다. 이 접근법은 투명한 2일 된 제브라피시 배아의 심장 전동에 형광 암 세포를 주입하는 것인데, 이 배아의 혈관 구조는 대조적인 형광 리포터에 의해 표시됩니다. 주사 후 암세포는 순환하면서 생존해야 하며 이후 혈관에서 배아의 꼬리 부위에 있는 조직으로 분출해야 합니다. 바깥된 암세포는 고정된 시점에 형광 이미징을 통해 살아있는 배아에서 효율적으로 식별되고 점수가 매겨집니다. 이 기술은 주사 부위를 난황낭으로 변경하여 암세포의 이질적인 혼합물 간의 혈관 내 및/또는 경쟁을 연구하기 위해 수정할 수 있습니다. 이러한 방법을 함께 사용하면 암세포의 특징적인 행동을 평가하고 전이성 표현형으로의 악성 진행을 나타내는 메커니즘을 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다.
서론
전이성 암 사망률과 암세포의 확산을 가능하게 한 것을 발견 할 많은 유지기구의 주요 원인이다. 성공적으로 전이하는 암 세포에 대한 위해서는, 먼저 순환 시스템으로 (intravasate)를 입력, 기본 종양 주위의 기질을 통해 침입한다, 순환에서 통과, 출구 (extravasate)에서 살아 남기, 그리고 마지막으로 가능한 식민지를 구축 먼 장기 사이트 2에서. Intravasation 및 혈관 외 유출 따라서 전이성 폭포에서 중요한 단계이며, 아직 모든 암 세포는 파괴와 내피 접합 (3)를 통해 마이그레이션에 본질적으로 숙달되지 않습니다. 사실, 암세포의 혈관 침입을 둘러싸고 처리가 상기 내인성 및 외인성 인자 4 다양한 영향을받을 수있는 유일한 선택 압력의 시리즈가있다. 이러한 이유로, 고급 단계 암의 공격적인 행동을 조사 기법은 종종 V에 초점전이성 확산을 예측하는 수단으로서 기능 침습 ascular.
다양한 모델 시스템은 시험 관내에서 암세포의 침윤, 혈관의 조사를 용이하게하기 위해 존재한다. 대부분의 시험 관내 분석에서 사용하는 암 세포 (6)에 의한 손상 내피 단층 실시간 중단을 모니터링하는 내피 장....
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프로토콜
윤리 정책 : 승인 된 IACUC 프로토콜에 따라 Zebrafish의 배아를 생성 하였다. 이 실험은 조지 타운 대학 동물 관리 및 사용위원회의 권고 사항을 준수하여 수행 하였다.
1. 주입을 위해 배아를 구성 및 증권 솔루션 만들기
- 암 세포 혈관 침공을 평가하기 위해 필요한 제브라 피쉬 애벌레를 생성합니다.
- mitfa b692; ednrb1의 B140 물고기 (grcfp kdrl) ZN1의 Tg와의 교차 결합 쌍대 또는 그룹을 설정합니다.
참고 : 우리는 Tg가 생성 (kdrl : grcfp) ZN1을, mitfa b692, ednrb1의 B140의 제브라 피쉬를, Tg는 (kdrl : grcfp) 교차에 의해 색소 세포가 부족 라인, mitfa으로, 내피 세포에서 산호의 형광 단백질 녹색 암초를 표현 ZN1 (25), b692하며 Zebrafish의 국제 자원 센터에서 개발 ednrb1
- mitfa b692; ednrb1의 B140 물고기 (grcfp kdrl) ZN1의 Tg와의 교차 결합 쌍대 또는 그룹을 설정합니다.
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결과
여기서 우리는 제브라 피쉬 배아 모델에서 일반적으로 사용되는 유방암 세포주 (도 1)의 혈관 침입 능력을 시험 하였다. 엄격한 기준은 암 세포가 분명히 extravasated 않았다면 포지티브 이벤트 만 계산 된 서로 다른 세포주에 대한 채점 넘쳐에서 세포 파편을 처치에서 발생할 수있는 거짓 양성을 제한하기 위해 주로 수행이 존재을 사용 하였다.
침공이 96 시간 precardiac의 동 (표 1)에 주사 후 평가 때 우리의 분석은 선 사이에 뚜렷한 차이를 한 것으로 밝혀졌습니다. 시험 7 세포주는 MDA-MB-231 세포주를 주입 제브라 피쉬 배아 배아 당 extravasated 암세포 가장 많은 선의 허용 전이 특성 (도 2)와 일치하는 소견을 나타내었다. 우리는 또.......
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토론
이 기술은 효과적으로 암세포 (도 1 참조)의 혈관 침입 능력을 시험하기 위해 제브라 모델을 이용한다. (- 3,도 2, 표 1 참조) 여기에서는, 다른 연구자들은 다음 자신의 연구를 구축 할 수가있는 기준을 제공하기 위해 유방암 세포주의 패널 기술을 적용 하였다. MDA-MB-231 세포가 쉽게 제브라 피쉬 배아의 꼬리 영역에 침입 관찰은 혈관 침윤을 억제 할 수 에이전트를 테스트하기 위해이 셀 라인에 적합 할 것. 예를 들어 HCC1806 또는 MDA-MB-468 세포와 같은 비교적 덜 침습적 세포주는 달리 혈관 침략을 강화시킬 것이다 요인을 연구하기 위해 사용될 수있다. 이런 종류의 실험 약물의 포함을 요구할 경우에는 하나의 처리 효과는 내구성이 예상되는지 여부에 따라 전달 두 가지 경로를 갖는다. 암 세포는 약물 주입 이전에 예비 처리 될 수있다배아 또는 약물은 직접 확산에 의해 암 세포에 영향을 미.......
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공개 사항
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
제브라피시 배아 이미징에 도움을 주신 Georgetown University Microscopy Core의 Peter Johnson에게 감사드립니다. Microscopy & Imaging Shared Resource 및 Zebrafish Shared Resource는 NIH/NCI 보조금 P30-CA051008에서 부분적으로 지원됩니다. 이 작업은 NIH/NCI CA71508(AW) 및 CA177466(AW)의 지원도 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| 100mm 접시 | Corning Incorporated | 3160-100 | |
| 5 3/4" 일회용 목초지 피펫, 붕규산 유리 | Fisher Brand | 13-678-20B | |
| 60mm 접시 | Corning Incorporated | 3160-60 | |
| Agarose, 저융 | Fisher | BP165-25 | |
| Agarose, 분자 등급 | Bioline | BIO-41026 | |
| 모세관 유리, 표준, 1.2 mm x 0.68 mm, 4" | A-M Systems, Inc | 627000 | |
| David Kopf 700C 수직 피펫 풀러 | Hofstra Group | 3600 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| 전극 저장 용기, 1.0 mm | World Precision Instruments, Inc | E210 | |
| 에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이트 염 (트리카인, MS-222) | Fluka | A5040 | |
| 속눈썹 브러시 | Ted Pella, Inc | 113 | |
| 소 태아 혈청, 열 비활성화 | Omega Scientific | FB-12 | |
| Fisherbrand 전사 피펫 | ThermoFisher Scientific | 13-711-7M | |
| 겔 로딩 피펫 팁 | Fisher Brand | 02-707-181 | |
| 유리 바닥 접시 (12.0 mm) | ThermoFisher Scientific | 150680 | |
| 유리 함몰 슬라이드 | VWR | 470005-634 | |
| 인스턴트 오션 솔트, 바다 소금 | Pentair | IS50 | |
| 라텍스 고무 전구, 2 ml, 72 팩 | Heathrow Scientific | HS20622B | |
| SP8 컨포칼 현미경 | Leica | ||
| 마이크로매니퓰레이터 | Narishige | ||
| Eclipse E600 | Nikon | ||
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| 페니실린-G 칼륨 | 피셔 바이오테크 | BP914-100 | |
| 페트리 플레이트, 100 mm x 15 mm | 피셔 브랜드 | ||
| Picospritzer II | General Valve Corporation | ||
| RPMI 1640 매체 | Life Technologies | 11875-093 | |
| 스트렙토마이신 황산염 | Fisher Biotech | BP910-50 | |
| Vybrant DiI | ThermoFisher Scientific | V22885 | |
| Vybrant DiO | ThermoFisher Scientific | V22886 | |
| 제브라피쉬 | Georgetown Zebrafish Shared Resources | ||
| 세포주는 RPMI + 10% FBS에서 mantain된 BT-474 및 HCC18-6 세포를 예상하고 DMEM + 10% FBS로 유지되었습니다. |
참고문헌
- Cummings, M. C., et al. Metastatic progression of breast cancer: insights from 50 years of autopsies. Am J Path. 232, 23-31 (2014).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagué, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer.
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재인쇄 및 허가
