사후 인간의 두뇌 기증자로부터 Leptomeninges 이식편 문화의 유도

요약

인간의 사후 뇌에서 leptomeninges 이식편 문화 프로토콜 6-8 주 이내에 피브로넥틴 양성 수막 섬유 아세포를 유도 약 20-30000000 세포를 cryopreserve하기 위해 기술적으로 강력하고 간단한 방법입니다.

초록

큰 진전 파킨슨 병의 임상 적 특성에 만들어졌다하더라도, 몇몇 연구는 파킨슨 병의 병리학 적 진단이 임상 진단 파킨슨 병의 최대 25 %에서 확인되지 않은 것을보고한다. 따라서, 티슈는 오진의 높은 속도를 가질 수 특발성 파킨슨 병 환자의 임상 진단에서 수집; 전임상 모델이 쓸데 될 수 따라서 같은 조직에서 시험관 연구에서 파킨슨 병을 연구한다.

파킨슨 병의 확인 신경 병리학 적 진단 사후 인간의 leptomeninges를 수집하고 흑질 선조체 세포 손실과 루이 기관이라는 세포 내 단백질 흠을 특징으로 한 임상 관찰 파킨슨 다른 기저 질환 과정 (예를 들어 종양, 동맥 경화)에 의해 발생한 것이 아닌지 확신 할 수 있습니다.

이 프로토콜 presen해부 및 수막 섬유 아세포 문화의 유도에 대한 사후 인간의 leptomeninges의 준비 TS. 이 절차는 견고하고 높은 성공률을 갖는다. 뇌 조달은 일반적으로 무균 조건 하에서 수행되지 않는 문화의 문제는 불임이다. 따라서, 페니실린, 스트렙토 마이신 및 암포 테리 신 B의 칵테일 배양 배지를 보충하는 것이 중요

파킨슨 병 부검 확인 된 경우에서 수막 섬유 아 세포의 유도는 파킨슨 병의 체외 모델링을위한 기반을 제공합니다. 수막 섬유 아세포는 3~9일 샘플 준비 후 나타나는 약 20-30000000 세포 6-8 주 만에 동결 보존 할 수 있습니다. 수막 섬유 아세포 배양 균질하고 세포 피브로넥틴, 수막을 식별하기 위해 일반적으로 사용되는 마커를 표현한다.

서론

뇌경막, 지주막과 피아 이잖아요 : 수막은 뇌를 보호하는 세 개의 막으로 구성되어 있습니다. 최근에, 또한 수막 뇌 발달 ^한 뇌 항상성에 중요한 역할을한다는 것을 인식하고있다. 수막은 중간 엽 및 신경 능선 유래 세포로부터 유래하고 흥미로운 시험 관내 및 생체 내 ^{2, 3, 4에서의} 이식 후 뉴런을 야기 할 수있는 수막에 존재하는 전구 세포를 보였다. 들은 도파민 뉴런 ^(5)에 배아 줄기 세포의 분화를 위해 간질 세포 유래 유도부 활성을 갖는 수막으로 배양 성공적, 급전 층으로서 사용되어왔다. 또한 leptomeninges 직접 허혈성 조건 하에서 ⁶ 뉴런, 아스트로 사이트, 올리고 덴드로 사이트와로 분화 할 수있는 잠재력을 가지고있다.

이 프로토콜의 경우, 인간의 사후 수막 샘플을 총칭하여 지주막과 피아 이잖아요에서 수집 leptomeninges라고, 연구 목적으로 인간....

프로토콜

뇌 기증 등록을 기부하는 그들의 의도 등록자에 의한 설명서가 포함되어 있습니다. 법이 허용 조직 검색에 대한 부검 권한은 친척의 다음에 의해 제공됩니다. 수집 부검 표본을 사용하여 연구 연구는 건강 보험 양도 및 책임에 관한 법률 (HIPAA) 규정을 준수하기 위해 제도적 검토위원회 (IRB)에 의해 검토된다.

참고 : Leptomeninges 샘플은 뇌 해부 동안 뇌 해부학자 또는 신경 병리학에 의해 수집되고, 25 ~ 30 ML의 수막 성장 미디어를 포함하는 50 ML 원뿔 튜브에 저장됩니다. 샘플은 샘플 준비 될 때까지 4 ℃에서 저장된다. 세포의 생존 시간의 사후 감소로 처리가 가능한 한 빨리 수행되어야한다.

1 세트 업 Leptomeninges 해부를 시작하기 전에

참고 : - 1.3 바이오 안전성 캐비닛 내부에서 수행 할 수 있습니다 1.1 단계를 반복합니다.

1. 375 mL의 둘 베코 변형 이글 매체를 조합하여 수막 성장 배지를 준비 태아 소 혈청 100 ㎖, 5 ㎖의 10 mM 비 필수 아미노산, 5 ㎖의 200 mM의 L- 알라 닐 -L- 글루타민, 5 ㎖의 100 mM의 피루브산 나트륨 5 ㎖ 10,00....

결과

leptomeninges 처리 프로토콜이 성공하면이 뇌에 대한 사후 간격의 길이에 따라 달라질 수 있지만, 수막 섬유 아 세포의 생장는 3 구 일 절제술 후 관찰 처음이다. 그림 1은 네 개의 다른 기증자의 수막 섬유 아세포 문화를 보여줍니다. 도 1a는 10 시간 20 분 사후 간격으로 88 세 기증자에서 처리 후 조직 사일 주위에 유리 커버 슬립 (어두운 대각선)와 섬유 아세포 가지에 의해 아래로 개최 leptomeninges 조각을 보여줍니다. 도 1b는 70 세의 기증자 11 시간 45 분 사후 변화에서 스파 스 섬유 아세포 가지 일곱 일 후 처리를 보여줍니다. 그림 1C는 섬유 아세포 가지에게 88 세의 기증자와 24 시간 사후 간격에서 절개 후 십삼일을 보여줍니다. 그림 1D는 T75의 VESS에 계대 하였다.......

토론

이 프로토콜은 뇌 기증과 관련하여 수집 된 인간 사후의 leptomeninges에서 수막 섬유 아세포 문화를 유도하는 간단하고 강력한 프로토콜을 설명합니다. 사후 인간의 물질로 세포 배양을 유도하는 프로토콜의 거의 설명이 있습니다. 두 연구는 피부 유래 섬유 아세포를 배양 ^{7, 8, 9,} 한 연구는 경질 샘플 ^(10)을 설명 설명하고 다른 비 냉동 보관 냉동 경질 샘플 ^(11)을 설명합니다.

우리는 냉동 보존 전에 충분한 부산물 및 확장을 보장하기 위해 각 웰에 2-3 조직 조각 (약 3mm × 3 ㎜) 두 개의 6 웰 플레이트를 준비합니다. 수막 조각 부드러운이 장소에 보유 할 수있는 조직 조각 위에 멸균 유리 커버 슬립을 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
코닝 페트리 접시	Fisher Scientific	351029
Nunc 6웰 플레이트	Fisher Scientific	14-832-11
15mm 커버 슬립	Fisher Scientific	12-545-83 15CIR-1D
메스, 멸균 블레이드, No. 15	Miltex	4-415
곡선형 정밀 팁 집게	Fisher Scientific	16-100-122
혈청학 피펫	Fisher Scientific	13-678-11E
파스퇴르 피	Fisher Scientific	22-230490
젤라틴	시그마	G1890-100G
인산염 완충액 식염	Fisher Scientific	SH30264.02
Corning 500 mL 필터 유닛	Fisher Scientific	430770	매체 성분 및 결합 필터.
Nunc 세포 배양 처리 플라스크, 필터 캡, T175 cm2	Thermo Scientific	178883
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
>Growth Media
Hyclone DMEM	Fisher Scientific	SH30081.02
Hyclone FBS	Fisher Scientific	SH30910.03
MEM 비필수 아미노산 용액(100x)	Thermo Fisher	11140-050
GlutaMAX 보충제(100x)	Thermo Fisher	35050-061
피루브산나트륨(100mM)	Thermo Fisher	11360-070
페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)	Thermo Fisher	15140-122
암포테리신 B (황색 용액/250 &마이크로; g/mL)Fisher	Scientific	BP264520
Bambanker Freeze 120 mL	Fisher Scientific	NC9582225
Name	Company	카탈로그 번호<	strong>Comments
Fibronectin Staining
8 웰 챔버 슬라이드	Fisher Scientific	1256518
20% 파라포름알데히드	전자 현미경 과학	15713
Triton X-100	Sigma	T8787
100% 글리세롤	BioRad	9455
100% 일반 염소 혈청	Fisher Scientific	101098-382
Anti-Fibronectin 항체 [F1]	Abcam	ab32419	1:300 차단 용액
희석 Anti-SERPINH1	Sigma	S5950-200ul	1:250 차단 용액 희석
Anti-SOX2	Millipore	MAB4343	1:100 차단 용액
Anti-Nestin	Millipore	MAB5326	1:200 희석 차단 용액
Anti-TUJ1	Covance	MMS-435P	1:1,000 차단 용액
희석 Alexa Fluor 488 anti-rabbit	Thermo Fisher	A11029	1:400 차단 용액 희석; (녹색 채널; Ex/Em2 495/519 nm)
Alexa Fluor 555 안티 마우스	Thermo Fisher	A21424	1:400 차단 용액 희석액; (빨간색 채널; Ex/Em2 590/617 nm)
Hoechst 33342 stain	Thermo Fisher	H3570	1.0 &mu의 최종 농도로 희석합니다. g/mL; (블루 채널; Ex/Em2 358/461 nm)
공급업체는 제안이며 대체 공급업체의 유사한 제품도 사용할 수 있습니다.

펫 수 은