Method Article

문제있는 공장, 난균 강 및 곰팡이 샘플에 대한 전자 현미경 (SEM) 프로토콜을 스캔

DOI:

10.3791/55031

⸱

February 3rd, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Biodiversity and Conservation Department, Real Jardín Botánico, CSIC, 2Research Support Unit, Real Jardín Botánico, CSIC, 3Mycology Department, Real Jardín Botánico, CSIC, 4Division of Glycoscience, AlbaNova University Center, Royal Institute of Technology (KTH)

In This Article

Summary

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주사 전자 현미경 관찰을 위한 생물학적 샘플 처리의 문제에는 세포 붕괴, 습한 미세 환경의 샘플 처리 및 세포 파괴가 포함됩니다. 꽃 분열 분열체, 난균 낭종 및 곰팡이(Agaricales)와 같은 까다로운 샘플을 준비하는 데 적합한 저렴하고 비교적 빠른 프로토콜이 여기에 컴파일되고 자세히 설명되어 있습니다.

Abstract

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주사 전자 현미경 (SEM)으로 관찰 용 생물학적 시료를 처리 일반적인 문제는 세포 붕괴 습식 미세 환경과 세포 파괴로부터의 샘플의 처리를 포함한다. 주사 전자 현미경에서 이미지 캡처를위한 샘플 처리의 주요 과제 중 일부를 극복 여기에 설명되어 섬세한 샘플을 처리하기 위해 특정 프로토콜을 젊은 꽃 조직, 난균 강 낭종 및 예제 등의 곰팡이 포자 (주름 버섯 목) 사용.

FAA 고정 꽃 분열 조직은 (포르말린 - 기타 - 아세트산)과 중요 포인트 건조기 (CPD)으로 처리가 세포 벽이나 왜곡 기관을 축소 표시되지 않았습니다. 이러한 결과는 꽃 개발의 재건을 위해 중요하다. 예를 들면 글루 타르 알데하이드로 고정 난균 강 낭종 등의 습식 미세 환경에서 샘플 유사한 CPD 기반 치료, 스와의 다른 유형에 대한 진단 특성의 차이 성장 (예를 들어, 낭종 쪽)을 테스트하는 최적bstrates. 곰팡이 포자 부착 간호사 세포의 파괴는 재수, 탈수 및 CPD 처리, 이러한 세포의 추가 기능 연구를위한 중요한 단계 후 피해야한다.

여기에 설명 된 프로토콜은 저비용과 성장 과정을 재구성 및 진단 특성을 연구하기 위해 좋은 품질의 이미지의 취득을위한 급속 대안을 나타낸다.

Introduction

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생물학에서, 주사 전자 현미경을 사용 (SEM)의 구조의 진화, 비교 형태, 장기 개발, 집단 또는 종 (1)의 특성에 관한 연구로 확장되었다. 미세 구조의 두 개의 차원보기와 같은 micromorphology 및 계통 등의 분야는 20 세기 후반 이후 SEM 기술의 발전에서 이익을. 예를 들어, 1970 년대에 스퍼터 코팅 방법의 도입 비 - 전도성 조직 (2) (3)의 영상을 향상 같은 촬영 정점 꽃과 같은 민감한 물질 가능 관찰했다. SEM은 고진공 환경 4 지형 재현 시험편의 표면으로부터 방출 된 전자를 사용한다.

SEM과 관련된 연구는 구조적인 문자의 추론과 growt의 재건에 모두 초점을 맞추고있다시간 처리합니다. 새로운 구조적 분류에 관련된 문자 나 유기체의 광범위한 계통은 SEM 관찰 결과로부터 발견되었다. 예를 들어, 식물의 특성은 10, 11, 제대로없이 시각화 할 수없는 나무 ....

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Protocol

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참고 :이 프로토콜은 모든 (4-6)에 공통의 절차를 설명하는 특정 생물 (섹션 1-3)과 3-3 헌신 6 가지 주요 섹션이 포함되어 있습니다. 별표 (*)는 실험자에 의해 수정 단계를 나타냅니다.

1. 개발의 연구 및 완전 성형 공장 구조

  1. 수집 및 고정
    1. 식물 물질은 흄 후드없이 액세스 할 수있는 장소에 수집되면, 도입 원심 분리기 튜브에서 70 % 에탄올에 담가 재료. 이상적으로, 에탄올 과도한 탈수를 방지하기 위해 FAA에서 48 시간 (1.1.1-1.1.3 단계) 후 재료를 담가. 흄 찬장은 식물 재료에 액세스 할 수있는 경우,이 단계를 무시하고 1.1.1를 계속합니다.
    2. 알데히드 필터가 장착 된 연기 찬장에 포르말린 아세트산 알코올 (FAA) 정착액을 준비합니다. 70 % 변성 에탄올 85 부, 60 % 포름 알데히드 용액 10 부 및 빙초산 (5) 부분을 추가한다. 연방 항공국 준비단지 그것의 장기 보관으로, 재료를 고정하기 전에 40을 사용하지 않는 것이 좋습니다.
    3. 퓸 찬장에서 개인 넓은 입과 누수 방지 플라스틱 병에 FAA의 주식을 붓는다. 사용 가능한 샘플이있는만큼 병을 사용하여 샘플....

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Results

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꽃 개발 및 개발의 고정 및 완전 성형 공장 구조

여기에 설명 된 FAA-CPD 프로토콜을 사용하여, 젊고 성숙한 식물 조직은 최적의 고정 및 SEM 이미징 탈수 있습니다. 새싹의 지형과 모양이 축소 세포 (도 1B, 1D,도 4a-F)에 의해 왜곡되지 않기 때문에 이러한 꽃 개발과 같은 프로세스는 복원 할 수 있습니다. 복잡한 형상을 가진 구조물을 성공적으로 도달 달리 부품 (도 4g-I, 5E)의 회복을 가능하게 전도성 재료 (스퍼터 코팅기의 금속)의 균일 한 층으로 피복 될 수있다. 심하게 탈수 및 코팅, (그림 4 층, 5A를,도 5b)을 달성 할 수있는 경우에 사용하는 습식 미세 환경에서 오는 샘플 좋은 품질의 이미지는 전자 전류 과충전합니다. 이러한 꽃가루 벽면 .......

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Discussion

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표준 SEM 프로토콜에 대해, 여기에 제시된 절차는 비교적 빠른 따라하기 쉽고, 저렴한 방법 등이 있습니다. 샘플의 양 및 처리의 용이성에 따라, 양호한 품질의 이미지를 획득 4-5 일 걸린다. CPD 및 SEM 작업에 대한 적절한 안전주의 사항을 포함하는 절차는 취급이 용이하다. 특히주의 (1.1.3 및 프로토콜의 2.1.5에 단계 1.1.1 참조) 포르말린과 글루 타르 알데히드에주의해야한다. 샘플 손상 또는 이전 단계를 파괴하지 않고, 필요한 경우, 처리가 장시간 정지시킬 수 있으며, 특정 단계가 (예, 1.1.5, 1.2.3 및 1.3.5 단계)가있다. 비용면에서, 장치의 대부분은 몇 가지 제제 (예, CPD 알루미늄 스터브 용기 홀더)에 재사용 될 수 있고, 시약 비 비싼 화학 모든 상업적인 공급 업체에서 제공된다.

이 절차의 단점은알데히드 류 및 에탄올과 핵심 공급의 부족 및 기술의 제한에 대한 적절한 화학 폐기물의 필요성. 이러한 스.......

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Disclosures

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저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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이 프로젝트는 보조금 협정 제이 책은 저자의 의견을 반영 634429.에서 유럽 연합 (EU)의 호라이즌 (2020)의 연구 및 혁신 프로그램에서 자금을 받았고, 유럽위원회 (European Commission)가 정보로 만들어 질 수있는 사용에 대한 책임을지지 않습니다 거기에 포함. 우리는 또한 리얼 자르 딘 보타니 코, CSIC에 의한 재정 기여를 인정합니다. SR은 Saprolegnia가 번식 그녀의 연구 지원을위한 유럽 연합 (EU) [ITN-SAPRO-238550]에 감사합니다. 우리는 또한 친절에 대한 시스코 칼론 감사 샘플을 (그림 5)을 처리하기위한 Phellorinia의 herculanea 이미지와 B의 Pueyo을 제공하고자합니다. 모든 이미지는 마드리드에서 리얼 자르 딘 보타니-CSIC의 SEM 서비스에 의해 촬영되었다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
아세트산특정 공급 업체피부 자극, 눈 자극
알루미늄 스텁Ted Pella, Inc.16221www.tedpella.com
원심분리기 튜브특정 공급업체
Critical Point DryerPolaron Quatum TechnologiesCPD7501
D-(+)-GlucoseMerck1,083,421,000
양면 셀로테이프특정 공급업체
에탄올 절대공급업체 없음 특정 공급업체 없음가연성
유럽 세균 한천Conda1800.00
www.condalab.com 여과지특정 공급 업체
자없음 특정 공급 업체
말린 4 %특정 공급 업체유해, 급성 독성, 피부 감작, 발암성. 가연성
유리 커버 슬립특정 공급업체
유리 밀폐 용기 특정 공급업체
글루타르알데히드 25% DC 253857.1611  (엘)디스마델 S.L.3336
www.dismadel.com Mycological 펩톤Conda1922.00www.condalab.com
바늘특정 공급업체
페트리 접시특정 공급업체
플라스틱 용기특정 공급업체
이 있는 샘플 홀더  임계점 건조기용 테드 펠라, Inc.4591
www.tedpella.com 메스특정 공급 업체
SEM
주사 전자 현미경HitachiS3000N
: NaH2PO4
Solution B: Na2HPO4
시편 홀더공급업체
스퍼터 코팅기BalzersSCD 004
실체현미경특정 공급업체
투과전자현미경(TEM) 그리드전자 현미경 SciencesG200(정사각형 메쉬)www.emsdiassum.com
핀셋공급업체 없음
없음 없음없음 특정 겸포르 없음 없음없음없음없음없음 뚜껑없음솔루션 A를 위한 소프트웨어 특정 없음없음 특정

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Endress, P. K., Baas, P., Gregory, M. Systematic plant morphology and anatomy: 50 years of progress. Taxon. 49 (3), 401-434 (2000).
  2. Falk, R. H., Gifford, E. M., Cutter, E. G. Scanning electron microscopy of developing plant organs. Science. 168 (3938), 1471-1474 (1970).
  3. Damblon, F. Sputte....

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