우리는 IRF5 억제성 펩타이드로 처리된 C57Bl/6J 대조군 마우스, 타이트-스킨 마우스 및 타이트-스킨 마우스에서 심장 세포외 기질의 분리를 설명합니다. 또한 C57Bl/6J에서 분리된 혈관, IRF5 억제성 펩타이드로 처리된 타이트-스킨 마우스 및 타이트-스킨 마우스에 대한 혈관 확장 연구를 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
인터페론 조절 인자 5(IRF5)는 세포가 전염증 또는 항염증 방식으로 반응하는지 결정하는 데 중요합니다. 한 경로에서 다른 경로로 세포를 전환하는 IRF5의 능력은 치료 대상으로서 매우 매력적입니다. 우리는 소분자 및 펩타이드를 설계하기 위한 분자 모델링 소프트웨어로 미끼 펩타이드 IRF5D를 설계했습니다.
IRF5D는 IRF5를 억제하고, 세포외 기질의 변화를 감소시키며, 타이트스킨 마우스(Tsk/+)의 내피 혈관 확장을 개선했습니다. 재조합 IRF5에 대한 IRF5D의 K는 3.72 ± 0.74 x 10-6 M이며, 이는 생물층 간섭계 실험을 사용한 결합 실험에 의해 결정된 바와 같습니다. 내피 세포(EC) 증식 및 세포사멸은 IRF5D의 농도 증가를 사용하여 변하지 않았습니다(0 - 100 μg/mL, 24 시간). Tsk/+ 마우스는 IRF5D(피하 1mg/kg/d, 21d)로 처리했습니다. IRF5D 처리 후 IRF5 및 ICAM 발현이 감소했습니다. IRF5D로 치료한 Tsk/+ 마우스의 안면 동맥 혈관 확장으로 평가한 바와 같이 내피 기능이 개선되었으며, 이는 IRF5D 치료를 받지 않은 Tsk/+ 마우스와 비교되었습니다. 전사 인자(transcription factor)로서 IRF5는 세포질에서 핵으로 이동합니다. 전좌는 다른 심장 세포외 기질에서 배양된 심장 근세포에 대한 면역조직화학에 의해 평가되었습니다. Tsk/+ 마우스의 IRF5D 처리는 IRF5D 처리하지 않은 동물에 비해 IRF5 양성 핵의 수를 감소시켰습니다(50μg/mL, 24시간). 이러한 발견은 IRF5가 Tsk/+ 마우스의 염증 및 섬유증에 중요한 역할을 한다는 것을 보여줍니다.
서론
세포 증식과 세포 사멸의 면역 반응의 조절은 인터페론 조절 인자의 전사 인자 계열의 역할 핵심이다. IRF5는 1 형과 면역 반응의 조절, 염증 촉진 반응과 2 형, 면역 반응 대상으로 조직 복구에 매우 중요하다고 강조한다. IRF5 1 암 및자가 면역 2, 3, 4, 5의 핵심이다.
꽉 피부 마우스 (쯧 / +)이 때문에 피 브릴 린 (fibrillin)-1 유전자의 중복 돌연변이에 조직의 섬유화 및 경피증을위한 모델이다. 단단한 피부에이 돌연변이 결과 및 결합 조직의 증가. 이러한 쥐 심근 염증, 섬유증 최종적 심부전 5, 6, 7을 개발> 8,9. 경피증은 미국 (6)에서
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프로토콜
이 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드의 권장 사항을 엄격히 준수하여 실시 하였다. 이 프로토콜은 기관 동물 관리 및 사용위원회 (: AUA 번호 1517 프로토콜)에 의해 승인되었다. 마우스와 관련된 모든 연구는 PHS 정책에 부합 하였다.
미끼 펩타이드 1. 디자인
- IRF5의 3D 구조를 찾아 그 위에 디자인을 기반으로. 438 (ELSWSADSIRLQISNPD) - 17 메르 디자인, 아스 파르 테이트 (D)가 421에서 IRF5의 인산화를 모방하는 세린 (S)로 대체된다 IRF5D (ELDWDADDIRLQIDNPD)를,라고. 3D의 설 프히 드릴 그룹 및 활성화 IRF5의 메커니즘에 대한 지식, 즉, 세린 인산화의 분석 IRF5을 대상으로 하나의 전략이 미끼 펩타이드를 생성 할 것을 제안했다. 그림 1을 참조하십시오. 3 차원 구조에서 최적의 영역을 식별하기 위해 작은 molecul 설계를위한 분자 모델링 소프트웨어를 사용하여ES 및 펩타이드 15.
주 :이 프로세스의 중요한 단계는 3D 대상 단백질의 구조 및 그것의 가능한 결합 부위의....
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결과
도 1에서 보여준 결과 펩타이드를 디자인하는 방법을 보여준다. 그림 1, 왼쪽은 키나제의 숫자에 의해 인산화되어 IRF5의 영역 (2 노란색 화살표 사이, 아미노산 (AA) 425-436)를 보여줍니다. 그림 1, 오른쪽은 IRF5의 인산화 도메인이 결합하는 노란 타원형을 보여줍니다. 3DSH의 이량 체 구조는 나선 2 (aa303-312)의 왼쪽에 갈라진 틈이나 계곡을 관찰하기 위해 회전했다. IRF5의 포스 테일 도메인이 완전히 (즉, 세린 인산화) 호모 다이머 형성 및 가정 생물학적으로 활성 상태로 활성화 될 때 바인딩 예상되는 곳이다.
도 2에서, biolayer 간섭계에 의해 측정 된 결합 활성이 도시되어있다. 미끼.......
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토론
목표는 쯧 / + 마우스의 마음에 염증, 섬유화, 혈관 기능에 IRF5의 역할을 규명하기 위해 IRF5 억제제를 설계하는 것이 었습니다. 결과는 IRF5D이 증식 또는 세포 사멸을 유도하지 않았다 있습니다. 또한, 염증 감소와 혈관 기능이 향상되었다. 이러한 데이터는 IRF5 쯧 / + 마우스의 심장 염증 및 섬유증의 개발에 중요한 역할을 기계적 것을 제안하고이 치료 표적이 될 수있는 잠재력을 가지고있다.
첫 번째 단계는 억제제를 설계하는 것이었다. 펩티드를 설계 할 때, 여러 점을 고려되어야한다 : 시퀀스 길이, 이차 구조의 C 말단의 N 말단 아미노산의 산화, 아미노산 조성, 아미드 화 및 캡 아미노산 경향 잔류 와 리간드 첨부. 이상적인 시퀀스 길이가 가장 전체 수율, 적은 불순물 및 비용 절감을 보장하기 위해 15-10 사이의 잔류 물이다. 그것은 impor의입니다중대장은 베타 시트 형성과 같은 보조 구조를 알고 있어야합니다. 베타 시트 형성 삭제 서열의 높은 수준을 .......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 작업은 NIH 보조금 HL-089779 (DW), HL-112270 (KAP) 및 HL-102836 (KAP) 및 Cimphoni Life Sciences (DW 급여의 일부)의 지원을 받았습니다. 저자는 원고를 편집한 Meghann Sytsma에게 감사를 표합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Triton X 100 | Sigma Aldrich | X100- 100ml | |
| Alexa 488-labeled 염소 안티-마우스 IgG 항체 | Thermo Fisher | A11001 | |
| Bardford 시약 | Thermo Fisher | 23200 | 피어스 |
| 바이오센서 | Forte-Bio | MR18-0009 | |
| CD64 (H-250) | Santa Cruz Biotechnologies | sc-15364 | |
| CellEvent Caspase-3/7 Substrate | Thermo Fisher/Life Technologies | C10427 | |
| CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit | Promega | G3580 | Promega |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher | D-1306 | 1:1,000 희석, PBS |
| 당나귀 안티 쥐 Alexa 488 | Thermo Fisher | A-21208 | 1:1,000 희석, PBS |
| ECL 및 | GE healthcare/Amersham | RPN2133 | 많은 시행착오 끝에 EZ |
| 있는 Eclipse TE 200-U 현미경 | |||
| A-11008 | 1:1,000 PBS | ||
| HRP anti-goat | Santa Cruz Biotechnologies | sc-516086 | !:10,000 희석 TBS |
| HRP 당나귀 | anti-mouse Santa Cruz Biotechnologies | sc-2315 | 1:10,000 TBS |
| ICAM-1 항체 | Santa Cruz Biotechnologies | sc-1511 | 1:200 PBS |
| IRF5 항체 (H56) | Santa Cruz 1:200 희석 Biotechnologies | sc-98651 | |
| 마이크로 플레이트 리더 Elx800 | Biotek | ||
| NIMP 호중구 마커 | Santa Cruz Biotechnologies | sc-133821 | 1:200 PBS |
| Octet RED | Forte Bio | 단백질-단백질 결합 | |
| 펩타이드 설계에 희석 Medit SA 소프트웨어 | RCSB.org | ||
| 재조합 IRF5 단백질 합성 | TopGene Technologies | 단백질 발현, 합성 서비스 | |
| 소듐 도데실 포스페이 | 시그마 알드리치 | 436143 | 세제 |
| 케타민 | 약국 | 스케줄 III 통제 물질, 처방 필요 | |
| Xylazine | MedVet | ||
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참고문헌
- Bi, X., et al. Loss of interferon regulatory factor 5 (IRF5) expression in human ductal carcinoma correlates with disease stage and contributes to metastasis. Breast Cancer Res. 13 (6), 111(2011).
- Dideberg, V., et al.
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재인쇄 및 허가
